刘良忠；胡建娥；常世川；熊德明；朱川；刘必宽；陈睿；谭建军；李刚
目的:克隆人源抗菌肽( Antimicrobial peptide,AMP)LL-37及其改良体串联体基因,原核表达并纯化重组蛋白.方法:利用生物信息学手段,对人源抗菌肽Ll-37基因序列进行改良设计,合成人源抗菌肽LL-37及其改良体基因片段,经重叠延伸PCR获得人源抗菌肽LL-37及其改良体串联体基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-dLL-37,转化大肠杆菌BL21( DE3 )pLysS,IPTG诱导表达,Tricine SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式,镍金属螯合亲和层析纯化重组蛋白.结果:改良后的人源抗菌肽LL-37的等电点、稳定性及其在大肠杆菌中的半衰期均显著提高；重组表达质粒pET-28a-dLL-37经测序鉴定构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为11000,主要以包涵体形式存在；纯化的重组蛋白纯度可达95％,浓度为0.473mg/ml.结论:已成功在大肠杆菌中表达并纯化了人源抗菌肽LL-37及其改良体串联体,为其后续生物学活性的研究奠定了基础.
作者：杨浩；姚海燕；陈圆圆；阎波；郭鹏；马驰；韩跃武 刊期： 2012年第05期
目的:建立放射致小鼠骨髓细胞损伤与衰老模型.方法:取50只小鼠,随机分为对照组和4.0、6.5、8.5和10.5 Gy不同剂量照射实验组,观察小鼠30d存活率.另取20只小鼠,分别于6.5Gy照射后第1、3、7和30天检测外周血血常规及骨髓单个核细胞( Mononuclear cells,MNCs)数的变化,观察骨髓造血细胞大小及形态并计数集落数量,流式细胞仪检测骨髓MNCs凋亡情况,采用衰老相关的β-半乳糖苷酶( Senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal)染色法检测SA-β-gal活性,细胞免疫荧光法分析p16Ink4a蛋白的表达水平.结果:小鼠30d存活率对照组和4.0Gy实验组均为100％,6.5Gy实验组为80％,8.5及10.5 Gy实验组均为0.6.5Gy一次性全身照射后第1、3、7、30d,小鼠外周血白细胞、血小板、骨髓MNCs数、CFU数量均下降,以照射后第3天明显,第7天开始恢复正常；照射后骨髓MNCs凋亡率与对照组[(7.32±1.87)％]相比,均明显升高(P＜0.05),第3天高[(35.71±0.30)％],随时间的延长凋亡率逐渐下降；SA-β-gal染色和细胞免疫荧光染色结果显示,照射后阳性细胞率与对照组比较,均明显升高(P＜0.05),以第3天高,随时间延长逐渐降低.结论:以6.5Gy照射,可建立小鼠的骨髓造血细胞损伤与衰老模型,为进一步筛选抗骨髓抑制的药物奠定了基础.
作者：闫玲玲；姜蓉；李春莉；左国伟；高焕庆；陈地龙；龙轩；王建伟 刊期： 2012年第05期
朊病毒是传染性海绵状脑病的感染因子,主要由错误折叠的朊蛋白( PrPsc)组成.朊病毒的复制就是在痕量Prp的催化下,正常朊蛋白( PrPc)向其错误折叠形式的转化.本文介绍的是朊病毒的新型检测方法,即蛋白质错误折叠循环扩增技术(类“PCR”高灵敏度检测方法),这种技术的概念是根据朊病毒的复制原理形成的,其方法类似于DNA通过PCR扩增的方法.本文针对朊病毒“类PCR”高灵敏度检测方法中几个具有代表性意义的技术作一综述.
作者：李莎 刊期： 2012年第05期
目的:探讨触珠蛋白(Haptoglobin,Hp)在急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)患者血清中的表达情况,为该疾病的诊断与治疗提供新思路.方法:收集30例确诊的AMI患者和30例体检证实为健康人群组的血清,去除血清高丰度蛋白后,采用双向电泳(2-DE)分离血清蛋白,获得的电泳图谱经ImageMaster5.00软件分析,差异明显的蛋白点经胶内酶解后,行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption-ionization-time of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析,检测Hp的表达.结果:AMI患者与健康人群组血清的电泳图谱相似；MALDI-TOF-MS分析显示,AMI患者血清中Hp表达量明显高于健康人群组(P＜0.05).结论:Hp在AMI患者血清中表达量升高,其有望成为AMI患者的特异性诊断标记物.
作者：范晓卿；周义文；秦晓林；何咏婷；刘银河；王毅；涂植光 刊期： 2012年第05期
目的:紫外诱变提高地衣芽孢杆菌的产蛋白酶能力.方法:紫外线照射法诱变地衣芽孢杆菌,绘制诱变曲线,确定紫外诱变条件.采用福林酚法测定酶活力,经初筛和复筛筛选蛋白酶高产菌株,并对所选育的高产菌株进行遗传稳定性研究.结果:佳紫外线照射时间确定为120s,菌落的总致死率为65.58％;经过初筛和复筛,选育出蛋白酶高产菌株B-14,蛋白酶活力为2 922.90U/ml,比出发菌株B提高了23.81％;B-14菌株经5次传代,其蛋白酶活力在2 754.27～3 203.95U/ml之间,变化范围不超过10％.结论:该实验成功选育出遗传性能稳定的蛋白酶高产菌株B-14.
作者：王长远；罗梦晓 刊期： 2012年第05期
目的:分析2009年昆明市无菌性脑膜炎患儿脑脊液埃可病毒6型(ECHO virus 6,E6) KM57-09分离株VPI基因的遗传特征.方法:采用RD、Hep-2细胞对无菌性脑膜炎患儿脑脊液样本进行病毒分离,应用RT-PCR法扩增VP1基因,并进行测序；采用NCBI BLAST软件对所测定的节段序列进行数据库比对；采用Omiga软件对所测定节段序列的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行编辑、比对、拼接；采用Mega4.1软件分析,并与18个参考株的VP1基因序列进行比较.结果:分离株为E6,其VPI区的核苷酸长度与其他E6均为867 bp; KM57-09株与其他E6分离株核苷酸同源性在77.6％-96.0％之间,氨基酸同源性在95.2％～99.0％之间,与山东株2010D0010005核苷酸和氨基酸的同源性高,分别为96.0％和99.0％,与中国其他几种分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.7％～80.9％和95.8％～97.2％；基因进化树分析显示,KM57-09株与山东株2010D0010005株属于同一个进化分枝,与中国其他几种分离株属不同分枝.结论:KM57-09分离株为埃可病毒6型,为中国3个分离株分枝中的一枝.
作者：陈俊英；王湘宜；潘玥；叶君；张名；孙强明；马绍辉 刊期： 2012年第05期
目的:对我国现用风疹病毒(Rubella virus,RV)疫苗生产毒株松叶株(Matsuba)进行全基因组测序,分析其在减毒过程中的遗传与变异特点,为其安全性评价及遗传学质量控制的标准化提供依据.方法:利用RT-PCR法分段扩增我国现用Matsuba疫苗株主代种子基因组全序列,分别将产物插入到T-A克隆载体pGEM-T easy中,构建病毒cDNA文库,进行全基因组序列测定与分析.结果:我国现用Matsuba疫苗株主代种子基因组全长9762nt,含2个ORF,分别位于核苷酸41～6388位和6512～9700位,编码2116、1062个氨基酸；与GenBank中登录的Matsuba.GMK3野毒株和Matsuba疫苗株核苷酸同源性分别为97.5％和99.9％,氨基酸同源性分别为98.8％和99.9％；其在减毒的过程中共有37个氨基酸位点发生变异,其中非结构蛋白P150有18个氨基酸位点发生突变,结构:蛋白El和E2主要抗原位点氨基酸末发生变异,E1-177位糖基化位点突变丢失.结论:我国现用风疹病毒Matsuba疫苗株与同类减毒株具有较高的同源性,其主要的抗原位点在减毒保种过程中高度保守,为在分子水平上保证Matsuba株毒种及其生产疫苗的安全性提供了依据.
作者：刘晨鸣；冯德杰；赵雅静；魏然；魏至栋；高雪军；朱莉萍 刊期： 2012年第05期
目的:采用响应面法对植物乳杆菌真空干燥保护剂配方进行优化.方法:在单因素试验的基础上,利用响应面法(Response surface method,RSM)中的中心复合设计(Central composite design,CCD)进行试验,通过试验数据拟合得到二阶响应面模型,终确定优实验条件及佳保护剂配比.检测以优化的保护剂配方制备的菌粉的稳定性.结果:优化的保护剂配方为:甘油3.59％,Vc1％,谷氨酸钠2％,L半胱氨酸0.5％,海藻糖15％,蔗糖5％,脱脂乳粉42.82％,玉米淀粉15％,玉米面15％.用此配方保护剂真空干燥样品时,可使菌体存活率达52.86％,与理论预测值(54.18％)较接近.以优化的保护剂配方制备的菌粉于4℃条件下保存12个月,仍有107 cfu/g的活菌量.结论:已优化了植物乳杆菌真空干燥保护剂配方,对植物乳杆菌的应用、活菌产品的质量稳定及新产品的研发均有一定的指导意义.
作者：于长青；姚笛；钱丽丽；孙丽建 刊期： 2012年第05期
目的:探讨狂犬病病毒( Rabies virus,RV )SRV9株糖蛋白(G)333位丝氨酸(S)分别突变为精氨酸(R)和谷氨酸(E)后,对其免疫原性的影响.方法:采用RT-PCR法扩增RV SRV9株G蛋白基因,经测序鉴定正确后,通过PCR将编码糖蛋白333位丝氨酸的核苷酸分别突变为编码精氨酸和谷氨酸的核苷酸,并分别构建复制缺陷型重组人5型腺病毒rAd5-SRV9-G333E、rAd5-SRV9-G333S和rAd5-SRV9-G333R,经形态学观察、RT-PCR检测及直接免疫荧光试验鉴定重组腺病毒,并免疫小鼠,检测小鼠中和抗体水平及阳转率,评价3种重组腺病毒免疫原性的差异.结果:SRV9株G蛋白基因及其突变体经测序鉴定正确；制备的重组腺病毒镜下可见典型的腺病毒外形特征,感染HEK293AD细胞后出现明显的细胞病变；RT-PCR及直接免疫荧光试验结果显示,3种重组腺病毒在HEK293AD细胞中均已成功表达；rAd5-SRV9-G333E诱导小鼠产生的中和抗体效价和阳转率均明显高于rAd5-SRV9-G333S (P＜0.05).结论:RV SRV9株糖蛋白333位丝氨酸突变为谷氨酸后,可显著增强其免疫原性.
作者：孙程龙；杨洋；王颖；宫婷；刘祥义；陈奇；王景龙；刘晔；张守峰；扈荣良 刊期： 2012年第05期
目的:分别采用简化法与传统方法进行淋巴细胞胞内细胞因子染色,通过流式细胞术检测比较两种方法的染色效果.方法:取健康志愿者外周血,分离外周血单个核细胞(PBMC),分别经佛波酯(Phorbol myristate acetate,PMA)、离子霉素( Ionomycint,Ion)和莫能霉素(Monensin)刺激4h,分别以传统法(细胞刺激后进行表面染色,再固定,破膜,行细胞内染色)和简化法(细胞刺激后直接固定、破膜,在不同时间段进行膜上膜内同时染色)进行细胞内染色.样本经抗体标记后,采用流式细胞术检测淋巴细胞的百分率.结果:简化法染色检测Th1细胞的百分比与传统染色方法相比,差异无统计学意义(P＞0.05)；而简化法染色检测Th17细胞的百分比明显高于传统方法(P＜0.05).与传统法比较,应用简化法,细胞于破膜后固定0、48、96 h染色,检测Th2细胞的百分比差异无统计学意义(P＞0.05).结论:简化法简化了操作流程,有利于流式细胞术的质控,可替代传统染色方法进行淋巴细胞胞内细胞因子染色.
作者：刘良忠；胡建娥；常世川；熊德明；朱川；刘必宽；陈睿；谭建军；李刚 刊期： 2012年第05期
目的:观察β-丙内酯对甲型肝炎病毒(HAV)的灭活效应.方法:采用1∶4000的β-丙内酯和甲醛,分别对HAV进行灭活试验.通过病毒滴度检测及病毒灭活效果验证,确定佳灭活时间；检测两种灭活剂对HAV抗原滴度和免疫原性的影响以及对小鼠和豚鼠的毒性反应.结果:β-丙内酯灭活10 h及甲醛灭活3d后,检测不出病毒；β-丙内酯作用24 h可将病毒完全灭活,比甲醛灭活12d效果更好；两种灭活剂灭活不同时间的HAV抗原滴度保持不变,均为1∶640EU/0.1ml；免疫小鼠28 d后,抗-HAV均呈阳性,阳转率达到100％,且对小鼠及豚鼠均无毒性.结论:β-丙内酯直接作用于病毒核酸基因,使HAV失去活性而保持其免疫原性.
作者：蒋建江；威凤春；胡艳灵；潘翔；陈统球 刊期： 2012年第05期
目的:建立优化重组Kringle5蛋白发酵工艺.方法:应用高密度发酵法建立并优化含Kringle5表达载体的工程菌的发酵技术,采用紫外分光光度计检测菌体密度(A600),称量菌体干重,并经SDS-PAGE检测Kring]e5蛋白表达量.结果:重组Kringle5蛋白工程菌高密度发酵的优化条件为:BP-5菌种,2×YT培养基,30°C基础培养时间7h,42℃诱导培养时间6h,pH值为7.0,空气流量为lvvm,溶氧控制大于50％,搅拌转速控制为800～1 200 r/min;目的蛋白占全菌总蛋白的38.4％,菌体干重达( 14.28±0.1i)g/L.结论:已建立并优化了重组Kringle5蛋白的高密度发酵工艺,为其新药开发奠定了技术基础.
作者：陈显久；杨利军；解军；张悦红；牛勃 刊期： 2012年第05期
目的:探讨发酵糙米提取物对高血脂大鼠血脂、肝脏脂类含量及抗氧化能力的影响.方法:建立Wistar大鼠高血脂模型,通过灌胃不同剂的发酵糙米提取物[100和300mg/(kg·d)],观察对高血脂大鼠总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯( Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)、动脉硬化指数( Atherosclerotic index,AI)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)等生化指标的影响.结果:发酵糙米提取物可显著降低高血脂大鼠血清及肝脏中TC、TG、LDL浓度和AI值,提高HDl浓度；增加血清和肝脏中GSH-Px和SOD的浓度,降低MDA的浓度.结论:发酵糙米提取物对高血脂大鼠血清和肝脏的血脂水平具有良好的调节作用,且可提高抗氧化效果.
作者：戴凌燕；李志江；王欣；李娟；关琛；李良玉；周世珠 刊期： 2012年第05期
手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是世界范围内流行的儿童传染病,曾在亚太地区出现过多次大规模的暴发和流行,肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus A16,CA16)是引起该病的两种主要病原.尽管这两种病毒在遗传学上关系很近,但其感染在临床表现和体征方面均存在一定差异,这种差异是源于病毒基因组的不同,还是由遗传表型特性所致,是值得研究的课题.本文就二者的特征及感染后宿主的细胞反应和比较蛋白质组学研究进行综述.
作者：张文慧；井申荣 刊期： 2012年第05期
目的:运用siRNA抑制肝门部胆管癌QBC939细胞系中人DNA甲基转移酶1(Human DNA methylation transferase 1,hDNMTl)基因的表达,探讨hDNMTI基因沉默后对QBC939细胞抑癌基因p16和RASSFIA去甲基化的影响、初步阐明其机制.方法:根据GenBank中登录的hDNMTl mRNA的核苷酸序列设计并合成发夹式siRNA序列,并以此为模板构建siRNA质粒,经脂质体转染QBC939细胞,通过RT-PCR检测hDNMT1、P16、RASSFIA基因mRNA转录水平；甲基特异性PCR( MSP)检测p16、RA SSFlA基因的甲基化情况；MTT法检测QBC939细胞增殖活力.结果:sihDNMTI可有效抑制QBC939细胞中hDNMT1基因mRNA转录水平,同时上调p16 、RASSFIA抑癌基因mRNA转录水平；sihDNMTi可促进P16、RASSFIA抑癌基因的去甲基化,并抑制QBC939细胞增殖,增殖抑制率在转染后72 h达到峰值.结论:hDNMT基因引起的抑癌基因启动子区异常甲基化是促进肝门部胆管癌发生发展的一个重要因素,抑制hDNMT1基因的表达可促进抑癌基因的去甲基化,为肝门部胆管癌的基因治疗提供了新的思路.
作者：李修红；罗放；向吉锋；王济明 刊期： 2012年第05期
目的:研制结核分枝杆菌PCR检测试剂盒国家参考品.方法:将结核分枝杆菌标准株H37Rv、15株结核分枝杆菌临床分离株、10株非结核分枝杆菌标准株和5株非分枝杆菌参考株在各自适宜的培养基和温度下进行培养,收集新鲜且无污染的培养物,采用比浊法制备阳性和阴性参考品用菌液；膜过滤法制备低检出量和精密性(或重复性)参考品用单细胞菌液,并进行活菌计数和显微计数；对低检出量参考品进行冻融试验、加速试验,并对4个厂家的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒进行评价.结果:阳性参考品由l5份结核分枝杆菌菌液组成,阴性参考品由l0份非结核分枝杆菌和5份非分枝杆菌菌液组成,低检出量参考品由103、102、101和100个/ml的结核分枝杆菌(H37Rv)单细胞菌液组成,精密性(或重复性)参考品由10份102个/ml的结核分枝杆菌(H37Rv)单细胞菌液组成.结论:研制的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒国家参考品可用于结核分枝杆菌PCR检测试剂盒的质量控制.
作者：陈保文；沈小兵；苏城；王国治 刊期： 2012年第05期
目的:构建乙型肝炎病毒HBx基因shRNA真核表达质粒,并筛选能有效抑制HBx表达的干扰序列.方法:设计并构建针对HBx基因的3个siRNA表达质粒,经酶切和DNA测序鉴定,转染HepG2.2.15细胞,荧光显微镜观察细胞转染效率,RT-PCR检测HepG2.2.15细胞中HBx基因mRNA的转录水平,Western blot检测HepG2.2.15细胞中HBx蛋白的表达水平.结果:酶切和测序鉴定质粒构建正确,插入片段的碱基序列符合实验设计；质粒转染HepG2.2.15细胞后,HBx基因的转录水平、相对表达量及HBx蛋白的表达水平均明显降低(P均＜0.01),3个重组质粒均能抑制HBx蛋白的表达,且质粒shRNA-HBx3抑制能力强.结论:已成功构建了靶向HBx基因的shRNA真核表达质粒,并筛选出具有高效沉默HBx基因的shRNA质粒,为进一步研究HBx感染合并肝细胞脂肪变性的发生发展奠定了基础.
作者：张琴；彭俊；沈薇 刊期： 2012年第05期
目的:观察在旋转振荡培养工艺放大条件下,表达肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(TN FR-Fc)的重组CHO细胞稳定性及其表达产物活性.方法:采用旋转振荡悬浮培养CHO细胞,至对数生长期时,接种不同培养体积(10 ml、250 ml、1.5L),于31℃继续培养,每日取样检测不同培养体积下的细胞密度、细胞活力、融合蛋白浓度；经MabSelect Sure亲和层析柱纯化融合蛋白,采用SDS-PAGE、ElISA、MTT法进行纯化产物的相对分子质量和纯度及结合活性、中和活性的检测.结果:重组CHO细胞在旋转振荡培养条件下,由10 ml放大到1.5L培养体积时,细胞的生长密度、活力及蛋白表达量均相对稳定；纯化的融合蛋白纯度在94％以上,相对分子质量约75 000,可与重组人TNFα特异性结合,其相对亲和力与标准品十分接近,且可中和重组人TNFα的细胞毒效应.结论:明确了表达TNFR-Fc融合蛋白的重组CHO细胞旋转振荡培养工艺放大的可行性,为更大规模发酵生产奠定了基础.
作者：王一婷；雷云；黄鹂；谢奎；杨依丽；陈宝琼；谢秋玲；洪岸；熊盛 刊期： 2012年第05期
目的:构建狂犬病病毒( Rabies virus,RV) SRV9株糖蛋白(Glycoprotein)基因的重组伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV),并进行鉴定.方法:将SRV9株糖蛋白基因表达盒和报告基因Lac Z表达盒克隆至转移载体p8AA中,构建转移质粒p8AA-LacZ-G,与PRV Bartha-K61株基因组共转染BHK-21细胞,待细胞发生病变后,收集病毒液,进行多轮蓝色噬斑筛选,获得重组病毒rPRV-LacZ-G,对其进行电镜观察、PCR及Western blot鉴定,并测定重组病毒的滴度.结果:酶切及测序鉴定证实,转移质粒p8AA-LacZ-G构建正确；电镜观察显示,重组病毒rPRV-LacZ-G呈典型的PRV特征结构；PCR分析显示可见RV 1 790 bp的特异性条带；Western blot显示,重组病毒可与SRV9株糖蛋白单抗发生反应,形成特异条带；经测定,重组病毒的滴度为106.25 TCID50/ml.较Bartha-K61亲本株的滴度(107 TCID50/ml)下降.结论:成功构建了RV SRV9株糖蛋白基凶重组PRV rPRV-LacZ-G,为其应用于兽用狂犬病疫苗的开发奠定了基础.
作者：李业伟；杨洋；刘晔；王景龙；孙程龙；韩乃君；刘祥义；扈荣良 刊期： 2012年第05期
目的:全面检定GX1-rmhTNFα工程菌,并建立稳定的发酵及纯化工艺.方法:对GX1-rmhTNFα工程菌进行全面检定,挑取目的蛋白表达水平高的菌种扩大培养；采用5L发酵罐,32℃培养工程菌至菌体A600值达4～6时,42℃诱导约4h后收菌,发酵过程控制pH值在7.2,溶氧在30％左右,采用梯度流加的方法补料,连续发酵3批,验证发酵工艺的稳定性；发酵产物经硫酸铵分段盐析及透析处理后,经SP-Sepharose FF及Q-Sepharose FF层析纯化,收集洗脱峰进行纯度、浓度、活性及Western blot分析.结果:工程菌经全面检定,证实构建正确,目的蛋白表达量不低于10％,菌种稳定性较好,呈典型的大肠杆菌特征,适合建立工程菌菌库；连续发酵3批,湿菌收量均不低于200g,目的蛋白表达水平均在10％以上；目的蛋白经柱层析纯化,终纯化产物蛋白含量为0.901mg/ml,活性为5.97x108IU/ml,纯度可达95％以上,Western blot分析显示,目的蛋白可与鼠抗人TNF单抗特异性结合.结论:初步建立了稳定可行的GX1-rmhTNFα融合蛋白的发酵及纯化工艺.
作者：肖佳佳；吴守振；薛晓静；吴开春 刊期： 2012年第05期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
