戴凌燕；李志江；王欣；李娟；关琛；李良玉；周世珠
目的:表表达并纯化重组双链RNA依赖的Caspase募集蛋白,并鉴定其生物学活性.方法:将重组质粒pRSETdsCARE转化大肠杆菌BL21(DE3),分别于37、28℃表达目的蛋白,Ni-NTA亲和层析纯化,纯化产物经SDS-PAGE、Western blot、HPLC鉴定目的蛋白,MTT法检测dsCARE对转染poly(I∶C)细胞的增殖抑制作用.结果:dsCARE重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中呈组成性稳定表达,平均每升培养基可收获湿菌体约10g；纯化产物的SDS-PAGE纯度达95.8％；纯化的目的蛋白能与抗-His多抗发生特异性反应；HPLC纯度达95.1％；每10g湿菌体可纯化dsCARE重组蛋白约7.5mg,浓度约220μg/ml;纯化的dsCARE重组蛋白与转染poly(I∶C)的HeLa细胞共同孵育,可剂量依赖性抑制HeLa细胞的增殖活性.结论:成功建立了重组dsCARE蛋白的表达、纯化工艺及活性鉴定方法,为其应用和后续研究奠定了基础.
作者：王伟；王伟华；崔杰；杨静华；颜真 刊期： 2012年第05期
目的:克隆人源抗菌肽( Antimicrobial peptide,AMP)LL-37及其改良体串联体基因,原核表达并纯化重组蛋白.方法:利用生物信息学手段,对人源抗菌肽Ll-37基因序列进行改良设计,合成人源抗菌肽LL-37及其改良体基因片段,经重叠延伸PCR获得人源抗菌肽LL-37及其改良体串联体基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-dLL-37,转化大肠杆菌BL21( DE3 )pLysS,IPTG诱导表达,Tricine SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式,镍金属螯合亲和层析纯化重组蛋白.结果:改良后的人源抗菌肽LL-37的等电点、稳定性及其在大肠杆菌中的半衰期均显著提高；重组表达质粒pET-28a-dLL-37经测序鉴定构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为11000,主要以包涵体形式存在；纯化的重组蛋白纯度可达95％,浓度为0.473mg/ml.结论:已成功在大肠杆菌中表达并纯化了人源抗菌肽LL-37及其改良体串联体,为其后续生物学活性的研究奠定了基础.
作者：杨浩；姚海燕；陈圆圆；阎波；郭鹏；马驰；韩跃武 刊期： 2012年第05期
目的:采用HPLC法测定重组人干扰素α2b注射液中吐温80的含量.方法:按设置的色谱条件对检测重组人干扰素α2b注射液中吐温80含量的HPLC方法进行专属性验证、系统适应性验证、线性范围测定、实验内重复性验证、日间重复性验证、低检测限测定、准确性验证,并对3批重组人干扰素α2b注射液中吐温80的含量进行检测.结果:该测定方法具有专属性；系统适应性良好；线性范围为0.03125～2.5mg/ml,R2=0.9997,线性关系良好；实验内重复性,峰面积和浓度的RSD值分别为0.71％和0.56％；日间重复性,保留时间和峰面积的RSD值分别为0.47％和2.76％；低检测限为10mg/L;加样同收率分别为101.99％、99.96％和102.2％,RSD=1.16％；3批人干扰素α2b注射液中吐温80的相对含量分别为0.940、0.936和0.950 mg/ml,分别为标示量的94.0％、93.6％和95.0％.结论:本方法准确、快速、可靠,可用于重组人干扰素α2b注射液中吐温80含量的测定.
作者：赵辉；李增礼；周乐春；储成风；倪晓燕；王荣海；宋礼华 刊期： 2012年第05期
手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是世界范围内流行的儿童传染病,曾在亚太地区出现过多次大规模的暴发和流行,肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus A16,CA16)是引起该病的两种主要病原.尽管这两种病毒在遗传学上关系很近,但其感染在临床表现和体征方面均存在一定差异,这种差异是源于病毒基因组的不同,还是由遗传表型特性所致,是值得研究的课题.本文就二者的特征及感染后宿主的细胞反应和比较蛋白质组学研究进行综述.
作者：张文慧；井申荣 刊期： 2012年第05期
目的:构建组氨酸( Histidine)位点突变的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)突变体,并检测其感染性.方法:利用定点突变技术,分别将HCV包膜蛋白E2第490位和第621位的组氨酸突变为丙氨酸(Alanine),构建突变质粒H490A和H621A,采用T7体外转录法制备病毒RNA,通过电穿孔法导入Huh7.5.1细胞,免疫荧光法检测病毒蛋白的表达、电穿孔效率及细胞培养上清的感染性.结果:H490A和H621A突变型质粒经酶切及测序鉴定构建正确；体外转录获得的野生型与突变型病毒RNA均能在Huh7.5.1细胞中表达病毒蛋白,电穿孔效率高达90％以上；野生型病毒感染细胞培养上清中可检测到HCV阳性细胞,H490A病毒感染细胞培养上清中的阳性细胞数量比野生型明显减少,H621A病毒感染细胞培养上清中未检测到阳性细胞.结论:成功构建了组氨酸位点突变的全长表达质粒H490A和H621A,两种突变体病毒的感染性均显著降低.
作者：刘霜；鞠鹤鹏；戚中田；边中启；秦照玲 刊期： 2012年第05期
目的:对我国现用风疹病毒(Rubella virus,RV)疫苗生产毒株松叶株(Matsuba)进行全基因组测序,分析其在减毒过程中的遗传与变异特点,为其安全性评价及遗传学质量控制的标准化提供依据.方法:利用RT-PCR法分段扩增我国现用Matsuba疫苗株主代种子基因组全序列,分别将产物插入到T-A克隆载体pGEM-T easy中,构建病毒cDNA文库,进行全基因组序列测定与分析.结果:我国现用Matsuba疫苗株主代种子基因组全长9762nt,含2个ORF,分别位于核苷酸41～6388位和6512～9700位,编码2116、1062个氨基酸；与GenBank中登录的Matsuba.GMK3野毒株和Matsuba疫苗株核苷酸同源性分别为97.5％和99.9％,氨基酸同源性分别为98.8％和99.9％；其在减毒的过程中共有37个氨基酸位点发生变异,其中非结构蛋白P150有18个氨基酸位点发生突变,结构:蛋白El和E2主要抗原位点氨基酸末发生变异,E1-177位糖基化位点突变丢失.结论:我国现用风疹病毒Matsuba疫苗株与同类减毒株具有较高的同源性,其主要的抗原位点在减毒保种过程中高度保守,为在分子水平上保证Matsuba株毒种及其生产疫苗的安全性提供了依据.
作者：刘晨鸣；冯德杰；赵雅静；魏然；魏至栋；高雪军；朱莉萍 刊期： 2012年第05期
目的:探讨发酵糙米提取物对高血脂大鼠血脂、肝脏脂类含量及抗氧化能力的影响.方法:建立Wistar大鼠高血脂模型,通过灌胃不同剂的发酵糙米提取物[100和300mg/(kg·d)],观察对高血脂大鼠总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯( Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)、动脉硬化指数( Atherosclerotic index,AI)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)等生化指标的影响.结果:发酵糙米提取物可显著降低高血脂大鼠血清及肝脏中TC、TG、LDL浓度和AI值,提高HDl浓度；增加血清和肝脏中GSH-Px和SOD的浓度,降低MDA的浓度.结论:发酵糙米提取物对高血脂大鼠血清和肝脏的血脂水平具有良好的调节作用,且可提高抗氧化效果.
作者：戴凌燕；李志江；王欣；李娟；关琛；李良玉；周世珠 刊期： 2012年第05期
目的:探讨触珠蛋白(Haptoglobin,Hp)在急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)患者血清中的表达情况,为该疾病的诊断与治疗提供新思路.方法:收集30例确诊的AMI患者和30例体检证实为健康人群组的血清,去除血清高丰度蛋白后,采用双向电泳(2-DE)分离血清蛋白,获得的电泳图谱经ImageMaster5.00软件分析,差异明显的蛋白点经胶内酶解后,行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption-ionization-time of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析,检测Hp的表达.结果:AMI患者与健康人群组血清的电泳图谱相似；MALDI-TOF-MS分析显示,AMI患者血清中Hp表达量明显高于健康人群组(P＜0.05).结论:Hp在AMI患者血清中表达量升高,其有望成为AMI患者的特异性诊断标记物.
作者：范晓卿；周义文；秦晓林；何咏婷；刘银河；王毅；涂植光 刊期： 2012年第05期
目的:建立放射致小鼠骨髓细胞损伤与衰老模型.方法:取50只小鼠,随机分为对照组和4.0、6.5、8.5和10.5 Gy不同剂量照射实验组,观察小鼠30d存活率.另取20只小鼠,分别于6.5Gy照射后第1、3、7和30天检测外周血血常规及骨髓单个核细胞( Mononuclear cells,MNCs)数的变化,观察骨髓造血细胞大小及形态并计数集落数量,流式细胞仪检测骨髓MNCs凋亡情况,采用衰老相关的β-半乳糖苷酶( Senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal)染色法检测SA-β-gal活性,细胞免疫荧光法分析p16Ink4a蛋白的表达水平.结果:小鼠30d存活率对照组和4.0Gy实验组均为100％,6.5Gy实验组为80％,8.5及10.5 Gy实验组均为0.6.5Gy一次性全身照射后第1、3、7、30d,小鼠外周血白细胞、血小板、骨髓MNCs数、CFU数量均下降,以照射后第3天明显,第7天开始恢复正常；照射后骨髓MNCs凋亡率与对照组[(7.32±1.87)％]相比,均明显升高(P＜0.05),第3天高[(35.71±0.30)％],随时间的延长凋亡率逐渐下降；SA-β-gal染色和细胞免疫荧光染色结果显示,照射后阳性细胞率与对照组比较,均明显升高(P＜0.05),以第3天高,随时间延长逐渐降低.结论:以6.5Gy照射,可建立小鼠的骨髓造血细胞损伤与衰老模型,为进一步筛选抗骨髓抑制的药物奠定了基础.
作者：闫玲玲；姜蓉；李春莉；左国伟；高焕庆；陈地龙；龙轩；王建伟 刊期： 2012年第05期
目的:探讨重组促性腺激素释放激素-绿脓杆菌外毒素A(Luteinizing hormone releasing hormone-pseudomonmexotoxin A,LHRH-PE40)与肿瘤细胞和正常细胞膜表面受体特异性结合的差异.方法:常规培养Hep-2、A549及LO2细胞,通过细胞毒性试验观察LHRH-PE4.0对3种细胞的形态学影响及生长抑制作用；通过LHRH-Pe40与LHRH受体的结合试验及LHRH对LHRH-PE40竞争性抑制试验,测定LHRH-PE40在不同J细胞中膜表面受体结合的差异.结果:LHRH-PE40对Hep-2、A549细胞具有明显的杀伤作用,细胞收缩变圆,色暗,折光性差,裂解死亡,杀伤作用随LHRH-PE40浓度的增大而增强,IC50值分别为0.45和0.19 μmol/L,而对LO2细胞毒性作用较弱；LHRH-PE40可与Hep-2和A549细胞受体结合密切,A490值较高,与两种细胞的结合力随着时间的延长而增加,与LO2细胞结合较弱；LHRH可以竞争性拮抗抑制LHRH-PE40与Hep-2、A549细胞的结合,结合力随着LHRH浓度的增高而递减,对LHRH-PE40和LO2细胞结合影响较小.结论:LHRH-PE40可特异性结合癌细胞表面LHRH受体,从而发挥对肿瘤细胞的靶向杀伤作用.
作者：李星；田园；张国利；吴广谋；朱平；岳玉环 刊期： 2012年第05期
目的:运用siRNA抑制肝门部胆管癌QBC939细胞系中人DNA甲基转移酶1(Human DNA methylation transferase 1,hDNMTl)基因的表达,探讨hDNMTI基因沉默后对QBC939细胞抑癌基因p16和RASSFIA去甲基化的影响、初步阐明其机制.方法:根据GenBank中登录的hDNMTl mRNA的核苷酸序列设计并合成发夹式siRNA序列,并以此为模板构建siRNA质粒,经脂质体转染QBC939细胞,通过RT-PCR检测hDNMT1、P16、RASSFIA基因mRNA转录水平；甲基特异性PCR( MSP)检测p16、RA SSFlA基因的甲基化情况；MTT法检测QBC939细胞增殖活力.结果:sihDNMTI可有效抑制QBC939细胞中hDNMT1基因mRNA转录水平,同时上调p16 、RASSFIA抑癌基因mRNA转录水平；sihDNMTi可促进P16、RASSFIA抑癌基因的去甲基化,并抑制QBC939细胞增殖,增殖抑制率在转染后72 h达到峰值.结论:hDNMT基因引起的抑癌基因启动子区异常甲基化是促进肝门部胆管癌发生发展的一个重要因素,抑制hDNMT1基因的表达可促进抑癌基因的去甲基化,为肝门部胆管癌的基因治疗提供了新的思路.
作者：李修红；罗放；向吉锋；王济明 刊期： 2012年第05期
Torque teno病毒是一种与转氨酶升高有关的新型DNA肝炎病毒,以患者名字命名,由于可通过输血传播,也称输血传播病毒(Transfusion transmitted virus,TTV).TTV的ORF1中N22区域大约230 bp的序列(nt1939～2160)为基因分型主要依据.在亚洲、美洲和欧洲等地的一些国家,发现G1型为主要类型,在巴西和韩国等则以G2型为主要类型.正常人群和献血员中都有较高阳性率,中年人群感染率明显高于其他年龄段人群.本文对近几年人类TTV基因型别及流行率的研究进展作一综述.
作者：刘畅；井申荣 刊期： 2012年第05期
目的:探讨狂犬病病毒( Rabies virus,RV )SRV9株糖蛋白(G)333位丝氨酸(S)分别突变为精氨酸(R)和谷氨酸(E)后,对其免疫原性的影响.方法:采用RT-PCR法扩增RV SRV9株G蛋白基因,经测序鉴定正确后,通过PCR将编码糖蛋白333位丝氨酸的核苷酸分别突变为编码精氨酸和谷氨酸的核苷酸,并分别构建复制缺陷型重组人5型腺病毒rAd5-SRV9-G333E、rAd5-SRV9-G333S和rAd5-SRV9-G333R,经形态学观察、RT-PCR检测及直接免疫荧光试验鉴定重组腺病毒,并免疫小鼠,检测小鼠中和抗体水平及阳转率,评价3种重组腺病毒免疫原性的差异.结果:SRV9株G蛋白基因及其突变体经测序鉴定正确；制备的重组腺病毒镜下可见典型的腺病毒外形特征,感染HEK293AD细胞后出现明显的细胞病变；RT-PCR及直接免疫荧光试验结果显示,3种重组腺病毒在HEK293AD细胞中均已成功表达；rAd5-SRV9-G333E诱导小鼠产生的中和抗体效价和阳转率均明显高于rAd5-SRV9-G333S (P＜0.05).结论:RV SRV9株糖蛋白333位丝氨酸突变为谷氨酸后,可显著增强其免疫原性.
作者：孙程龙；杨洋；王颖；宫婷；刘祥义；陈奇；王景龙；刘晔；张守峰；扈荣良 刊期： 2012年第05期
目的:采用响应面法对植物乳杆菌真空干燥保护剂配方进行优化.方法:在单因素试验的基础上,利用响应面法(Response surface method,RSM)中的中心复合设计(Central composite design,CCD)进行试验,通过试验数据拟合得到二阶响应面模型,终确定优实验条件及佳保护剂配比.检测以优化的保护剂配方制备的菌粉的稳定性.结果:优化的保护剂配方为:甘油3.59％,Vc1％,谷氨酸钠2％,L半胱氨酸0.5％,海藻糖15％,蔗糖5％,脱脂乳粉42.82％,玉米淀粉15％,玉米面15％.用此配方保护剂真空干燥样品时,可使菌体存活率达52.86％,与理论预测值(54.18％)较接近.以优化的保护剂配方制备的菌粉于4℃条件下保存12个月,仍有107 cfu/g的活菌量.结论:已优化了植物乳杆菌真空干燥保护剂配方,对植物乳杆菌的应用、活菌产品的质量稳定及新产品的研发均有一定的指导意义.
作者：于长青；姚笛；钱丽丽；孙丽建 刊期： 2012年第05期
目的:研制结核分枝杆菌PCR检测试剂盒国家参考品.方法:将结核分枝杆菌标准株H37Rv、15株结核分枝杆菌临床分离株、10株非结核分枝杆菌标准株和5株非分枝杆菌参考株在各自适宜的培养基和温度下进行培养,收集新鲜且无污染的培养物,采用比浊法制备阳性和阴性参考品用菌液；膜过滤法制备低检出量和精密性(或重复性)参考品用单细胞菌液,并进行活菌计数和显微计数；对低检出量参考品进行冻融试验、加速试验,并对4个厂家的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒进行评价.结果:阳性参考品由l5份结核分枝杆菌菌液组成,阴性参考品由l0份非结核分枝杆菌和5份非分枝杆菌菌液组成,低检出量参考品由103、102、101和100个/ml的结核分枝杆菌(H37Rv)单细胞菌液组成,精密性(或重复性)参考品由10份102个/ml的结核分枝杆菌(H37Rv)单细胞菌液组成.结论:研制的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒国家参考品可用于结核分枝杆菌PCR检测试剂盒的质量控制.
作者：陈保文；沈小兵；苏城；王国治 刊期： 2012年第05期
目的:观察肺表面活性物质蛋白B(Surfactant protein B,SP-B)及成纤维细胞特异性蛋白1(Fibroblast-specific protein 1,FSPl)在支气管肺发育不良(Bronchopulmonary dysplasia,BPD)模型小鼠中的表达情况,探讨肺内上皮-间质转化(Ep-ithelial-mesenchymal transformation,EMT)在BPD中的作用及机制.方法:建立BPD小鼠模型；免疫组化法观察各组小鼠肺组织病理学改变；Masson染色法观察各组小鼠肺组织胶原含量；免疫荧光双标法对EMT进行动态监测；荧光定量PCR法检测SP-B和FSP1基因mRNA的表达水平；体积描述法检测小鼠肺功能改变.结果:与对照组比较,BPD组中浓度氧暴露后,小鼠肺组织逐渐出现肺泡化发育障碍、间隔增厚、胶原沉积明显；给氧14、21d时,BPD组小鼠肺组织出现SP-B和FSP1共表达,而对照组未见共表达；与对照组比较,给氧21d时SP-B基因mRNA表达水平明显下降,FSP1明显升高(P均＜0.05)；与对照组比较,BPD组呼吸频率(F)及潮气量(Tv)均明显降低(P＜0.05).结论:通过EMT机制生成的成纤维细胞是BPD中肺纤维化的重要来源.
作者：刘芳君；邓春；郭春宝；符州 刊期： 2012年第05期
朊病毒是传染性海绵状脑病的感染因子,主要由错误折叠的朊蛋白( PrPsc)组成.朊病毒的复制就是在痕量Prp的催化下,正常朊蛋白( PrPc)向其错误折叠形式的转化.本文介绍的是朊病毒的新型检测方法,即蛋白质错误折叠循环扩增技术(类“PCR”高灵敏度检测方法),这种技术的概念是根据朊病毒的复制原理形成的,其方法类似于DNA通过PCR扩增的方法.本文针对朊病毒“类PCR”高灵敏度检测方法中几个具有代表性意义的技术作一综述.
作者：李莎 刊期： 2012年第05期
目的:观察在旋转振荡培养工艺放大条件下,表达肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(TN FR-Fc)的重组CHO细胞稳定性及其表达产物活性.方法:采用旋转振荡悬浮培养CHO细胞,至对数生长期时,接种不同培养体积(10 ml、250 ml、1.5L),于31℃继续培养,每日取样检测不同培养体积下的细胞密度、细胞活力、融合蛋白浓度；经MabSelect Sure亲和层析柱纯化融合蛋白,采用SDS-PAGE、ElISA、MTT法进行纯化产物的相对分子质量和纯度及结合活性、中和活性的检测.结果:重组CHO细胞在旋转振荡培养条件下,由10 ml放大到1.5L培养体积时,细胞的生长密度、活力及蛋白表达量均相对稳定；纯化的融合蛋白纯度在94％以上,相对分子质量约75 000,可与重组人TNFα特异性结合,其相对亲和力与标准品十分接近,且可中和重组人TNFα的细胞毒效应.结论:明确了表达TNFR-Fc融合蛋白的重组CHO细胞旋转振荡培养工艺放大的可行性,为更大规模发酵生产奠定了基础.
作者：王一婷；雷云；黄鹂；谢奎；杨依丽；陈宝琼；谢秋玲；洪岸；熊盛 刊期： 2012年第05期
目的:分析2009年昆明市无菌性脑膜炎患儿脑脊液埃可病毒6型(ECHO virus 6,E6) KM57-09分离株VPI基因的遗传特征.方法:采用RD、Hep-2细胞对无菌性脑膜炎患儿脑脊液样本进行病毒分离,应用RT-PCR法扩增VP1基因,并进行测序；采用NCBI BLAST软件对所测定的节段序列进行数据库比对；采用Omiga软件对所测定节段序列的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行编辑、比对、拼接；采用Mega4.1软件分析,并与18个参考株的VP1基因序列进行比较.结果:分离株为E6,其VPI区的核苷酸长度与其他E6均为867 bp; KM57-09株与其他E6分离株核苷酸同源性在77.6％-96.0％之间,氨基酸同源性在95.2％～99.0％之间,与山东株2010D0010005核苷酸和氨基酸的同源性高,分别为96.0％和99.0％,与中国其他几种分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.7％～80.9％和95.8％～97.2％；基因进化树分析显示,KM57-09株与山东株2010D0010005株属于同一个进化分枝,与中国其他几种分离株属不同分枝.结论:KM57-09分离株为埃可病毒6型,为中国3个分离株分枝中的一枝.
作者：陈俊英；王湘宜；潘玥；叶君；张名；孙强明；马绍辉 刊期： 2012年第05期
目的:研究羊痒病病毒株(22L)对神经瘤细胞(N2a)的影响,并建立研究朊病毒病的细胞模型.方法:用感染22L的鼠脑匀浆感染正常的N2a细胞,经荧光倒置显微镜、电镜及HE染色对正常细胞和染毒细胞(N2a-22L)的形态和内部结构进行观察,并通过Western blot检测细胞中朊病毒(Prions,PrP(sc))的含量.结果:镜下观察可见,N2a-22L细胞的神经突起较N2a细胞明显增多,并交织成复杂的网状结构；线粒体出现明显的空化,嵴消失；细胞体积减小,细胞核皱缩,细胞间通过突起连在一起,细胞核与细胞质界限模糊.N2a-22L细胞蛋白PrP经PK酶消化后,可见抗PK酶的PrP(sc),N2a细胞的PrP蛋白均能被PK酶消化,表明N2a-22L已稳定感染了22L.结论:N2a-22L细胞可作为研究朊病毒病的细胞模型,为研究朊病毒病发病机制提供了有效途径.
作者：张晓晶；李忠义；万家余；鞠传静；梁斌斌；刘文森；刘林娜；孙玉成；刘晋平；钱军 刊期： 2012年第05期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
