于长青；姚笛；钱丽丽；孙丽建
目的:探讨重组促性腺激素释放激素-绿脓杆菌外毒素A(Luteinizing hormone releasing hormone-pseudomonmexotoxin A,LHRH-PE40)与肿瘤细胞和正常细胞膜表面受体特异性结合的差异.方法:常规培养Hep-2、A549及LO2细胞,通过细胞毒性试验观察LHRH-PE4.0对3种细胞的形态学影响及生长抑制作用；通过LHRH-Pe40与LHRH受体的结合试验及LHRH对LHRH-PE40竞争性抑制试验,测定LHRH-PE40在不同J细胞中膜表面受体结合的差异.结果:LHRH-PE40对Hep-2、A549细胞具有明显的杀伤作用,细胞收缩变圆,色暗,折光性差,裂解死亡,杀伤作用随LHRH-PE40浓度的增大而增强,IC50值分别为0.45和0.19 μmol/L,而对LO2细胞毒性作用较弱；LHRH-PE40可与Hep-2和A549细胞受体结合密切,A490值较高,与两种细胞的结合力随着时间的延长而增加,与LO2细胞结合较弱；LHRH可以竞争性拮抗抑制LHRH-PE40与Hep-2、A549细胞的结合,结合力随着LHRH浓度的增高而递减,对LHRH-PE40和LO2细胞结合影响较小.结论:LHRH-PE40可特异性结合癌细胞表面LHRH受体,从而发挥对肿瘤细胞的靶向杀伤作用.
作者：李星；田园；张国利；吴广谋；朱平；岳玉环 刊期： 2012年第05期
Torque teno病毒是一种与转氨酶升高有关的新型DNA肝炎病毒,以患者名字命名,由于可通过输血传播,也称输血传播病毒(Transfusion transmitted virus,TTV).TTV的ORF1中N22区域大约230 bp的序列(nt1939～2160)为基因分型主要依据.在亚洲、美洲和欧洲等地的一些国家,发现G1型为主要类型,在巴西和韩国等则以G2型为主要类型.正常人群和献血员中都有较高阳性率,中年人群感染率明显高于其他年龄段人群.本文对近几年人类TTV基因型别及流行率的研究进展作一综述.
作者：刘畅；井申荣 刊期： 2012年第05期
目的:分别采用简化法与传统方法进行淋巴细胞胞内细胞因子染色,通过流式细胞术检测比较两种方法的染色效果.方法:取健康志愿者外周血,分离外周血单个核细胞(PBMC),分别经佛波酯(Phorbol myristate acetate,PMA)、离子霉素( Ionomycint,Ion)和莫能霉素(Monensin)刺激4h,分别以传统法(细胞刺激后进行表面染色,再固定,破膜,行细胞内染色)和简化法(细胞刺激后直接固定、破膜,在不同时间段进行膜上膜内同时染色)进行细胞内染色.样本经抗体标记后,采用流式细胞术检测淋巴细胞的百分率.结果:简化法染色检测Th1细胞的百分比与传统染色方法相比,差异无统计学意义(P＞0.05)；而简化法染色检测Th17细胞的百分比明显高于传统方法(P＜0.05).与传统法比较,应用简化法,细胞于破膜后固定0、48、96 h染色,检测Th2细胞的百分比差异无统计学意义(P＞0.05).结论:简化法简化了操作流程,有利于流式细胞术的质控,可替代传统染色方法进行淋巴细胞胞内细胞因子染色.
作者：刘良忠；胡建娥；常世川；熊德明；朱川；刘必宽；陈睿；谭建军；李刚 刊期： 2012年第05期
目的:构建组氨酸( Histidine)位点突变的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)突变体,并检测其感染性.方法:利用定点突变技术,分别将HCV包膜蛋白E2第490位和第621位的组氨酸突变为丙氨酸(Alanine),构建突变质粒H490A和H621A,采用T7体外转录法制备病毒RNA,通过电穿孔法导入Huh7.5.1细胞,免疫荧光法检测病毒蛋白的表达、电穿孔效率及细胞培养上清的感染性.结果:H490A和H621A突变型质粒经酶切及测序鉴定构建正确；体外转录获得的野生型与突变型病毒RNA均能在Huh7.5.1细胞中表达病毒蛋白,电穿孔效率高达90％以上；野生型病毒感染细胞培养上清中可检测到HCV阳性细胞,H490A病毒感染细胞培养上清中的阳性细胞数量比野生型明显减少,H621A病毒感染细胞培养上清中未检测到阳性细胞.结论:成功构建了组氨酸位点突变的全长表达质粒H490A和H621A,两种突变体病毒的感染性均显著降低.
作者：刘霜；鞠鹤鹏；戚中田；边中启；秦照玲 刊期： 2012年第05期
目的:克隆人源抗菌肽( Antimicrobial peptide,AMP)LL-37及其改良体串联体基因,原核表达并纯化重组蛋白.方法:利用生物信息学手段,对人源抗菌肽Ll-37基因序列进行改良设计,合成人源抗菌肽LL-37及其改良体基因片段,经重叠延伸PCR获得人源抗菌肽LL-37及其改良体串联体基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-dLL-37,转化大肠杆菌BL21( DE3 )pLysS,IPTG诱导表达,Tricine SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式,镍金属螯合亲和层析纯化重组蛋白.结果:改良后的人源抗菌肽LL-37的等电点、稳定性及其在大肠杆菌中的半衰期均显著提高；重组表达质粒pET-28a-dLL-37经测序鉴定构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为11000,主要以包涵体形式存在；纯化的重组蛋白纯度可达95％,浓度为0.473mg/ml.结论:已成功在大肠杆菌中表达并纯化了人源抗菌肽LL-37及其改良体串联体,为其后续生物学活性的研究奠定了基础.
作者：杨浩；姚海燕；陈圆圆；阎波；郭鹏；马驰；韩跃武 刊期： 2012年第05期
目的:采用HPLC法测定重组人干扰素α2b注射液中吐温80的含量.方法:按设置的色谱条件对检测重组人干扰素α2b注射液中吐温80含量的HPLC方法进行专属性验证、系统适应性验证、线性范围测定、实验内重复性验证、日间重复性验证、低检测限测定、准确性验证,并对3批重组人干扰素α2b注射液中吐温80的含量进行检测.结果:该测定方法具有专属性；系统适应性良好；线性范围为0.03125～2.5mg/ml,R2=0.9997,线性关系良好；实验内重复性,峰面积和浓度的RSD值分别为0.71％和0.56％；日间重复性,保留时间和峰面积的RSD值分别为0.47％和2.76％；低检测限为10mg/L;加样同收率分别为101.99％、99.96％和102.2％,RSD=1.16％；3批人干扰素α2b注射液中吐温80的相对含量分别为0.940、0.936和0.950 mg/ml,分别为标示量的94.0％、93.6％和95.0％.结论:本方法准确、快速、可靠,可用于重组人干扰素α2b注射液中吐温80含量的测定.
作者：赵辉；李增礼；周乐春；储成风；倪晓燕；王荣海；宋礼华 刊期： 2012年第05期
朊病毒是传染性海绵状脑病的感染因子,主要由错误折叠的朊蛋白( PrPsc)组成.朊病毒的复制就是在痕量Prp的催化下,正常朊蛋白( PrPc)向其错误折叠形式的转化.本文介绍的是朊病毒的新型检测方法,即蛋白质错误折叠循环扩增技术(类“PCR”高灵敏度检测方法),这种技术的概念是根据朊病毒的复制原理形成的,其方法类似于DNA通过PCR扩增的方法.本文针对朊病毒“类PCR”高灵敏度检测方法中几个具有代表性意义的技术作一综述.
作者：李莎 刊期： 2012年第05期
目的:制备马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)2个亚型的单克隆抗体,并进行鉴定.方法:将马流感病毒甲1型A/equine/布拉格/56 H7N7(简称H7N7)和马流感病毒甲2型A/equine/miami/63 H3N8(简称H3N8)分别接种SPF鸡胚,收获尿囊液,纯化后免疫BALB/c小鼠,取脾细胞,与SP2/0细胞进行融合,筛选阳性杂交瘤细胞,采用细胞培养法和体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定.结果:筛选出能稳定分泌EIV H7N7单抗和H3N8单抗的杂交瘤细胞各2株,分别命名为3C2-B2、2B7-3A7和5G10-G12、5A10-2E3-2G4.3C2-B2分泌的单抗重链为IgM,轻链为k链,细胞培养上清和腹水中抗体效价分别为1∶512和1∶262 144;5G10-G12分泌的单抗重链为LgG2a,轻链为k链,细胞培养上清和腹水中抗体效价分别为1∶1 024和1∶1 048 576.2个亚型的单抗均具有良好的特异性.获得的杂交瘤细胞株连续培养2个月,培养上清中的抗体效价保持不变；冻存1个月复苏后,培养上清中的抗体效价接近原始值.结论:成功制备了EIV 2个亚型的单克隆抗体,为进一步研制EIV快速分型特异性诊断试剂及治疗制剂奠定了基础.
作者：肖成蕊；王作友；宋战昀；孟庆峰；孟日增；王楠 刊期： 2012年第05期
目的:研制结核分枝杆菌PCR检测试剂盒国家参考品.方法:将结核分枝杆菌标准株H37Rv、15株结核分枝杆菌临床分离株、10株非结核分枝杆菌标准株和5株非分枝杆菌参考株在各自适宜的培养基和温度下进行培养,收集新鲜且无污染的培养物,采用比浊法制备阳性和阴性参考品用菌液；膜过滤法制备低检出量和精密性(或重复性)参考品用单细胞菌液,并进行活菌计数和显微计数；对低检出量参考品进行冻融试验、加速试验,并对4个厂家的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒进行评价.结果:阳性参考品由l5份结核分枝杆菌菌液组成,阴性参考品由l0份非结核分枝杆菌和5份非分枝杆菌菌液组成,低检出量参考品由103、102、101和100个/ml的结核分枝杆菌(H37Rv)单细胞菌液组成,精密性(或重复性)参考品由10份102个/ml的结核分枝杆菌(H37Rv)单细胞菌液组成.结论:研制的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒国家参考品可用于结核分枝杆菌PCR检测试剂盒的质量控制.
作者：陈保文；沈小兵；苏城；王国治 刊期： 2012年第05期
目的:分析2009年昆明市无菌性脑膜炎患儿脑脊液埃可病毒6型(ECHO virus 6,E6) KM57-09分离株VPI基因的遗传特征.方法:采用RD、Hep-2细胞对无菌性脑膜炎患儿脑脊液样本进行病毒分离,应用RT-PCR法扩增VP1基因,并进行测序；采用NCBI BLAST软件对所测定的节段序列进行数据库比对；采用Omiga软件对所测定节段序列的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行编辑、比对、拼接；采用Mega4.1软件分析,并与18个参考株的VP1基因序列进行比较.结果:分离株为E6,其VPI区的核苷酸长度与其他E6均为867 bp; KM57-09株与其他E6分离株核苷酸同源性在77.6％-96.0％之间,氨基酸同源性在95.2％～99.0％之间,与山东株2010D0010005核苷酸和氨基酸的同源性高,分别为96.0％和99.0％,与中国其他几种分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.7％～80.9％和95.8％～97.2％；基因进化树分析显示,KM57-09株与山东株2010D0010005株属于同一个进化分枝,与中国其他几种分离株属不同分枝.结论:KM57-09分离株为埃可病毒6型,为中国3个分离株分枝中的一枝.
作者：陈俊英；王湘宜；潘玥；叶君；张名；孙强明；马绍辉 刊期： 2012年第05期
目的:建立一种直接用于PCR反应的芽胞杆菌基因组DNA提取的改良方法.方法:用十六烷基三甲基溴化铵(Cetyhrimethyl ammonium bromide,CTAB)-溶菌酶-冻融裂解法提取蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、纳豆芽胞杆菌基因组DNA,用紫外分光光度计测定提取的基因组DNA在230、260、280 nm波长下的A值,计算DNA浓度,并以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增.结果:采用改良CTAB法提取的基因组DNA A260/A280值均在1.8～2.0之间,A206/A230值均大于2.0,DNA浓度均大于110 μg/ml;PCR扩增产物均可见1 500 bp的清晰条带,浓度较高,未见其他特异条带.结论:CTAB-溶菌酶-冻融裂解法提取芽胞杆菌基因组DNA简单、高效,并可用于PCR反应,适用于临床分子生物学检验.
作者：胥振国；蔡玉华；袁星；刘修树；江昌俊 刊期： 2012年第05期
目的:采用响应面法对植物乳杆菌真空干燥保护剂配方进行优化.方法:在单因素试验的基础上,利用响应面法(Response surface method,RSM)中的中心复合设计(Central composite design,CCD)进行试验,通过试验数据拟合得到二阶响应面模型,终确定优实验条件及佳保护剂配比.检测以优化的保护剂配方制备的菌粉的稳定性.结果:优化的保护剂配方为:甘油3.59％,Vc1％,谷氨酸钠2％,L半胱氨酸0.5％,海藻糖15％,蔗糖5％,脱脂乳粉42.82％,玉米淀粉15％,玉米面15％.用此配方保护剂真空干燥样品时,可使菌体存活率达52.86％,与理论预测值(54.18％)较接近.以优化的保护剂配方制备的菌粉于4℃条件下保存12个月,仍有107 cfu/g的活菌量.结论:已优化了植物乳杆菌真空干燥保护剂配方,对植物乳杆菌的应用、活菌产品的质量稳定及新产品的研发均有一定的指导意义.
作者：于长青；姚笛；钱丽丽；孙丽建 刊期： 2012年第05期
目的:构建Runx3基因shRNA重组表达质粒,并检测其干扰作用.方法:人工合成靶向Runx3基因的shRNA序列,克隆至pGenesil-1.1表达载体上,构建重组表达质粒Runx3-shRNA,转染人耐药肝癌HepG2细胞；采用半定量RT-PCR及Western blot法检测重组表达质粒对HepC2细胞中Runx3基因的转录和表达水平的影响.结果:重组表达质粒Runx3-shRNA经酶切及测序证明构建正确；其转染人耐药肝癌HepG2细胞后,细胞Runx3基因的转录和蛋白表达水平均明显降低,与空白对照组和阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:已成功构建了Runx3-shRNA表达质粒,为进一步研究Runx3基因在肿瘤耐药细胞中的作用奠定了基础.
作者：郭元红；陈伟庆；房殿亮 刊期： 2012年第05期
目的:观察肺表面活性物质蛋白B(Surfactant protein B,SP-B)及成纤维细胞特异性蛋白1(Fibroblast-specific protein 1,FSPl)在支气管肺发育不良(Bronchopulmonary dysplasia,BPD)模型小鼠中的表达情况,探讨肺内上皮-间质转化(Ep-ithelial-mesenchymal transformation,EMT)在BPD中的作用及机制.方法:建立BPD小鼠模型；免疫组化法观察各组小鼠肺组织病理学改变；Masson染色法观察各组小鼠肺组织胶原含量；免疫荧光双标法对EMT进行动态监测；荧光定量PCR法检测SP-B和FSP1基因mRNA的表达水平；体积描述法检测小鼠肺功能改变.结果:与对照组比较,BPD组中浓度氧暴露后,小鼠肺组织逐渐出现肺泡化发育障碍、间隔增厚、胶原沉积明显；给氧14、21d时,BPD组小鼠肺组织出现SP-B和FSP1共表达,而对照组未见共表达；与对照组比较,给氧21d时SP-B基因mRNA表达水平明显下降,FSP1明显升高(P均＜0.05)；与对照组比较,BPD组呼吸频率(F)及潮气量(Tv)均明显降低(P＜0.05).结论:通过EMT机制生成的成纤维细胞是BPD中肺纤维化的重要来源.
作者：刘芳君；邓春；郭春宝；符州 刊期： 2012年第05期
目的:观察β-丙内酯对甲型肝炎病毒(HAV)的灭活效应.方法:采用1∶4000的β-丙内酯和甲醛,分别对HAV进行灭活试验.通过病毒滴度检测及病毒灭活效果验证,确定佳灭活时间；检测两种灭活剂对HAV抗原滴度和免疫原性的影响以及对小鼠和豚鼠的毒性反应.结果:β-丙内酯灭活10 h及甲醛灭活3d后,检测不出病毒；β-丙内酯作用24 h可将病毒完全灭活,比甲醛灭活12d效果更好；两种灭活剂灭活不同时间的HAV抗原滴度保持不变,均为1∶640EU/0.1ml；免疫小鼠28 d后,抗-HAV均呈阳性,阳转率达到100％,且对小鼠及豚鼠均无毒性.结论:β-丙内酯直接作用于病毒核酸基因,使HAV失去活性而保持其免疫原性.
作者：蒋建江；威凤春；胡艳灵；潘翔；陈统球 刊期： 2012年第05期
目的:探讨触珠蛋白(Haptoglobin,Hp)在急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)患者血清中的表达情况,为该疾病的诊断与治疗提供新思路.方法:收集30例确诊的AMI患者和30例体检证实为健康人群组的血清,去除血清高丰度蛋白后,采用双向电泳(2-DE)分离血清蛋白,获得的电泳图谱经ImageMaster5.00软件分析,差异明显的蛋白点经胶内酶解后,行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption-ionization-time of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析,检测Hp的表达.结果:AMI患者与健康人群组血清的电泳图谱相似；MALDI-TOF-MS分析显示,AMI患者血清中Hp表达量明显高于健康人群组(P＜0.05).结论:Hp在AMI患者血清中表达量升高,其有望成为AMI患者的特异性诊断标记物.
作者：范晓卿；周义文；秦晓林；何咏婷；刘银河；王毅；涂植光 刊期： 2012年第05期
目的:构建乙型肝炎病毒HBx基因shRNA真核表达质粒,并筛选能有效抑制HBx表达的干扰序列.方法:设计并构建针对HBx基因的3个siRNA表达质粒,经酶切和DNA测序鉴定,转染HepG2.2.15细胞,荧光显微镜观察细胞转染效率,RT-PCR检测HepG2.2.15细胞中HBx基因mRNA的转录水平,Western blot检测HepG2.2.15细胞中HBx蛋白的表达水平.结果:酶切和测序鉴定质粒构建正确,插入片段的碱基序列符合实验设计；质粒转染HepG2.2.15细胞后,HBx基因的转录水平、相对表达量及HBx蛋白的表达水平均明显降低(P均＜0.01),3个重组质粒均能抑制HBx蛋白的表达,且质粒shRNA-HBx3抑制能力强.结论:已成功构建了靶向HBx基因的shRNA真核表达质粒,并筛选出具有高效沉默HBx基因的shRNA质粒,为进一步研究HBx感染合并肝细胞脂肪变性的发生发展奠定了基础.
作者：张琴；彭俊；沈薇 刊期： 2012年第05期
目的:观察在旋转振荡培养工艺放大条件下,表达肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(TN FR-Fc)的重组CHO细胞稳定性及其表达产物活性.方法:采用旋转振荡悬浮培养CHO细胞,至对数生长期时,接种不同培养体积(10 ml、250 ml、1.5L),于31℃继续培养,每日取样检测不同培养体积下的细胞密度、细胞活力、融合蛋白浓度；经MabSelect Sure亲和层析柱纯化融合蛋白,采用SDS-PAGE、ElISA、MTT法进行纯化产物的相对分子质量和纯度及结合活性、中和活性的检测.结果:重组CHO细胞在旋转振荡培养条件下,由10 ml放大到1.5L培养体积时,细胞的生长密度、活力及蛋白表达量均相对稳定；纯化的融合蛋白纯度在94％以上,相对分子质量约75 000,可与重组人TNFα特异性结合,其相对亲和力与标准品十分接近,且可中和重组人TNFα的细胞毒效应.结论:明确了表达TNFR-Fc融合蛋白的重组CHO细胞旋转振荡培养工艺放大的可行性,为更大规模发酵生产奠定了基础.
作者：王一婷；雷云；黄鹂；谢奎；杨依丽；陈宝琼；谢秋玲；洪岸；熊盛 刊期： 2012年第05期
目的:全面检定GX1-rmhTNFα工程菌,并建立稳定的发酵及纯化工艺.方法:对GX1-rmhTNFα工程菌进行全面检定,挑取目的蛋白表达水平高的菌种扩大培养；采用5L发酵罐,32℃培养工程菌至菌体A600值达4～6时,42℃诱导约4h后收菌,发酵过程控制pH值在7.2,溶氧在30％左右,采用梯度流加的方法补料,连续发酵3批,验证发酵工艺的稳定性；发酵产物经硫酸铵分段盐析及透析处理后,经SP-Sepharose FF及Q-Sepharose FF层析纯化,收集洗脱峰进行纯度、浓度、活性及Western blot分析.结果:工程菌经全面检定,证实构建正确,目的蛋白表达量不低于10％,菌种稳定性较好,呈典型的大肠杆菌特征,适合建立工程菌菌库；连续发酵3批,湿菌收量均不低于200g,目的蛋白表达水平均在10％以上；目的蛋白经柱层析纯化,终纯化产物蛋白含量为0.901mg/ml,活性为5.97x108IU/ml,纯度可达95％以上,Western blot分析显示,目的蛋白可与鼠抗人TNF单抗特异性结合.结论:初步建立了稳定可行的GX1-rmhTNFα融合蛋白的发酵及纯化工艺.
作者：肖佳佳；吴守振；薛晓静；吴开春 刊期： 2012年第05期
目的:研究羊痒病病毒株(22L)对神经瘤细胞(N2a)的影响,并建立研究朊病毒病的细胞模型.方法:用感染22L的鼠脑匀浆感染正常的N2a细胞,经荧光倒置显微镜、电镜及HE染色对正常细胞和染毒细胞(N2a-22L)的形态和内部结构进行观察,并通过Western blot检测细胞中朊病毒(Prions,PrP(sc))的含量.结果:镜下观察可见,N2a-22L细胞的神经突起较N2a细胞明显增多,并交织成复杂的网状结构；线粒体出现明显的空化,嵴消失；细胞体积减小,细胞核皱缩,细胞间通过突起连在一起,细胞核与细胞质界限模糊.N2a-22L细胞蛋白PrP经PK酶消化后,可见抗PK酶的PrP(sc),N2a细胞的PrP蛋白均能被PK酶消化,表明N2a-22L已稳定感染了22L.结论:N2a-22L细胞可作为研究朊病毒病的细胞模型,为研究朊病毒病发病机制提供了有效途径.
作者：张晓晶；李忠义；万家余；鞠传静；梁斌斌；刘文森；刘林娜；孙玉成；刘晋平；钱军 刊期： 2012年第05期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
