本文通过构建分子嵌合骨髓造血干细胞(bone marrow hematopoietic stem cells,BHSCs)及前体T(pre-T)细胞,探讨输注分子嵌合细胞后,受体对异基因供体来源T细胞刺激的反应能力的影响.依据GenBank中C57 BL/6小鼠MHC Ⅰ等位基因H-2Db和H-2Kb序列,构建重组质粒pIRES-H-2Db和pIRES-H-2Kb.BALB/c小鼠BHSCs和pre-T细胞培养,无菌条件取股骨、胫骨,收集骨髓细胞.
作者：付蔚华；阎永嘉；易小龙；宋东旭；王振；李卫东 刊期： 2012年第12期
目的 序列分析及确认一例中国人群中的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)新等位基因.方法 应用基于Luminex平台的聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)基因分型法、PCR产物测序法和组特异性引物测序法,通过软件分析该样本DNA基因序列及与相近HLA等位基因序列的差异.结果 PCR-SSOP结果显示该样本HLA-A基因座的反应格局与已知HLA-A等位基因均不一致；DNA序列分析显示,在所检测的第2～4外显子中,该样本HLA-A基因座序列与所有已知HLA-A等位基因序列均不一致,与同源性高的等位基因A*31∶01∶02的差异只在外显子2区域中产生了nt 245 A—C一个碱基取代,并导致相应的82位密码子由GAG→GCG,编码的氨基酸由谷氨酸(Glu)变为丙氨酸(Ala).结论 该基因为HLA新等位基因,被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*31∶22.
作者：戚新；李归冀；章旭；张坤莲；李晓丰 刊期： 2012年第12期
目的 观察高糖状态下热灭活金黄色葡萄球菌(HKSA)诱导的人单核细胞株THP-1凋亡特点,以及表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白细胞介素(IL)-1β mRNA和IL-1β蛋白分泌规律.方法 体外培养THP-1单核细胞,分别以5.5 mmol/L葡萄糖(LG)和25.0 mmol/L葡萄糖(HG)培养12h～8d.将HG和LG培养6d的单核细胞加入HKSA.分别于HKSA加入前和加入后2～48 h提取单核细胞,检测细胞凋亡、IL-1β蛋白、iNOS和IL-1β mRNA表达.细胞凋亡采用Annexin V与PI双染法,流式细胞技术检测；IL-1β蛋白分泌采用ELISA法检测；提取细胞总RNA,反转录生成cDNA后采用实时定量逆转录聚合酶链反应(real-time quantitative PCR)法,检测iNOS和IL-1β mRNA表达情况.结果 (1)高糖刺激THP-1单核细胞12 ～48 h后IL-1β蛋白、iNOS和IL-1β mRNA表达较刺激前显著增加(P＜0.05),iNOS和IL-1β mRNA表达在24 h达高值,IL-1β蛋白分泌48 h达高峰.细胞凋亡在高糖刺激48 h～4 d较刺激前显著增加(P＜0.05).(2)两组细胞加入HKSA后6～48 h表达iNOS和L-1β显著高于刺激前(P＜0.01),24h达高峰,48 h表达下降；IL-1β蛋白分泌在48 h达高值.两组细胞凋亡率在加入HKSA后12h、24h、48 h逐渐增加(P＜0.01).单核细胞加入HKSA前和加入HKSA后12h,高糖组与低糖组比较,高糖组IL-1β蛋白、iNOS和IL-1β mRNA表达均低于低糖组,凋亡率高于低糖组(P＜0.05).结论 高糖和HKSA对单核细胞分泌IL-1β蛋白、表达iNOS和IL-1β mRNA的影响与刺激时间有关；单核细胞处于持续高糖状态时,高糖可以增加细胞凋亡率,降低IL-1β蛋白分泌、iNOS和IL-1β表达.
作者：陈樱；张岩；宋欣；孙培；常柏；李海东；孟东；李巧芬 刊期： 2012年第12期
目的 研究抑制产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌(E.coli)耐药基因CTX-M表达的反义寡核苷酸(AS-ODNs)对其耐药性的影响.方法 用脂质体包裹AS-ODNs W086后导入目的细菌B052,通过平板克隆形成实验计数菌落数(CFU)；微量法测定细菌生长曲线；通过RT-PCR法检测B052耐药基因CTX-M的表达变化,用液体稀释法检测W086对B052小抑菌浓度(MIC)影响.结果 AS-ODNs W086明显抑制B052的生长,W086各剂量组B052的CFU与空白对照组比较明显减少(P＜0.05),且具有浓度依赖性抑制效应,而单纯脂质体组、单纯W086组及对照链组与空白对照组无明显差异；W086能显著抑制B052 CTX-M的表达.结论 AS-ODNs能特异高效地与CTX-MmRNA结合并阻断其表达,有效逆转了B052的多重耐药性；AS-ODNs为解决细菌耐药问题提供了一个新的研究策略.
作者：张劲丰；吴英；苏荣 刊期： 2012年第12期
目的 了解大肠杆菌O157∶H7 FNR(fumarate nitrate reduction,富马酸硝酸盐还原)对三型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)表达的影响.方法 本研究采用λRed重组技术,利用PCR产物,通过Bet(a ssDNA annealing protein,ssDNA退火蛋白)和Exo(a5'→3'dsDNA exonuclease,5 '→3' dsDNA外切酶)蛋白促进同位交换的方法,成功构建了fnr突变株.结果 虽然细胞黏附结果显示,与野生株相比,缺失株的黏附力并没有明显下降.但是T3SS的蛋白图谱显示fnr突变株中蛋白分泌量有明显下降.结论 推测可能是fnr基因敲除后导致高浓度的ClpXP(caseinolytic protease X&P,酪蛋白水解酶X&P)引起GrlA(global regulator of LEE activator)蛋白的降解,从而导致LEE(locus of enterocyte effacement)表达的下降,造成T3SS蛋白分泌量的下降.
作者：徐雪芳；阎泽军；熊衍文；徐建国 刊期： 2012年第12期
目的 探讨luxS基因缺失对变异链球菌氧化应激的影响及可能机制.方法 变异链球菌标准株和luxS基因缺陷株培养至对数中期分成3组,一组作为对照组在普通乳酪消化胨酵母(TPY)培养液中生长,另两组作为实验组,其中一组加入过氧化氢终浓度58.8 mmol/L的TPY培养液中,另一组加入含有铁螯合剂2,2'-联吡啶的过氧化氢终浓度为58.8 mmol/L的TPY培养液中.分别在厌氧培养的0.5、1、2h取菌液采用平板活菌计数法测定活菌数,计算生存率,统计学分析.结果 和对照组相比,实验组中luxS基因缺陷株的生存率在所测定的时间点均高于标准株(P＜0.05)；与不含铁螯合剂的实验组相比,铁螯合剂的加入并未提高菌株的过氧化氢耐受力(P＞0.05).结论 luxS基因参与变异链球菌氧化应激耐受的调节；该氧化应激耐受并不是通过避免芬顿反应(Fenton reaction)毒性作用实现的.
作者：于丹妮；张娅；赵巍；李娜；韩育植 刊期： 2012年第12期
目的 对经API细菌鉴定条所证实的眼源性蜡样芽孢杆菌进行溶血素BL(HBL)基因鉴定并进行体外毒理性试验.方法 根据溶血素结合亚基B、2个溶血亚基L1、L2三种组分的基因核苷酸序列,设计合成3对特异性引物,通过体系和条件优化,建立PCR检测方法,并对5株临床分离的眼源性蜡样芽孢杆菌进行检测分析；随机选取其中1株菌,利用盐析法提取溶血素,并以不同浓度剂量作用于绵羊红细胞、Vero细胞和Hela细胞,监测其对细胞的毒性；通过腹腔注射观察HBL对小鼠的致死作用,评估其毒力的强弱.结果 5株临床分离菌中,共检出3个基因；蜡样芽孢杆菌溶血素BL蛋白具有较强溶血活性,其溶血活性呈明显的时间-剂量依赖性；BL溶血素对Vero细胞和Hela细胞的作用所致的形态变化虽有不同,但结果均导致细胞死亡,其内容物释出；对小鼠的致死率同样存在时间-剂量依赖性,且2.0 HU/ml浓度以上的BL溶血素可使小鼠48 h的致死率达100％.结论 HBL具有较强的溶血活性,对临床分离的眼源性蜡样芽孢杆菌BL基因进行检测,3个基因均表达,为该菌感染后病情发展迅速、预后较差的临床表现提供了理论依据,同时为该病的快速诊断和分子流行病学调查提供了新的方法.
作者：郑美琴；毛丽萍；钟毓红；潘娌妮；李亚利；楼永良 刊期： 2012年第12期
目的 探讨病毒感染过程中,JNK1对杀伤性T细胞应答的调节作用.方法 通过皮下途径对JNK1基因敲除小鼠(JNK1-/-)给予鼠痘病毒(ECTV)感染,对其存活情况、靶器官(肝、脾)病毒增殖情况进行观察和检测,并与野生型(WT)小鼠进行比较；采用流式细胞技术,检测感染后不同时间点野生型(WT)小鼠和JNK1-/-小鼠脾脏和淋巴结中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的变化及效应；采用ELISA方法,检测感染后WT和JNK1-/-小鼠脾脏淋巴细胞IFN-γ和IL-4的产生情况.结果 JNK1基因敲除后,小鼠对ECTV的抵抗和清除能力明显下降,表现为总体病死率增加,靶器官内病毒滴度显著增高；较之WT小鼠,JNK1-/-小鼠感染后CTL增殖能力明显降低的同时,伴随着产生IFN-γ能力的下降.结论 JNK1信号在ECTV感染中,对机体的抗病毒免疫应答,包括CTL的增殖和效应,可能起到重要的调节作用.
作者：王永芹；赵利美；徐擎昱；王鹏鹏；汪洋 刊期： 2012年第12期
目的 分析2011年江苏省乙型流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的分子流行特征.方法 选择13株2011年江苏省不同地区、不同流行时间的乙型流感毒株进行全基因组测序,通过生物信息学方法对HA、NA分子流行特征进行分析.结果 13株乙型流感毒株中,10株属于Victoria系,3株属于Yamagata系.10株Victoria系毒株的NA基因来源于Yamagata系病毒,是基因重配流行株.与疫苗株相比,10株Victoria系毒株和3株Yamagata系毒株的HA蛋白分别在197和196位增加一个糖基化位点.结论 2011年江苏省乙型流感Victoria系和Yamagata系病毒同时流行,其中重配的Victoria系病毒占优势.
作者：李伟；罗鹏飞；邓斐；秦圆方；资海荣；汤奋扬；祁贤；卫平民 刊期： 2012年第12期
目的 构建一个易检测且灵敏度高的丙型肝炎病毒(HCV)细胞感染模型,为HCV致病机制的研究和抗病毒药物的筛选提供一个有效的体外细胞培养体系.方法 利用重组PCR技术在HCV的非结构蛋白NS5A的C端引入优势突变点V2440L,然后在其RsrⅡ酶切位点插入增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因,基因测序及酶切鉴定重组基因序列构建成功后,体外转录获得RNA,然后转染入肝癌细胞系Huh7.5,用Western blot检测EGFP与NS5A融合蛋白,用细胞免疫荧光(IFA)检测病毒复制水平和EGFP表达情况.用RT-PCR检测转染细胞培养液不同时间点的HCV RNA水平.用IFN-α鉴定该系统用于抗丙型肝炎药物筛选的可行性.结果 在重组病毒JFH1-2440-EGFP RNA转染的细胞内可检测到EGFP的表达,EGFP表达水平与病毒复制水平一致.转染细胞的培养上清液能感染新的Huh7.5细胞,IFA结果显示转染后第9天培养上清液的病毒滴度为104 FFU/ml,提示JFH1-2440-EGFP RNA转染的细胞能释放有传染性的HCV病毒颗粒.RT-PCR检测结果显示转染细胞上清液中的HCV RNA在转染72 h后可达到3.06×105拷贝/ml,第9天可达到7.96×106拷贝/ml.EGFP的表达呈干扰素浓度依赖性.结论 构建的重组病毒HCVJFH1-2440-EGFP体外细胞培养系统具有经济、快速、敏感等优点,为HCV致病机制的研究和抗病毒药物的筛选提供了一个有效的工具.
作者：徐洪涛；肖丽；咸建春；陈亚宝 刊期： 2012年第12期
目的 构建狂犬病病毒糖蛋白基因DNA真核表达质粒,并检测其免疫原性.方法 用RT-PCR法扩增和分离CTN株狂犬病病毒糖蛋白基因,测序后克隆至pcDNA5.0载体,构建重组质粒pcDNA5.0-G,提取质粒,转化293T细胞,检测糖蛋白瞬时表达,并以该重组质粒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,狂犬病病毒CVS株攻击,观察小鼠存活情况.结果 酶切、测序结果显示重组质粒pcDNA5.0-G构建成功,瞬时表达结果显示糖蛋白获得大量表达.经肌肉注射质粒常规免疫小鼠,病毒攻击后小鼠保护率为73.3％,对照组为6.7％.结论 所构建狂犬病病毒糖蛋白真核表达质粒pcDNA5.0-G经肌肉注射免疫后可有效保护小鼠免受狂犬病病毒攻击,具有良好的免疫原性,这为后期核酸疫苗的研发奠定基础.
作者：王云鹏；曹守春；李加；刘景华；石磊泰；李玉华；董关木 刊期： 2012年第12期
目的 探讨胞外的高迁移率组蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)对人T淋巴细胞白血病病毒1型(human T-cell leuk HTLV-1)感染的T细胞中病毒复制的影响.方法 ELISA检测HTLV-1病毒阴性T细胞系Jurkat、MOLT4细胞及HTLV-1病毒阳性的T细胞系MT2、MT4细胞培养上清中的HMGB1水平；将HTLV-1的长末端重复序列荧光素酶报告基因pHTLV-1-LTR-luc转染病毒阳性细胞MT2,随后加入终浓度为0.25、0.50、0.75 μg/ml的HMGB1多克隆抗体(PcAb)及其同型对照抗体,30、100、300 ng/ml的重组人HMGB1蛋白(rhHMGB1)及其对照PBS,48 h后检测荧光素酶活性；在病毒阳性细胞MT2中加入终浓度为0.25μg/ml的HMGB1 PcAb及同型对照抗体,300ng/ml的rhHMGB1及对照PBS,real-time PCR检测病毒编码基因tax、pol1、pol2、p19、gag、env.结果 HTLV-1病毒阴性T细胞系和HTLV-1病毒阳性细胞系培养上清中的HMGB1水平无明显差异；0.25μg/ml的HMGB1 PcAb可明显抑制HTLV-1-LTR的转录活性,而300 ng/ml的rhHMGB1可明显促进HTLV-1-LTR的转录活性；real-time PCR检测显示0.25 μg/ml的HMGB1 PcAb可明显抑制病毒编码基因pol1、pol2、gag、env的表达,300 ng/ml的rhHMGB1可明显促进pol1、pol2、gag、env的表达.结论 胞外的HMGB1可促进HTLV-1病毒感染T细胞的病毒复制.
作者：王霞；牛志国；高彩；孙启蒙；王金恒；宋向凤；高志涛；韩静贤；王辉 刊期： 2012年第12期
目的 探讨抗脑垂体抗体(APAs)与脑外伤后垂体功能减退及脑损伤程度的关系.方法 将73例脑外伤后9 ～12个月且垂体激素均有不同程度下降的患者按入院时格拉斯哥昏迷指数(GCS)评分分成A(3 ～8)、B(9 ～12)、C(13 ～ 15)3组,分别测定其血液中垂体激素[生长激素(GH)、总睾酮(TT)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、促卵泡刺激素(FSH)/黄体生成素(LH)]和APAs水平.激素采用化学发光法测定,APAs采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测.结果 A组的APAs水平显著高于B、C组(P＜0.001),而B、C组间差异无统计学意义(P＞0.05)；A组所测激素的水平均显著低于B、C组(P＜0.001),而B、C组间差异无统计学意义(p＞0.05).统计显示,患者APAs水平与GH水平呈负相关(r=-0.64071,P＜0.001),与GCS评分亦呈负相关(r=-0.50132,P＜0.001).结论 APAs的产生与脑外伤有关,损伤程度与APAs水平成正相关,与GH等垂体激素水平成负相关.结果 表明通过测定APAs水平可以推测脑外伤后期脑垂体功能下降的概率和程度.
作者：张名均；曹冠柏；冯铃；胡巧铃；王德树；吴俊；陈文浩 刊期： 2012年第12期
目的 通过观察膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)患者肺功能参数、B、T淋巴细胞衰减因子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)及血清细胞因子的变化情况,探讨KOA患者肺功能变化的可能分子机制.方法 选取2011年10月-2012年7月安徽中医学院第一附属医院风湿病科收治的住院、门诊患者47例.应用肺功能仪检测患者肺功能指标；流式细胞术检测BTLA；ELISA法检测白介素(interleukin,IL)-1β、IL-10、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制物-1(tissue inhibitor of matrix metalloprotease-1,TIMP-1)；魏氏法测定血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)；日立7060型全自动生化分析仪进行测定超敏C反应蛋白(high-sensitivityC-reactive protein,hs-CRP).结果 (1)与正常组比较,KOA患者用力肺活量(forced vital capacity,FVC)、一秒用力呼气容积(forced expiratory volume in 1 second,FEV1)、FEV1/FVC、用力大呼气流量(peak expiratory flow,PEF)、大呼气中段流量(maximal mid-expiratory flow,MEF25-75)、用力呼气50％流量(Maximal mid-expiratory flow velocity in pulmonary vital capacity 50％,MEF50)、用力呼气25％流量(maximal mid-expiratory flow velocity in pulmonary vital capacity 25％,MEF25)、CD3+ BTLA+T细胞、CD4+BTLA+T细胞、IL-10、TIMP1明显降低,IL-1β、MMP9明显升高.(2)相关性分析显示,FVC与Lequesne MG、症状分级量化总分、病程、MMP9呈负相关,与CD3+ BTLA+T细胞、IL-10、TIMP1呈正相关；FEV1与CD3+ BTLA+T细胞、CD4+BTLA+T细胞、TIMP1呈正相关,与病程呈负相关；MEF50与CD3+ BTLA+T细胞、CD4+ BTLA+T细胞呈正相关.结论 KOA患者在发生关节软骨病变的同时,伴有肺功能的下降.其机制可能与BTLA表达水平下降,IL-1β、MMP9明显升高,IL-10、TIMP1明显降低,诱发异常免疫应答,从而介导气道损伤,导致KOA患者肺功能下降有关.
作者：程园园；刘健；万磊；冯云霞；刘磊；汪元 刊期： 2012年第12期
目的 探讨肿瘤坏死因子(TNF-α)对人肾小球系膜细胞(HMCs) IP3R1蛋白和mRNA表达的影响及PKC在此信号通路中的作用,以期为肝肾综合征(HRS)肾小球滤过率下降的发生机制提供理论依据.方法 用实时定量PCR和免疫印迹检测IP3R1 mRNA和蛋白表达的情况,并分别用蛋白激酶C(PKC)激动剂PMA、PKCα、PKCδ特异性抑制剂及HA-DN-PKCα质粒转染干预上述诱导实验检测IP3 R1的表达变化.此外,免疫印迹检测TNF-α对p-PKCα蛋白的表达影响.结果 TNF-α明显上调IP3 R1蛋白和mRNA表达.PMA、PKCα抑制剂Safingol和HA-DN-PKCα质粒瞬时转染预处理HMCs后,均能明显阻断TNF-α诱导IP3 R1蛋白的表达,而PKCδ抑制剂Rottlerin预处理后,对IP3 R1蛋白表达无明显影响.此外,TNF-α刺激HMCs,各不同时间组总PKCα蛋白表达无明显差异,而TNF-α刺激8 h p-PKCα蛋白表达明显增加.结论 TNF-α能上调人系膜细胞IP3 R1蛋白及mRNA的表达,TNF-α活化PKCα是TNF-α上调IP3 R1表达的重要上游信号.
作者：王育蓉；孙辉；章欢；刘沛 刊期： 2012年第12期
