杨俊艳；王旎；刘智敏；董超然；刘小花
目的 采用细胞工厂替代转瓶培养Sabin株脊髓灰质炎病毒,制备脊髓灰质炎减毒活疫苗.方法 用细胞工厂和15L转瓶分别培养人二倍体细胞(2BS),扩增至36代后,分别接种0.20 MOI的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎工作代毒种,待细胞病变达100％时收获病毒液,加入保护剂(4.5 mol/L氯化镁溶液),制备单价疫苗,分别将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个型别的单价疫苗按照病毒数10∶1∶6的比例混匀,制备成三价疫苗半成品,分装入1 ml西林瓶中(每瓶为10人份剂量),即为疫苗成品.采用微量滴定法测定疫苗原液及成品的病毒滴度,同时进行其他各项检定,并考察疫苗成品的稳定性.结果 采用相同的感染复数接种病毒,细胞工厂制备的3个型别疫苗原液的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗原液,Ⅰ型平均滴度高0.17 log10CCID50／ml,Ⅱ型平均滴度高0.33 log10 CCID50／ml,Ⅲ型平均滴度高0.27 log10CCID50／ml;细胞工厂制备的疫苗成品3个型别的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗,三价疫苗的平均滴度均高于6.24 log10CCID50／ml,符合国内外标准;疫苗原液及疫苗成品的其他各项检定均合格;细胞工厂制备的3批疫苗成品于37 C放置2d,疫苗的总病毒含量不低于6.24 log10CCID50／0.1 ml,且病毒滴度下降未超过0.5 log10 CCID50/0.1 ml,于2～8℃放置9个月,疫苗的总病毒含量仍不低于6.24 log10CCID50／0.1 ml,均符合WHO的标准要求.结论 利用细胞工厂替代转瓶培养2BS细胞制备脊髓灰质炎减毒活疫苗,可获得高于转瓶培养3个型别疫苗的滴度,且工艺稳定,质量可控,可用于规模化脊髓灰质炎减毒活疫苗的生产.
作者：王红燕；张晋；金歌；佟丁丁；沈莉；郑小滨；柯伟华 刊期： 2014年第04期
目的 原核表达科尔沁牛中性粒细胞防御素5(bovine neutrophil 1β-defensin 5,BNBD5),并进行纯化.方法 用Trizol试剂提取牛外周血中性粒细胞总RNA,RT-PCR法扩增BNBD5的cDNA序列,与pMD18-T载体连接,构建重组克隆质粒pMD18-T-BNBD5,并进行测序,应用DNA Star生物分析软件对科尔沁牛BNBD5与其他物种(绵羊、山羊、驯鹿、家鼠、人类、鳜鱼、中华蜜蜂)B防御素的核苷酸序列进行同源性比较及进化树分析;对科尔沁牛与其他品种牛(新疆荷斯坦牛、印度水牛、荷兰弗里斯兰牛)B防御素的BNBD5核苷酸序列进行进行同源性比较及进化树分析;将构建正确的重组克隆质粒pMD 18-T-BNBD5亚克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒pET-30a-BNBD5,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达后,利用Ni离子亲和柱纯化,SDS-PAGE鉴定表达产物和纯化产物.结果 通过PCR扩增获得了195 bp的BNBD5全长cDNA序列,为一个完整的开放阅读框(ORF),与GenBank中登录的BNBD5编码区序列(AJ278799)相似性达93.4％,推导该序列编码45个氨基酸残基,并含有防御素的特征性分子结构,即在特定位置上有6个保守的半胱氨酸残基;共有13处碱基出现突变,导致其推导的氨基酸序列出现8处变异,但6个保守型半胱氨酸位点均未出现变异.与其他物种的BNBD5核苷酸序列同源性分析表明,科尔沁牛与山羊、绵羊同源性高,达80％以上;与中华蜜蜂同源性低,在10％以下.与其他品种牛的BNBD5核苷酸序列同源性分析表明,科尔沁牛与新疆荷斯坦牛同源性高,达90％以上;与荷兰弗里斯牛的同源性低,约66％.质粒pET-30a-BNBD5经PCR及单双酶切鉴定证明构建正确,表达及纯化蛋白相对分子质量约10 000,主要以可溶性形式表达,表达量占菌体总蛋白的25.1％,纯化产物含量达2.15 mg/ml.结论 成功表达并纯化了科尔沁牛BNBD5.
作者：锡林高娃；陈鹏；乌日汗；吴金花；布日额 刊期： 2014年第04期
目的 对吉林省汉坦病毒(Hantavirus,HV)宿主动物携带病毒进行遗传进化分析.方法 采集吉林省不同地区鼠肺样品,应用间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定出HV感染的阳性样本,利用Trizol试剂提取病毒RNA,RT-PCR法扩增阳性样本中M和S片段基因,并进行测序,应用DNASTAR软件对M和S片段基因的核苷酸同源性进行分析,并与汉城病毒(Seoul virus,SEOV)参考株进行比较;利用MegAligh软件进行蛋白序列中氨基酸差异性分析;利用MEGA 5.0软件进行系统发生分析.结果 共捕获719只啮齿动物,其中褐家鼠(R.norvegicus)555只,黑线姬鼠(A.agrarius)74只,小家鼠(M.musculus)90只,HV抗原阳性率为1.39％(10/719);10份阳性样本中,7份来自褐家鼠,2份来自小家鼠,1份来自黑线姬鼠.用全长S引物扩增得到的10株病毒全长S基因片段,经同源性分析比较发现,各序列间的核苷酸同源性在92.8％～95.1％之间,与其他SEOV核苷酸同源性在90.2％～94.7％之间;用M引物扩增得到的部分基因片段,经同源性分析比较发现,各序列间的核苷酸同源性在96.5％～99.5％之间,而与其他SEOV核苷酸同源性在91.5％ ～ 97.7％之间;10株病毒全部属于SEOV.黑线姬鼠G蛋白365 ～ 769位点间有5个氨基酸差异位点(V494L、C546S、Y626C、M630L和V637I),小家鼠G蛋白365～769位点间主要有5个氨基酸差异位点(C378G/R、F420L、Q436P/R、E535G／A和C589G/W),但同种间在378、436、535和589位点也有差异;黑线姬鼠N蛋白l ～ 430位点间存在P298L变异;小家鼠N蛋白变异位点较多,主要在M24K／N、A37D、I140M、M173K、D192E、L219V、P229A、D237E、H265Y、V284L、T333S、A389G和V425E变异.分离得到的10株病毒根据不同的来源地可分为两个不同的进化分支.结论 研究表明吉林省宿主动物携带的HV仍以SEOV为主,其遗传进化呈现多样性.
作者：范胜涛；高晓龙；李元果；应瑛；国娇；张钊伟；刘红；吴静；杨松涛 刊期： 2014年第04期
目的 探讨甲磺酸去铁胺(deferoxamine,DFO)佐剂对甲型肝炎病毒(hepatitis A virus antigen,HAV)抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响.方法 将不同剂量的DFO(0.6、1、4、8 mg)佐剂分别与HAV抗原18 EU混合,免疫ICR小鼠,并设生理盐水对照组(生理盐水200μl)、HAV抗原对照组(HAV 18 EU)、铝佐剂对照组(铝佐剂300 μg+HAV抗原18 EU)和复合佐剂组(HAV抗原18EU+DFO1 mg+铝佐剂150 μg),均经腹部皮下多点注射,0.2 ml/只,共免疫1次.分别于免疫后第4、8、12、16周,采用间接ELISA法检测小鼠血清中抗-HAV IgG水平,并进行安全性试验.结果 除生理盐水对照组外,其他各组小鼠血清在各时间点均能检测到抗-HAV IgG;除DFO 0.6 mg组外,抗体滴度均在第8周达峰值;不同剂量DFO组的抗体水平均明显高于HAV抗原对照组,其中DFO 4 mg和8 mg组在8～ 16周时抗体水平显著高于HAV抗原对照组,且差异有统计学意义(P＜0.05),但与铝佐剂对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05);在8～ 16周时,同一时间DFO 4 mg、DFO 8 mg和复合佐剂组的抗体水平较高,并能维持较长时间,至第16周时仍能达到与铝佐剂对照组相当的水平.结论 DFO佐剂能显著增强HAV抗原诱导小鼠的体液免疫应答,有望开发为一种可替代铝佐剂的新型佐剂.
作者：罗婷；李虹娟；王霄；段志青；李萍；王海漩；胡凝珠；胡云章 刊期： 2014年第04期
目的 评价非限制性核酸内切酶对狂犬病疫苗中Vero细胞DNA的去除效果.方法 将不同终浓度的Benzonase 非限制性核酸内切酶加入狂犬病病毒收获液中,在PBS或Tris两种缓冲体系下,以不同温度酶解不同时间,经分子筛层析纯化后,采用罗氏Ⅱ型高效地高辛DNA标记和检测试剂盒检测狂犬病病毒收获液中DNA的残留量,用确定的酶处理条件,采用酶检测试剂盒检测狂犬病病毒收获液中非限制性核酸内切酶的残留量,采用ELASA法检测抗原含量.结果 非限制性核酸内切酶的处理浓度为50 ～ 90 U／ml,缓冲体系为PBS或Tris,经37℃处理2～3h,转入18 ～ 26℃处理12～18 h酶解,再经分子筛层析纯化后,狂犬病病毒收获液中的Vero细胞DNA去除率在80％以上,病毒抗原回收率在75％以上;用确定的酶处理条件处理狂犬病病毒收获液,可使狂犬病病毒与Benzonase非限制性核酸内切酶完全分离.结论 采用非限制性核酸内切酶可有效去除狂犬病疫苗中Vero细胞残留DNA.
作者：崔燕平；何荣；戚凤春；何晓燕；陈坤；任国辉；汤峰；徐琳；周佳丽 刊期： 2014年第04期
目的 比较用于乙型肝炎疫苗的3种寡聚脱氧核苷酸(CpG-oligodeoxynueleotide,CpG ODN)佐剂体外的免疫活性.方法 分别将CpG ODN 684(沃森公司)、CpG ODN 1018(Dynavax公司)和CpG ODN 7909(Coley公司)序列体外刺激免疫人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)和人树突状细胞系GEN,采用氚-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法检测人PBMC增殖活力,ELISA法检测GEN细胞中IL-6和IFNα水平.结果 CpG ODN 7909、CpG ODN 1018和CpG ODN 684诱导人PBMC的增殖水平明显高于未刺激的对照组,差异有统计学意义(P＜0.000 1),其中CpG ODN 684和CpG ODN 7909序列诱导人PBMC的增殖水平相似,略高于CpG ODN 1018序列;3种CpG ODN在体外对免疫细胞均具有明显的活化作用,其中CpG ODN 684和CpG ODN 7909序列体外活化免疫细胞产生的IL-6和IFNα水平相似,但高于CpG ODN 1018序列.结论 沃森公司CpG ODN 684序列体外活化免疫细胞功能与Coley公司CpG ODN 7909序列相似,略优于Dynavax公司CpG ODN 1018序列.
作者：张梦霏；王丽丽；丁敏；李伟；周长征；徐娅妮；李镭；魏云林；杨喆 刊期： 2014年第04期
目的 原核表达旋毛虫与肝癌细胞相关基因CK-1,并进行鉴定.方法 以旋毛虫cDNA为模板,PCR扩增CK-1基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-CK-1,转化感受态大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG分别诱导表达3、4、5h,表达产物进行12％ SDS-PAGE分析.以纯化的旋毛虫肌幼虫免疫小鼠制备鼠抗旋毛虫肌幼虫阳性血清,以H7402细胞免疫小鼠制备鼠抗H7402全细胞蛋白阳性血清,以重组CK-1蛋白免疫小鼠制备鼠抗CK-1蛋白阳性血清,分别以其作为一抗,进行Western blot鉴定.结果 重组表达质粒pET-28a(+)-CK-1经双酶切及测序鉴定证明构建正确;IPTG佳诱导时间为4h,表达的重组CK-1蛋白以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的37.5％;重组CK-1蛋白可被鼠抗旋毛虫肌幼虫阳性血清和鼠抗H7402全细胞蛋白阳性血清识别,鼠抗CK-1蛋白阳性血清可识别旋毛虫肌幼虫蛋白和H7402全细胞蛋白,在相对分子质量38 500处均可见特异性条带,表明重组CK-1蛋白是一个交叉抗原,且具有良好的反应原性.结论 原核表达了旋毛虫CK-1基因,为进一步研究旋毛虫的抗肿瘤效应奠定了基础.
作者：左绍志；张桐嘉；常乐；杨滨僮；宫鹏涛；李建华；杨举；李赫；张国才 刊期： 2014年第04期
目的 利用磁珠分离法结合定量PCR技术,建立单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证及初步应用.方法 通过磁珠分离法提取样品中的残留DNA,再利用Taqman探针法对样品和标准DNA进行定量PCR测定,根据标准曲线对样品中的DNA残留量进行分析.对建立的方法进行种属特异性、准确性及精密性验证,并对5个厂家15批单克隆抗体类产品中的残留DNA进行测定.结果 该方法检测CHO细胞DNA残留的低准确定量浓度可达1×10-3 pg/μl,DNA含量在1×10-3 ～ 102 pg／μl范围内曲线线性良好,标准曲线的相关系数为0.994;该方法能特异性地检测CHO细胞DNA,对其他种属的DNA无扩增反应;该方法检测不同DNA加标量样品的DNA回收率相近,均值均在90％以上,3次测定的相对标准偏差均小于20％,92.6％加标样品的DNA回收率在70％～130％之间;该方法检测15批单克隆抗体类产品的DNA残留量均小于100 pg／剂量,符合《中国药典》三部(2010版)有关CHO细胞残余DNA的要求.结论 磁珠分离法可解决残留DNA检测中样品前处理的技术难点,定量PCR法能够简便、快速、准确地对不同工艺的单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留进行定量测定.
作者：王兰；李萌；郭玮；于传飞；高凯 刊期： 2014年第04期
目的 探讨人参多糖(ginseng polysaccharide,GPS)对人鼻咽癌细胞CNE-2裸鼠移植瘤的放疗增敏作用及可能的机制.方法 取对数生长期的鼻咽癌CNE-2细胞,经裸鼠背部皮下注射,1×107个／(0.2ml·只),待瘤体大径为4 ～6mm时,取20只模型裸鼠,随机分为4组:对照组(经腹腔注射生理盐水)、放疗组(每次每只裸鼠经肿瘤局部给予5GyX射线照射,每3d照射1次,共3次)、GPS组(经腹腔注射GPS,30 mg/kg,每次0.3ml,每72 h给药1次,共5次)和GPS联合放疗组(经腹腔注射GPS,30 mg／kg,每次0.3ml,每72 h给药1次,共5次;末次给药48 h后开始放疗,每只每次经肿瘤局部给予5 GyX射线照射,每3d照射1次,共3次).开始给药3周后处死裸鼠,取瘤体,称重,测量肿瘤的长、短径,计算肿瘤体积及抑制率;HE染色观察移植瘤组织病理学改变;Real-time PCR检测移植瘤组织中β-catenin基因mRNA的转录水平;免疫组织化学和Westem blot法检测移植瘤组织中β-catenin蛋白的表达水平.结果 与对照组相比,GPS组、放疗组和GPS联合放疗组的肿瘤体积及瘤重均明显下降(P＜0.05),抑制率分别为29.87％、52.60％和74.68％;镜下观察可见,GPS联合放疗组细胞凋亡明显,多数细胞核完全溶解,细胞结构消失,坏死的肿瘤组织呈现均质红染表现;GPS联合放疗组移植瘤中β-catenin mRNA及蛋白的表达水平均显著下降(P均＜0.05).结论 GPS可抑制CNE-2细胞在裸鼠体内的生长,且对鼻咽癌的放疗具有增敏作用,其机制可能与抑制β-catenin的表达有关.
作者：范家铭；李静；姜蓉；王亚平；李春莉；黄江菊 刊期： 2014年第04期
治疗性单克隆抗体的市场需求日益增长,因此如何分离得到高产的稳定表达细胞株及缩短研发过程成为此类研究的热点.在整个治疗性单克隆抗体的研发过程中,哺乳动物细胞表达载体的设计及其优化作为第一步就显得尤为重要.本文从基因转录水平的作用元件、作用方式、基因扩增与筛选标签及位置效应与整合位点的优化对治疗性单克隆抗体表达载体的设计与优化策略作一综述.
作者：安晨 刊期： 2014年第04期
目的 探讨低氧诱导因子-1α (hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)对人甲状腺未分化癌FRO细胞侵袭转移的影响,并探讨其分子机制.方法 用5％O2的低氧培养箱培养FRO细胞不同时间(0、2、4、8、12 h),倒置显微镜下观察细胞形态的变化,Western blot法检测细胞中上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)相关蛋白HIF-1α、Snail、E-cadherin、Vimentin、MMP2的表达;另设FRO细胞常氧组、HIF-1α特异性抑制剂3-(5'-羟甲基-2'-呋喃基)-1-苯甲基吲哚(YC-1)+常氧组、YC-1+低氧组、常氧+HIF-1α激活剂氯化钴(CoCl2)组,采用Westem blot法检测各组细胞中HIF-1α和EMT相关蛋白的表达,Transwell侵袭和迁移试验检测各组细胞的侵袭和迁移能力.结果 随着低氧培养时间的延长,FRO细胞逐渐发生间质样改变,低氧12 hHIF-1α、Snail、Vimentin、MMP2蛋白的表达量较0h显著升高(P＜0.01),上皮细胞特征性蛋白E-cadherin的表达持续降低(P＜0.01).YC-1+低氧组与低氧组比较,HIF-1α、Snail、Vimentin、MMP2蛋白的表达量显著降低(P＜0.01),E-cadherin蛋白的表达量显著升高(P＜0.05).低氧组和常氧+ CoCl2组与常氧组比较,HIF-1α蛋白的表达量显著升高(P＜0.01);常氧+CoCl2组与常氧组比较,Snail、Vimentin、MMP2蛋白的表达量显著升高(P＜0.01),E-cadherin蛋白的表达量显著降低(P＜0.01);常氧+CoCl2组与低氧组比较,HIF-1α、Snail、Vimentin蛋白的表达量显著升高(P＜0.01),E-cadherin蛋白的表达量显著降低(P＜0.01),MMP2蛋白的表达量差异无统计学意义(P＞0.05).低氧组和常氧+ CoCl2组的穿膜细胞数和迁移细胞数均较常氧组显著增多(P＜0.01).结论 低氧使FRO细胞中HIF-1α高表达,HIF-1可上调Snail、Vimentin和MMP2的表达,下调E-cadherin 的表达,对FRO细胞的侵袭转移具有促进作用.
作者：杨俊艳；王旎；刘智敏；董超然；刘小花 刊期： 2014年第04期
目的 探讨慢性轻度不可预见性刺激(chronic unpredicted mild stress,CUMS)致大鼠抑郁行为的性差异与下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(hypothalamic-pituitary-adrenalaxis,HPA)功能和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)表达的相关性.方法 将60只SD大鼠(雌雄各半)经open-field法筛选后,随机分为雌性对照组(CF)、雄性对照组(CM)、雌性模型组(SF)及雄性模型组(SM),每组15只.CF和CM组5只／笼;SF组和SM组采用孤养及CUMS方式建立大鼠抑郁模型.通过高架迷宫和糖水消耗试验评价大鼠焦虑抑郁行为程度;放射免疫法检测大鼠血清中皮质酮(corticosterone,CORT)的含量;荧光定量PCR和Western blot法分别检测大鼠海马BDNF和下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropin-releasing factor,CRF) mRNA的转录水平和蛋白的表达水平.结果 与CF和CM组相比,SF和SM组大鼠糖水偏爱率、进入高架迷宫开臂次数、向下探究次数和在开臂停留时间均显著减少(P＜0.05),血清中CORT含量增高(P＜0.01),海马BDNF mRNA的转录水平和蛋白表达水平显著下降(P＜0.01),下丘脑CRFmRNA的转录水平和蛋白表达水平显著升高(P＜0.05);SM组大鼠糖水偏爱率、进入高架迷宫开臂和闭臂次数、直立及向下探究次数、中央区停留时间、血清中CORT含量及下丘脑CRF mRNA的转录水平和蛋白表达水平均显著低于SF组(P＜ 0.05),而在闭臂停留时间显著长于SF组(P＜0.05).结论 CUMS致大鼠焦虑抑郁行为的性别差异与HPA轴功能和BDNF表达有关,为进一步研究抑郁症的性别差异机制及寻找可能的防治措施提供了实验依据.
作者：秦丽娟；汪丽佳；刘丹；刘任；周岐新 刊期： 2014年第04期
目的 分离甲型副伤寒沙门菌(副甲菌)噬菌体(副甲噬菌体),并分析其生物学特性.方法 从昆明某医院污水中分离副甲噬菌体,并采用噬斑形成法检测其滴度;透射电镜下观察浓缩纯化后的副甲噬菌体形态;分析副甲噬菌体对不同pH(1 ～ 12)和不同温度(40、50、60、70、80℃)作用的敏感性;培养副甲菌和副甲噬菌体,以不同培养时间为横坐标,对应的噬菌体滴度为纵坐标,绘制一步生长曲线,并测定爆发量、佳MOI及副甲菌突变率;提取副甲噬菌体基因组,酶切分析副甲噬菌体核酸,SDS-PAGE分析副甲噬菌体外壳蛋白;采用热酚法提取脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),采用苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)法提取外膜蛋白(outer membrane protein,OMP),初步分析副甲噬菌体的受体.结果 在医院的污水中分离出的副甲噬菌体,经双层平板计数可见大小不一、透明的噬斑,滴度在109～1010 PFU之间,透射电镜观察可见长尾和一个头部;副甲噬菌体在pH值3～ 10之间滴度较高,40℃以上,随温度上升滴度明显降低,在80℃几宫无活性副甲噬菌体存在;副甲噬菌体感染潜伏期为20 min,爆发期为50 min,爆发量129,佳MOI为0.2,副甲菌突变率为5.8× 10-7～2.2× 10-6;副甲噬菌体基因组的单酶切产物均可见33 bp的特异条带,SDS-PAGE分析可见4条主带;LPS、OMP能与副甲噬菌体结合,是副甲噬菌体的受体.结论 副甲噬菌体为长尾噬菌体,基因组为dsDNA,大小为33 bp,佳MOI为0.2,受体位点为LPS和OMP.
作者：毛普加；冯金；洪愉；黄芬；井申荣；曾韦锟 刊期： 2014年第04期
目的 探讨小脑症1 (microcephalin 1,MCPH1)基因过表达对人肺癌细胞A549凋亡的影响.方法 将质粒pcDNA3.1(-)／MCPH1转染肺癌细胞株A549,并设阴性对照组[pcDNA3.1(-)质粒转染]和未转染组.转染48 h后,采用qRT-PCR法检测各组细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平;转染72 h后,Western blot法检测各组细胞中MCPH1蛋白的表达水平,流式细胞术分析细胞的凋亡情况.结果 质粒pcDNA3.1(-)／MCPH1转染A549细胞后,均可明显上调细胞中MCPH1基因mRNA和蛋白的表达,与阴性对照组和未转染组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05);质粒pcDNA3.1(-)／MCPH1转染组细胞凋亡率[(16.82±1.29)％]较阴性对照组[(6.27±0.88)％]和未转染组[(5.36±0.43)％]明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 MCPH1过表达后可明显促进A549细胞的凋亡,为进一步研究MCPH1基因在肺癌细胞凋亡中的作用及其机制奠定了基础.
作者：张冀；吴晓彬；麦力；袁成福；刘革力；易发平；卜友泉；宋方洲 刊期： 2014年第04期
血栓性疾病(thrombotic disease)已成为全球人类死亡的主要原因,每年约720万人死于该病.而血小板(blood platelet)的功能与血栓性疾病的发生发展密切相关,如血小板相关组织因子(tissue factor,TF)、Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)、血小板表面Fc受体γ链(Fc receptor gamma-chain)、平均血小板体积(mean platelet volume,MPV)、P选择素(p-selectin)、血小板膜糖蛋白V(glycoproteinV,GPV)以及血小板内皮细胞黏附分子-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1)等均参与血栓形成过程.本文就血小板相关因子在血栓性疾病中的作用作一综述,为临床心血管疾病的治疗提供参考.
作者：赵艳芳 刊期： 2014年第04期
目的 利用大肠埃希菌(E.coli)表达系统异源表达细胞色素P450 2E1(cytochrome P450 2E1,CYP2E1),并与细胞色素P450氧化还原酶(cytochromeP450 oxidoreductase,POR)实现共表达,使其具有代谢活性,为药物代谢的研究提供单一性的酶源.方法 以人肝组织RNA为模板,RT-PCR扩增CYP2E1基因,插入pCW空载体,构建重组表达质粒pCW-2E1,转化E.coli DH5α,IPTG诱导表达,表达产物经Western blot鉴定;利用双启动子原理构建CYP2E1与POR共表达的重组质粒pCW-2E 1-POR,采用对氨基苯酚法检测CYP2E1重组酶的代谢活性,并对不同培养时间(18、28、38 h)的代谢活性进行比较.结果 质粒pCW-2E1经PCR鉴定,证明构建正确;表达的重组人CYP2E1蛋白相对分子质量约56 000,主要以可溶性形式表达.质粒pCW-2E1-POR经PCR及酶切鉴定,证明构建正确;导入质粒pCW-2E1-POR的重组菌提取的蛋白样品具有明显的代谢活性,培养18、28、38 h后,代谢活性均值分别为(0.195±0.004)、(0.189±0.003)和(0.192±0.004) nmol/(min·mg),差异无统计学意义(P＞0.05),但与导入质粒pCW-2E1的重组菌提取的蛋白样品的代谢活性相比,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建了具有代谢活性的CYP2E1重组酶,且3个培养时间段之间的代谢活性无明显差异.
作者：徐彬彬；张海风；刘秀；赵勤；王俊平；单杰 刊期： 2014年第04期
目的 观察小鼠肝癌细胞上清液对成纤维细胞增殖及表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、环氧合酶-2(eyelooxygenase-2,COX-2)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的影响.方法 制备小鼠成纤维细胞,并分别用普通培养液、小鼠肝癌细胞上清液的条件培养液及含转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的培养液培养成纤维细胞.采用MTT法检测3种培养液培养的成纤维细胞的增殖活力;RT-PCR和免疫组织化学法检测3种培养液培养的成纤维细胞中α-SMA、COX-2、HGF基因mRNA的转录水平及蛋白的表达情况.结果 条件培养液及含TGF-β1的培养液对成纤维细胞的增殖均有促进作用,但条件培养液的促进作用更强.普通培养液培养的成纤维细胞在第5天时α-SMA基因mRNA的转录水平高,含TGF-β1的培养液及条件培养液培养的成纤维细胞在第3天时α-SMA基因mRNA的转录水平高,且明显高于普通培养液在第5天时的转录水平,第3天以后转录水平稳定;普通培养液培养的成纤维细胞中无COX-2和HGF转录;条件培养液及含TGF-β1的培养液培养的成纤维细胞在第5天时COX-2和HGF基因mRNA的转录水平高,第5天后无明显下降.不同培养液培养的成纤维细胞中α-SMA蛋白在胞浆、胞膜均有不同程度的表达;普通培养液培养的成纤维细胞中COX-2和HGF蛋白不表达,而含TGF-β1的培养液及条件培养液培养的成纤维细胞中COX-2和HGF蛋白为阳性表达,表达部位均为胞浆.结论 小鼠肝癌细胞上清液能有效、稳定地将成纤维细胞激活为稳定表达COX-2和HGF的肌成纤维细胞,其有望成为在细胞移植中促进移植细胞存活及血管重建的细胞.
作者：杜文俊；李德卫；谢言 刊期： 2014年第04期
目的 采用干热法对纯化的人血浆载脂蛋白AⅠ(apolipoprotein A Ⅰ,ApoA Ⅰ)冻干品进行病毒灭活处理,并对灭活效果进行验证.方法 将脂包膜病毒伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、辛德毕斯(Sindbis)病毒及非脂包膜病毒脑心肌炎(encephalomyocarditis,EMC)病毒按1∶9(v∶v)的比例分别加至3批ApoA Ⅰ样品中,冻干后于水浴中(100±1)℃加热30 min灭活,分别于加热后5、10、20、30 min取样,检测病毒滴度,绘制病毒灭活动力学曲线,并检测干热法灭活病毒对目的蛋白理化性质及生物活性的影响.结果 干热法对ApoA Ⅰ样品中的脂包膜和非脂包膜病毒均可有效灭活,灭活20 min后,3种指示病毒的滴度均迅速下降;干热法灭活后,冻干品的外观、复溶时间、复溶后澄明度、目的蛋白的平均回收率(95.44％)均符合要求,样品的SDS-PAGE、Westemblot图谱、免疫电泳行为、二级结构和生物活性均无显著变化.结论 干热法能有效灭活脂包膜和非脂包膜病毒;在ApoA Ⅰ纯化工艺中采用S/D法和干热法两步病毒灭活步骤,可保证制品的安全性.
作者：卞炯；何毅明；吴玮；刁武平；朱威 刊期： 2014年第04期
肾衰竭(kidney failure,KF)是临床常见肾脏疾病,常由肾毒性物质或肾脏严重缺血等因素引起,根据其发病时程,可进一步分为急性肾衰竭(acute kidney failure,AKF)和慢性肾衰竭(chronic kidney failure,CKF).近年来,随着各项医疗技术的发展,许多疾病均得到了有效控制,但是,KF这种疾病尚未得到有效治疗,相关的死亡率也未得到明显改善,其发病率甚至有逐年增高的趋势.目前,相关研究表明,骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)对KF具有一定的治疗作用.本文就近年来BMSCs在KF治疗方面的研究进展作一综述.
作者：王海霞；赵巍 刊期： 2014年第04期
目的 构建人P4HB基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的表达.方法 采用RT-PCR法从正常人肝细胞HL7702中扩增P4HB基因片段,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB,在脂质体LipofectamineTM 2000介导下转染A549细胞,通过G418加压筛选,建立稳定转染细胞系,通过qPCR和Western blot法检测转染细胞中P4HB基因mRNA的水平及蛋白的表达水平.结果 重组真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB经双酶切(BamH I／EcoR I)和测序证实构建正确;质粒pcDNA3.1-P4HB转染的A549细胞中P4HB基因mRNA的水平为空载体转染的细胞和未转染细胞的102倍;质粒pcDNA3.1-P4HB转染的A549细胞中P4HB蛋白的表达量(1.71)较未转染的A549细胞(1.11)明显升高.结论 成功构建了P4HB基因真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB,转染A549细胞后,P4HB基因在mRNA水平和蛋白水平均出现了较强的表达,表明P4HB基因已稳定转染入A549细胞中.本实验为进一步研究P4HB对人肺癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响奠定了基础.
作者：孙玲玲；林丽珠；周京旭 刊期： 2014年第04期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
