幸宇；邓世雄；陈俊霞
目的 探讨沉默整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)基因表达对人舌鳞癌Tb细胞生长、迁移和侵袭能力的影响.方法 将ILK siRNA表达质粒和阴性对照质粒在脂质体介导下转染人舌鳞癌Tb细胞,稳定表达细胞株分别命名为Tb siILK和Tb vector组,并设正常Tb细胞对照组(Tb组).Western blot法检测细胞中ILK蛋白的表达；细胞免疫荧光法检测细胞中ILK、p-Akt和p-GSK3β的表达；光镜和HE染色观察细胞的形态学变化；划痕试验检测细胞的迁移能力；Transwell法检测细胞的侵袭能力；流式细胞术检测细胞的细胞周期和凋亡情况；MTT法检测细胞的增殖活力；Westem blot法检测沉默ILK基因后细胞中p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3α/β、Snail的表达.结果 与Tb和Tb vector组相比,Tb siILK组细胞中ILK蛋白的表达水平显著降低(P＜0.01);ILK、p-Akt、p-GSK3β在胞质中的荧光信号明显减弱；大部分细胞的上皮形态特征更为明显；细胞的迁移距离和侵袭细胞数显著减少(P＜0.05)；G2-M期和G0-G1期细胞比例均显著增加(P＜0.01)；细胞的增殖活力显著减低；ILK基因沉默后,细胞中p-Akt、p-GSK3β和Snail蛋白的表达水平显著降低(P＜0.05).3组细胞的凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 抑制ILK基因的表达可通过Akt/GSK3β/Snail途径显著抑制人舌鳞癌Tb细胞的生长、迁移和侵袭能力,ILK有望作为治疗人舌鳞癌的靶基因.
作者：幸宇；邓世雄；陈俊霞 刊期： 2013年第07期
目的 探讨激活素受体相互作用蛋白1(activin receptor-interaction protein 1,ARIP1)和ARIP2在小鼠脑神经细胞中的共表达.方法 RT-PCR法检测C57BL小鼠小脑、垂体、大脑、脾脏、心脏、肾脏、肝脏、胰腺组织中ARIP1和ARIP2基因mRNA的转录；以融合蛋白GST-ARIP1C和MBP-ARIP2C作为抗原免疫新西兰白兔,制备抗ARIP1和ARIP2抗体,经A蛋白亲和层析柱纯化后,ELISA法检测抗体的交叉反应；用制备的抗体,采用免疫组织化学染色检测ARIP1和ARIP2在小鼠脑组织中的表达；RT-PCR法检测小鼠神经母细胞瘤Neuro-2a细胞中激活素ⅡA型受体(activin receptorⅡA,ActRⅡA)、ARIP1和ARIP2基因mRNA的转录.结果 在小鼠大脑、小脑及垂体组织中可见ARIP1基因mRNA的转录,在小鼠各部位组织中均可见ARIP2基因mRNA的转录；制备的兔抗ARIP1和ARIP2抗体无交叉反应；ARIP1和ARIP2在小鼠脑组织的海马和下丘脑同时表达；ActRIⅡA及ARIP1和ARIP2 mRNA在神经元样细胞系Neuro-2a细胞中共表达.结论 ARIP1和ARIP2可在小鼠脑神经细胞中共表达.
作者：谢佳男；齐妍；赵阳；王增艳；赵莉佩；崔雪玲；柳忠辉；王轶楠 刊期： 2013年第07期
目的 观察凋亡抑制蛋白Survivin基因干扰和过表达对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响.方法 将Survivin基因shRNA干扰质粒和过表达质粒pcDNA3.1-GFP-Survivin在脂质体介导下转染MCF-7细胞,并设空白对照组和脂质体对照组,转染后48 h,荧光显微镜下观察转染效率；荧光定量RT-PCR法检测转染细胞中Survivin基因mRNA的转录水平；MTT法检测转染细胞的凋亡率.结果 转染MCF-7细胞后48 h,Survivin基因RNAi质粒和过表达质粒的转染效率为50％ ～ 60％；shRNA质粒转染组MCF-7细胞中Survivin基因mRNA的转录水平明显低于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显高于空白对照组和脂质体对照组(P＜0.05)；shRNA质粒转染组MCF-7细胞的凋亡率明显高于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显低于空白对照组和脂质体对照组(P＜0.05).结论 Survivin基因对人乳腺癌MCF-7细胞的凋亡具有一定的抑制作用,可作为人乳腺癌生物治疗的候选基因.
作者：李鹏 刊期： 2013年第07期
目的 在毕赤酵母中表达重组人血管内皮生长因子(recombinant human vascular endothelial growth factor,rhVEGF) 165b(rhVEGF-165b),并进行纯化.方法 PCR扩增hVEGF165b基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9k,构建重组表达质粒pPIC9k-VEGF165b,Sal Ⅰ酶切线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达.表达产物经Ni-NTA sephrose镍柱纯化后,进行Western blot鉴定.结果 重组表达质粒pPIC9k-VEGF165b经双酶切和测序,证明构建正确；表达的rhVEGF165b蛋白相对分子质量约为23 000,纯化后纯度达90％以上,具有人VEGF的抗原性.结论 成功在毕赤酵母中表达了rhVEGF165b蛋白,纯化的蛋白纯度较高,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.
作者：戴惠云；朱瑞宇；雷楗勇；侯颖；陈蕴；金坚 刊期： 2013年第07期
近年来,随着研究的深入,特异性细胞免疫在百日咳感染和疫苗诱导的免疫保护等方面的作用越来越引起人们的重视.本文就百日咳杆菌主要毒力因子在诱导细胞免疫及免疫调节中的作用、百日咳感染及疫苗免疫接种后诱导产生的细胞免疫应答等方面的研究进展作一综述.
作者：张平；徐颖华 刊期： 2013年第07期
目的 探讨环境内分泌干扰物邻苯二甲酸二(2-乙基)已酯(Di-2-ethylhexy1 phthalate,DEHP)作用于SD孕鼠后,对哺乳期雄性幼鼠睾丸组织中Notchl的表达及其在隐睾所致不育症中可能发挥的作用.方法 将30只妊娠第12.5天的SD孕鼠随机分为正常对照组、玉米油对照组和DEHP诱导隐睾组,每组10只.玉米油对照组和DEHP诱导隐睾组SD孕鼠自妊娠第12.5～19.5天,分别每日灌胃玉米油(2ml)和DEHP(500 mg/kg),正常对照组不给药.取各组出生后第20天的雄性幼鼠,镜下观察睾丸位置,并统计隐睾发生情况.采用RT-PCR及Western blot法检测各组雄性幼鼠睾丸组织中Notch1基因mRNA和蛋白的表达水平.结果 与正常对照组和玉米油对照组相比,DEHP诱导隐睾组雄性幼鼠的隐睾发生率明显上升(P＜0.05);DEHP诱导隐睾组雄性幼鼠睾丸组织中Notch1基因mRNA和蛋白表达水平均明显低于正常对照组和玉米油对照组(P＜0.05).结论 孕期暴露环境内分泌干扰物DEHP可引起雄性子代发生隐睾,隐睾子代睾丸组织中Notch1表达有改变,并可能与隐睾导致的不育有关.
作者：刘东尧；吴盛德；华燚；何文飞；何昀；陈柏林；龙春兰；魏光辉 刊期： 2013年第07期
目的 应用磁凝集法梅毒检测试剂检测梅毒特异性抗体和反应素.方法 应用磁凝集法梅毒检测试剂(Tre-ponema pallidum magnetic particle agglutination,TPMPA)检测梅毒阳性血清,分析梅毒阳性血清符合率、梅毒血清抗体滴度、假阳性检出率及交叉反应.结果 用TPMPA-A、TPMPA-B试剂检测26份梅毒阳性血清样品,结果均为阳性,与省血液中心和省疾控中心的检测结果的符合率为100％；应用TPMPA-B试剂检测梅毒抗体滴度结果均较用梅毒甲苯胺红不加热血清试验诊断试剂(TRUST)检测结果高2个滴度；用TPMPA-A、TPMPA-B试剂检测正常血清,结果均为阴性,与省血液中心检测结果相符；用TPMPA-A、TPMPA-B试剂检测5份风湿病患者血清和13份慢性肝病患者血清,均未出现交叉反应.结论 磁凝集法梅毒检测试剂具有良好的特异性和敏感性,操作简便、省时,可初步用于检测梅毒特异性抗体和反应素.
作者：王玉华；王帆；陈露；刘佳；张金玲；时承娟 刊期： 2013年第07期
目的 建立特异的CHO细胞DNA残留量荧光定量PCR(Q-PCR)检测方法.方法 采用DNeasy Tissue Kit提取CHO细胞基因组DNA,制备DNA标准品；确定Q-PCR反应体系及反应条件,绘制标准曲线,建立CHO细胞DNA残留量Q-PCR检测方法,并验证其专属性、准确性及精密性；用建立的方法对1003b02、1008b05、1012b09、1104b04、1108b13、1112b24批康柏西普原液的CHO细胞DNA残留量进行检测.结果 建立的标准曲线Ct值与模板DNA浓度的对数值之间呈良好的线性关系,相关系数为0.99以上；检测HUVEC、HEK293细胞的DNA残留量均无特异性扩增曲线；检测高、中、低浓度的DNA标准品(105、103、101 pg/ml)的平均回收率均在Q-PCR方法可接受的回收率范围(50％ ～ 200％)内,批间变异系数分别为9.3％、21.8％、26.8％；检测100 pg/ml浓度的DNA标准品的平均回收率为111.6％,变异系数为20.4％；康柏西普原液的DNA残留量远低于100 pg/剂量.结论 已成功建立特异的CHO细胞DNA残留量Q-PCR检测方法,该方法专属性好,准确性及精密性高,可作为CHO宿主细胞DNA残留量的常规检测方法.
作者：牛冬云；连炜；何静；邬智刚；柯潇 刊期： 2013年第07期
目的 以结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)RDl区特异性培养滤液蛋白10(culture filtrate pro-tein 10,CFPl0)与戊糖-5-磷酸-3-差异构象酶68(pentose-5-phosphate-3-epimerase68,PPE68)的融合蛋白CFP10-PPE68作为包被抗原,建立检测结核病患者血清中MTB抗体的间接EHSA法.方法 采用亲和层析法纯化重组CFP10-PPE68、CFP10和PPE68蛋白；分别以3种蛋白作为包被抗原,建立检测结核病患者血清中MTB特异性抗体的间接EHSA法；采用方阵滴定法对建立的间接EHSA法的条件进行优化；并以临床诊断为金标准,对间接ELISA法的特异性、敏感性和准确性进行验证.结果 纯化的重组CFPl0-PPE68融合蛋白纯度约为70％.分别以重组CFP10-PPE68、CFP10和PPE68蛋白作为包被抗原的佳包被浓度分别为2、4、4μg/ml,血清佳稀释度均为1∶1 000,酶标二抗佳稀释度均为1:5000.3种蛋白对肺外结核的诊断效果均优于肺结核,且重组CFP10-PPE68融合蛋白检测肺外结核的特异性、敏感性及准确性均佳；3种蛋白诊断结核病的特异性较高,而敏感性相对较低.结论 以重组CFP10-PPE68融合蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA法诊断MTB感染具有较高的敏感性和特异性,特别是对难以诊断的肺外结核病的诊断有一定的参考价值.
作者：董志玲；杨春；徐蕾；何永林；冯鑫；王静娴；张壮苗；杨晓燕 刊期： 2013年第07期
目的 评价诺华公司生产的b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)结合疫苗的安全性及免疫原性.方法 采用随机、对照、双盲方法,将320名2～5月龄健康婴幼儿按照1:1的比例分为实验组和对照组,实验组接种3剂诺华公司生产的Hib结合疫苗,对照组接种3剂某进口Hib结合疫苗,每剂间隔1个月,接种部位和途径均为上臂三角肌肌肉注射.每剂接种后30 min、6h、24 h、48 h、72 h,对观察对象进行主动安全性观察；每剂接种后4～28d,观察对象主动报告接种疫苗后的不良反应及不良事件发生情况.分别于接种前和全程免疫后28 d采集指血,ELISA法测定Hib-PRP抗体水平,评价疫苗的免疫原性.结果 实验组3针总局部反应发生率为12.67％,对照组3针总局部反应发生率为14.69％,两组差异无统计学意义(P＞0.05)；实验组第1针局部反应发生率明显低于对照组,而第2、3针局部反应发生率高于对照组.实验组3针总全身反应发生率为19.33％,对照组3针总全身反应发生率为22.38％,两组差异无统计学意义(P＞0.05)；实验组与对照组各针次全身反应发生率差异均无统计学意义(P＞0.05).实验组和对照组接种疫苗后,Hib-PRP抗体水平≥1.0 μg/ml的比例分别为97.33％和95.80％,二者差异无统计学意义(P＞0.05)；Hib-PRP抗体水平≥0.15 μg/ml的比例均为100％.实验组和对照组接种疫苗后,Hib-PRP抗体水平分别为(3.82±39.76)和(5.22±43.22)μg/ml.结论 未观察到诺华公司Hib结合疫苗与某进口Hib结合疫苗的安全性和免疫原性存在差别.
作者：罗凤基；李丽；张国辉；张政；王朝云；杨立清；艾星；白云骅；芦强 刊期： 2013年第07期
目的 评价重组人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)疫苗免疫原性2种检测方法的相关性.方法 应用间接酶联免疫吸附(ELISA)法和假病毒中和(pseudovirion-based neutralization assay,PBNS)法对26份阴性血清样本、34份自然感染HPV16或HPV18的血清样本及30份接种HPV16/18型双价疫苗后7个月的血清样本进行抗体滴度检测,并采用Pearman进行相关性分析.结果 3组样本的抗HPV16型和HPV18型抗体滴度的2次检测结果比值显示,试验室内重复性较好；2种方法检测血清样本抗HPV16型抗体滴度的总体相关系数为0.826,抗HPV18型为0.921；自然感染HPV的血清样本抗HPV16型抗体滴度的相关系数为0.519,抗HPV18型为0.613；接种HPV16/18型双价疫苗后的血清样本抗HPV16型抗体滴度的相关系数为0.671,抗HPV18型为0.879.结论 间接ELISA法和PBNS法在检测血清样本中抗HPV16/18型抗体滴度时均具有较好的重复性和相关性,其中以接种疫苗后的血清样本中抗体滴度相关性佳,为HPV疫苗免疫原性的检测及剂量探索试验提供了参考依据.
作者：赵慧；李娟；潘晖榕；林玉香；李少伟；李长贵 刊期： 2013年第07期
目的 探讨吸水链霉菌谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TGase,EC 2.3.2.13)的两种同源异形体成熟酶TGases A和TGases B的分子差异,并进行系统分析和鉴定.方法 吸水链霉菌培养上清液经阴离子交换层析和凝胶过滤层析分离纯化后,将纯化产物再经阴离子交换层析,分析纯化产物的分子表面带电性质,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)和远紫外圆二色谱(far ultra-violet circular dichroism spectrometry,Far-UV CD)法分析纯化产物的肽段序列及二级结构的差异,并检测成熟酶N-末端氨基酸序列.结果 经阴离子交换层析和凝胶过滤层析分离纯化获得TGases的两种成熟酶TGases A和TGases B,均具有酶活性；TGase A和TGase B成熟酶分子具有不同的表面带电性质,酶活分别为(28.33±1.45)U/mg和(22.54±1.77)U/mg; TGases A和TGases B在质荷比(m/z)4 536.481和4 873.393处两个低丰度肽段有差异,但N-末端6个氨基酸序列完全相同；两者二级结构均以α-螺旋为主,但二级结构存在一定差异.结论 吸水链霉菌TGases A和TGases B是由同一种酶原活化产生的同源异形体,两者的表面电荷性质、肽段序列及分子二级结构均有差异.
作者：崔文璟；杜坤；周丽；刘中美；丁旭；周哲敏 刊期： 2013年第07期
目的 采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(high performance anion exchange chromatography withpulsed amperometric detector,HPAEC-PAD)测定b型流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae type b,Hib)结合疫苗的多聚磷酸核糖基核糖醇(polyribosylribitol phosphate,PRP)多糖含量.方法 用终浓度为0.3N的NaOH溶液将待测疫苗中的PRP多糖或分离得到的游离多糖在室温下振荡水解(16±8)h,采用CarboPac@PA-10阴离子交换柱在NaOH/醋酸钠溶液梯度洗脱条件下分离水解产物,用脉冲安培检测器检测信号,根据样品的峰面积计算得到待测疫苗中的PRP多糖含量及游离多糖含量,样品均重复检测2次,计算2次检测结果的相对标准偏差(RSD).同时采用《中国药典》三部(2010版)附录ⅧJ中的地衣酚法测定相同批次样品的PRP多糖含量及游离多糖含量,并对两种方法得到的结果进行比较.结果 相同样品重复检测2次,结果间的差异非常小,RSD不超过4.6％.HPAEC-PAD法测得的总PRP结果与地衣酚法测得的结果接近,前者测得的S01～S03样品的PRP浓度值分别为后者的105％、104％和106％; HPAEC-PAD法测得的游离PRP结果与地衣酚法测得的结果差别较大,前者测得的S01～S03样品的游离PRP浓度值分别为后者的126％、109％和115％.结论 HPAEC-PAD法测定Hib结合疫苗的PRP多糖含量灵敏度高,重复性和分离效果好,样品不需要衍生处理,可同时测定多组分,可作为传统地衣酚法的替代方法用于Hib结合疫苗中多糖含量的测定.
作者：贺鹏飞；唐静；李亚南；李茂光；叶强 刊期： 2013年第07期
抗体药物是生物技术药物研发领域中公认的研究热点.在抗体药物研制过程中,免疫原性一直是限制其临床应用的重要因素,不但严重影响其安全性和有效性,有时还会导致严重的临床后果.本文主要分析了抗体药物本身引起免疫原性的多种因素以及针对这些因素的改进方法,即通过抗体的人源化、去免疫化、糖基化修饰、抗体分子小型化和多聚体问题的改善来降低抗体药物的免疫原性.
作者：陈雪静；刘晓志 刊期： 2013年第07期
目的 探讨干扰素α2a(interferonα 2a,IFNα2a)与白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)联合作用对体外肝癌细胞HepG2.2.15增殖及乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的影响.方法 用不同浓度的IFNα2a(5 000、10 000、15 000 IU/ml)和IL-2(2 500、5 000、10 000 IU/ml)单独及联合作用HepG2.2.15细胞96 h后,采用WST-1法检测细胞增殖情况,倒置相差显微镜观察联合作用组细胞形态学变化,ELISA法检测联合作用组细胞上清中HBsAg和HBeAg的表达,斑点杂交法检测联合作用组细胞HBV-DNA的复制情况.结果 与不同浓度的IFNα2a和IL-2单独作用相比,二者联合作用对HepG2.2.15细胞增殖的抑制作用明显增强(P＜0.05);IFNα2a与IL-2联合作用组HepG2.2.15细胞显微镜下可见细胞逐渐变圆,胞浆中颗粒增多,增殖变慢,细胞间接触不紧密,细胞周围碎片增多；联合作用组细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的表达明显受到抑制(P＜0.05)；5 000 IU/ml IFNα2a+10 000 IU/ml IL-2、10 000 IU/ml IFNα2a+10 000 IU/ml IL-2和15 000 IU/ml IFNα2a+10 000 IU/ml IL-2对HepG2.2.15细胞HBV-DNA的复制有抑制作用.结论 IFNα2a与IL-2联合作用对HepG 2.2.15细胞增殖及HBV-DNA复制均有抑制作用.本实验为后续体内动物实验及筛选合适的疫苗佐剂奠定了基础,也为新型乙型肝炎疫苗及治疗性乙型肝炎疫苗的研究提供了参考.
作者：徐艳玲；刘令九；侯丽娟；岳立广；隋红；赵小琳；金立杰 刊期： 2013年第07期
目的 原核表达并纯化深黄被孢霉△5-脱饱和酶.方法 采用RT-PCR技术扩增深黄被孢霉△5-脱饱和酶基因,插入表达载体pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-D5D,转化人大肠埃希菌(E coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达.表达的重组蛋白经Ni2+-NTA纯化后,进行Western blot鉴定.结果 重组表达质粒pET-D5D经双酶切(NotⅠ/SalⅠ)和测序鉴定,证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为55 000,诱导6h表达量较高,主要以包涵体形式表达；纯化的重组蛋白可与兔抗△5-脱饱和酶多克隆抗体特异性结合.结论 成功在E.coli中表达了深黄被孢霉△5-脱饱和酶,纯化后的重组蛋白反应原性良好,为进一步研究A5-脱饱和酶的功能奠定了基础.
作者：朱祺；于长青；姚笛 刊期： 2013年第07期
目的 探讨霉酚酸酯(mycophenolate mofetil,MMF)对博莱霉素(bleomycin,BLM)诱导的小鼠肺纤维化组织中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达的影响.方法 将C57BL/6小鼠随机分为6组:正常对照组、MMF对照组、BLM模型组、MMF低(20 mg/kg)、中(60 mg/kg)、高(100 mg/kg)剂量干预组,每组6只.BLM模型组和MMF 3个干预组经气管注入BLM(6 mg/kg),正常对照组和MMF对照组注入等量无菌生理盐水；次日按MMF对照组和MMF干预低、中、高剂量组小鼠体重计算MMF给药量,灌胃小鼠,每日1次,连续14d,正常对照组和BLM模型组用等体积的双蒸水灌胃.灌胃第16天采集小鼠肺脏标本,经HE、Masson染色,从组织形态学上观察肺组织纤维化情况并进行Aschcroft评分；RT-PCR法检测小鼠肺组织中TGF-β1基因mRNA的转录水平；Western blot法检测小鼠肺组织中TGF-β1蛋白的表达水平.结果 BLM诱导的小鼠肺纤维化改变显著,Ashcroft评分较正常对照组显著增高(P＜0.01),表明小鼠肺纤维化模型构建成功；MMF高剂量干预组肺组织损伤减轻,炎细胞浸润及胶原沉积减少,Ashcroft评分显著降低(P=0.000).MMF高剂量干预组与BLM模型组比较,TGF-β1基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均明显减低(P＜0.05)；而MMF低、中剂量干预组与BLM模型组之间、MMF对照组与正常对照组之间,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 高剂量的MMF(100 mg/kg)可抑制BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织中TGF-β1基因mRNA的转录水平及蛋白表达水平,有望成为治疗肺纤维化的理想药物.
作者：曹姝；李少林；吴府容；康强强；李芳；王颖 刊期： 2013年第07期
目的 采用高效液相色谱质谱联用的方法鉴别口服疫苗中硫柳汞的降解产物.方法 采用C18色谱柱,甲醇-醋酸铵缓冲溶液(pH 4.5)梯度洗脱,以紫外和质谱检测器进行检测,对某口服疫苗中的未知色谱峰进行鉴别.结果 疫苗样品中两个色谱峰的保留时间及其一级二级质谱图与硫柳汞的降解产物硫代水杨酸以及2,2’-二硫代二苯甲酸基本一致.结论 高效液相色谱质谱联用可鉴别口服疫苗中的硫柳汞降解产物.
作者：李茂光；石继春；朱实惠；陈琼；叶强 刊期： 2013年第07期
目的 构建携带PML(NLS-)基因的重组腺病毒,并观察其对白血病K562细胞增殖的影响.方法 以质粒pCMV-HA-PML(NLS-)为模板,PCR扩增PML(NLS-)基因,与穿梭质粒pAdTrace-TO4连接,构建重组穿梭载体pAdTrace-TO4-PML(NLS-),经Pme Ⅰ酶切线性化后,转化人感受态BJ5183细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-),经Pac Ⅰ酶切后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-PML(NLS-),经4轮扩增后,检测其滴度.采用RT-PCR法和Western blot法分别检测重组腺病毒中PML(NLS-)基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平；将重组腺病毒感染K562细胞,MTT法检测其对细胞增殖活力的影响.结果 重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-)经PCR和单酶切鉴定,证明构建正确；经4轮扩增,重组腺病毒的滴度为l×1010 pfu/ml;Ad-PML(NLS-)携带的PML(NLS-)能够在AD293细胞中稳定表达；与未感染组和空载病毒感染组相比,重组腺病毒Ad-PML(NLS-)感染的K562细胞的增殖活力明显增强(P＜0.05).结论 成功构建了重组腺病毒Ad-PML(NLS-),其可促进K562细胞的增殖,表明PML(NLS-)可能具有促癌基因的作用.
作者：高远梅；刘北忠；张曦；胡秀秀；钟梁 刊期： 2013年第07期
目的 构建含NLS-RARα基因的重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并检测其在K562细胞中的表达.方法 以质粒pGBKT7-PML-RARα为模板,PCR扩增NLS-RARα基因,与穿梭质粒dTrace-TO4连接,构建重组穿梭质粒pAdTrack-TO4-NLS-RARα,经Pme Ⅰ酶切线性化后,转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠埃希菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒pAd-NLS-RARα,经Pac Ⅰ酶切线性化后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-NLS-RARα,经4轮扩增后,测定重组腺病毒滴度,并进行PCR及测序鉴定；将重组腺病毒感染K562细胞,采用流式细胞术测定感染效率,RT-PCR法和Western blot法检测NLS-RARα在K562细胞中的转录及表达水平.结果 重组腺病毒Ad-NLS-RARα经4轮扩增后,滴度可达6.9×lO8 pfu/ml,PCR及测序鉴定证明构建正确,对K562细胞的感染效率可达70％左右；重组腺病毒Ad-NLS-RARα携带的NLS-RARα基因可在K562细胞中高效表达.结论 已成功构建了重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并在K562细胞中高效表达了NLS-RARα基因.
作者：胡秀秀；刘北忠；钟梁；高远梅；张曦；吴秀娟；王慧；朱新瑜 刊期： 2013年第07期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
