陈国庆；姚珍薇；秦兴发
目的 人工合成恒河猴白细胞介素-4( Macaca mulatta Interleukin-4,Mamu IL-4)基因,并在大肠杆菌中高效表达及纯化.方法 根据大肠杆菌遗传密码偏爱性优化设计并人工合成Mamu IL-4(mIL-4)基因,克隆入pET43.1a(+)表达载体,构建重组表达质粒pET43.1 a-mIL-4,转化大肠杆菌BL21-CodonPIus(DE3)-RIPL,经IPTG诱导表达.通过阳离子交换层析及稀释复性等步骤对表达的重组mIL-4蛋白进行纯化,纯化产物经Western blot进行鉴定.结果 双酶切及测序证实重组表达质粒pET43.1a-mIL-4构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为15 000,表达量约占菌体总蛋白的40%,主要以包涵体形式存在,经纯化复性后纯度可达95%以上；Western blot检测其能与鼠抗mIL-4单克隆抗体特异性结合.结论 在大肠杆菌中高效表达了重组mIL-4蛋白,纯化的蛋白纯度较高,为其生物学活性及佐剂的相关研究奠定了基础.
作者：陈丹；刘娟；黄健；刘新颖；王冉；史洪娜；王维龙；沈林；李鼎锋 刊期： 2011年第09期
目的 构建小鼠神经细胞cDNA T7噬菌体表面展示文库.方法 用Trizol试剂提取原代小鼠神经细胞总RNA,分离、纯化mRNA,经反转录合成其双链cDNA.在双链cDNA末端加上定向EcoR Ⅰ/HindⅢ接头,用内切酶EcoR Ⅰ和HindⅢ消化接头,以形成两端分别带有EcoR Ⅰ和HindⅢ黏性末端的双链cDNA.经Mini Column进行纯化,收集大小在300 bp以上的双链cDNA片段,将其连接于含有EcoR Ⅰ和HindⅢ末端的T7Select 10-3b载体上,体外包装后经BLT5403菌株增殖,进行文库扩增.结果 所构建的文库库容量为含有3.04× 107个重组子,原始滴度为2.8×107 pfu/ml,重组率为92%,扩增后文库滴度为3.5×1010 pfu/ml.对随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,88%的插入片段大于300 bp.结论 成功构建了小鼠神经细胞cDNA T7噬菌体表面展示文库.
作者：张磊升；高巍；赵魁；贺文琦；宋德光；陆慧君；高丰 刊期： 2011年第09期
流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道感染疾病,具有传染性强、传播速度快的特点.据报道,全球每年约有5%～15%的人口会感染流感病毒,并导致300万～ 500万的严重病例和50万的死亡病例[1-2].接种流感疫苗是预防流感发生与传播的有效手段[3].
作者：刘书珍；邵铭；邱平；袁力勇；方捍华；李长贵 刊期： 2011年第09期
目的 采用低温乙醇法分离正常人血浆组分Ⅳ沉淀(FractionⅣ,FⅣ)中提取α1-抗胰蛋白酶(α1-Antitrypsin,α1-AT),制备较高纯度的α1-AT制剂.方法 FⅣ沉淀经过滤、ConA Sepharose 4B亲和层析、DEAE Sepharose Fast Flow一步离子交换层析提纯α1-AT,采用SDS-PAGE及区带扫描法分析纯化α1-AT的纯度；紫外分光光度计测定纯化α1-AT蛋白的浓度及回收率；Western blot检测其反应原性；胰蛋白酶抑制实验(TICT)检测纯化α1-AT的活性.结果 纯化α1-AT的纯度为97.3%；纯化过程中α1-AT蛋白的平均回收率为20.4%；纯化的α1-AT能与抗人α1-AT抗体特异性结合；平均比活为0.833 PU/mg.结论从FⅣ中成功纯化获得了纯度较高、具有生物学活性的α1-AT制剂.
作者：周雁翔；端义坤；李策生；彭良俊；张爱华；邹汉武 刊期： 2011年第09期
目的 观察胸腺五肽( Thymopentin,TP-5)治疗低复制状态慢性乙型肝炎的临床疗效.方法 将72例HBV-DNA定量检测低于2000 IU/ml的慢性乙型肝炎患者随机分为两组:治疗组(38例)经肌肉注射TP-5 1 mg,每日1次；对照组(34例)口服护肝片,每日3次.疗程为12周,治疗结束后随访12周.采用PCR法检测两组患者HBV-DNA水平,化学发光法检测乙肝血清标志物变化,全自动生化仪检测肝功能指标,放射免疫法检测肝纤维化指标.结果 治疗组在治疗及随访结束后,HBV-DNA阴转率均明显高于对照组(P＜0.05),治疗组治疗后肝功能指标和肝纤维化指标均得到明显改善(P＜0.01或P＜0.05),与对照组治疗后相比,差异也有统计学意义(P＜0.05)；两组HBsAg阴转率比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TP-5可促进低复制状态慢性乙型肝炎HBV-DNA转阴,改善受损肝脏功能,延缓肝纤维化进展.
作者：姜艳玲；沈科书；高雪娟；李艳玲；吴业红 刊期： 2011年第09期
目的 观察骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植对大鼠溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)的治疗作用.方法 分离、培养、鉴定大鼠MSCs,并以DAPI标记第3代MSCs.将大鼠随机分为3组,A、B组采用免疫复合法诱导UC模型,C组为正常对照组.A组移植标记的MSCs,B组移植PBS.移植后3、7、14d各组均处死大鼠5只,取结肠组织,光镜观察病理变化,荧光显微镜观察标记细胞的分布,激光共聚焦显微镜观察标记细胞细胞角蛋白( Cytokeratin,CK)的表达.结果 MSCs生长迅速,呈均一的成纤维样细胞,表达CD29和CD90,不表达CD45.移植后7、14 d,A组结肠的修复明显优于B组；移植后3d,A组结肠即可见移植细胞,至14d时多(P＜0.05)；移植后7、14 d,A组少量移植细胞表达CK.结论 MSCs移植可促进UC大鼠损伤结肠的修复；部分MSCs可分化为结肠上皮细胞,参与损伤的修复.
作者：徐艳华；李敏；刘俊；姜蓉；汪维伟 刊期： 2011年第09期
目的 原核表达并纯化牛型结核分枝杆菌MPT64蛋白.方法 以牛型结核分枝杆菌Vallee株全基因组DNA为模板,PCR扩增MPT64基因,克隆至pET-28a(+)载体,构建重组原核表达质粒pET-MPT64,转化至E.coli BL21 (DE3)中,IPTG 诱导表达.表达产物经SDS-PAGE鉴定后,用Ni-NTA亲和层析纯化,Western blot鉴定纯化蛋白.结果 获得的MPT64基因测序结果与GenBank中登录的MPT64基因核苷酸序列同源性为100%;重组表达质粒pET-MPT64经酶切鉴定表明构建正确；表达的重组MPT64蛋白相对分子质量约为26 000,主要以可溶性形式表达,表达量约占全菌总蛋白的11%；纯化的重组MPT64蛋白纯度达93%,可与抗结核牛血清发生特异性反应.结论 成功原核表达并纯化了牛型结核分枝杆菌MPT64蛋白,其可作为诊断抗原用于新型牛结核病的检测.
作者：谭为；聂映；吴仁彪；程黎庆；闫广谋；张西臣；张瑞 刊期： 2011年第09期
目的 利用昆虫杆状病毒系统表达甲型流感病毒血凝素( Hemagglutinin,HA)蛋白.方法 PCR扩增去除信号肽的甲型H1N1(A/PR/8/34)流感病毒HA基因,与pFastBacdual载体(pFBd)连接,构建转移载体pFBd-HA,转化含Bacmid的DH 10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒rBacmid-HA.rBacmid-HA转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒rBac-HA.采用噬斑形成法检测病毒滴度,PCR法检测重组杆状病毒基因组HA基因,间接免疫荧光法、Western blot法和ELISA法检测HA蛋白的表达.结果穿梭质粒rBacmid-HA经PCR鉴定构建正确；第3代rBac-HA的滴度为3×107pfu/ml;感染rBac-HA的sf9细胞经PCR扩增可见4 216 bp的特异性条带,间接免疫荧光检测可见绿色荧光,Western blot鉴定与鼠抗甲型流感病毒HA( H1)单抗和鸡抗流感病毒(California株)多抗发生特异性反应,ELISA检测与鼠抗流感病毒(PR8株)多抗特异性结合的能力强于与鸡抗流感病毒(California株)多抗结合的能力.结论 利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达了甲型流感病毒HA蛋白.
作者：付金奇；郭建强；姚立红；陈爱珺；刘晓宇；张乐萃；张智清 刊期： 2011年第09期
目的 分析中国人群细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(Cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4,CTLA-4)+49位点A＞G基因多态性与结直肠癌发生和进展的相关性.方法 选取结直肠癌患者248例(疾病组)、结直肠腺瘤患者380例(对照组),采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)检测CTLA-4+ 49位点基因型.结果 疾病组CTLA-4+ 49位点出现GG纯合子或至少出现1个G等位基因的频率显著高于对照组；与携带CTLA-4+49A/A基因型患者相比,携带CTLA-4+ 49G/G基因型患者发生结直肠癌的危险性为OR=3.684(95% CI:1.670～8.128)；携带A等位基因的患者发生远处转移的几率较高,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 CTLA-4+ 49A＞G基因多态性与中国人群结直肠癌易感性具有一定的相关性,但对结直肠癌进展的影响不明显.
作者：李晓冬；赵金鹏；孙岩岩 刊期： 2011年第09期
目的 筛选甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)单克隆抗体(MAb),并初步建立HAV双抗体夹心ELISA定量检测方法.方法 用抗体亚型鉴定试剂盒鉴定MAb亚型；通过Western blot法鉴定MAb的特异性；SPA亲和层析法纯化MAb腹水,检测MAb的抗原识别表位；细胞培养法检测MAb的中和效价.确定双抗体夹心法包被物与酶标MAb的浓度,初步建立HAV双抗体夹心ELISA定量检测方法,并考察方法的线性范围.结果 12株HAV单抗中,1株为IgM型,3株为IgG3型,3株为IgG2a型,5株为IgG2b型；10株MAb可特异性结合HAV的VP2蛋白；7株MAb识别相同的抗原表位；7号MAb中和效价高,可达1:4096.建立的HAV双抗体夹心ELISA定量检测方法的线性范围为15.625～250 u/ml,R2＞0.97.结论 筛选出1株特异性好、中和效价较高的IgG2b型MAb,可用于制备酶标抗体和ELISA检测试剂盒,应用于甲肝疫苗中抗原的检测.
作者：高加梅；宋俐霏；李军；张立志；于丹；国泰 刊期： 2011年第09期
目的 无细胞表达人178位点突变朊蛋白PrP(D178N),并分析其抗原性及结构.方法 提取人血液基因组DNA,应用PCR法突变人PrP 178号位点.以正常的PrP为对照组,分别连接至真核表达载体pcDNA3.1上,利用无细胞真核表达系统进行表达.Western blot分析表达的重组蛋白的抗原性,电镜观察抗原结构.结果 突变基因重组表达质粒构建正确；表达的PrP( D178N)蛋白相对分子质量约为28 000,对PK酶具有抗性,电镜下可见氧病相关纤维(Scrapie associated fibrils,SAF)存在.结论 已成功无细胞表达了 PrP(D178N),为后续其突变后空间构象及致病机理的研究奠定了基础.
作者：汤鑫；万家余；鞠传静；李莎；郝镯；刘文森；李忠义；孟轲音；张晓晶 刊期： 2011年第09期
目的 构建并鉴定靶向人转录因子FOXM1基因的shRNA慢病毒载体.方法 设计合成靶向人FOXM1基因的shRNA序列,通过基因重组技术将其连接到含U6启动子及绿色荧光蛋白基因的慢病毒表达载体pLL3.7中,构建shRNA重组质粒pLL-FOXM 1-shRNA.重组质粒经Xba I和Nhe I双酶切及DNA测序鉴定后,与慢病毒包装质粒混合,与脂质体LipofectamineTM 2000共转染至293T细胞中,孵育72 h后收集上清液,高速离心纯化病毒颗粒,并采用逐孔稀释法测定慢病毒滴度.结果双酶切鉴定及测序结果证实,靶向人FOXM1基因的shRNA序列已成功插入pLL3.7中；在293T细胞中成功包装出慢病毒颗粒,病毒滴度为1×108 TU/ml.结论 已成功构建了靶向人FOXM1基因的shRNA慢病毒载体,为进一步研究FOXM1的分子功能奠定了基础.
作者：陈国庆；姚珍薇；秦兴发 刊期： 2011年第09期
目的 分析痘苗病毒弱毒株广9株(Vaccinia virus Guang 9 strain,VG9)对BALB/c小鼠的免疫原性.方法 用鸡胚成纤维细胞培养痘苗病毒VG9株和天坛株(Vaccinia virus Tian Tan strain,VTT),离心纯化病毒,经小鼠背部皮内免疫后,每周采血,共4次,采用ELISA法检测小鼠血清中抗痘苗病毒特异性抗体效价；中和试验检测免疫后3周和4周小鼠血清中和抗体效价.结果 两株痘苗病毒免疫后1周,小鼠血清中即产生抗痘苗病毒特异性抗体,效价均达1∶4050;至第3周,抗体效价上升至1∶12 150；第4周时,VG9株抗体效价维持在1∶12 150,而VTT株效价可达1:36 450.两株病毒诱导的中和抗体水平均在免疫后3周达峰值,且具有交叉中和作用,均对VTT株中和效果更好,VG9株诱导产生中和抗体的能力较VTT株略低.结论 痘苗病毒VG9株与VTT株一样,具有良好的免疫原性,皮内免疫均能刺激小鼠产生良好的抗痘菌病毒特异性抗体和中和抗体.
作者：朱蓉；黄维金；王佑春；俞永新 刊期： 2011年第09期
目的 通过凝胶免疫法制备抗狂犬病病毒糖蛋白单链抗体Fv57的多克隆抗体.方法 诱导表达Fv57蛋白,SDS-PAGE分离后,分别以KCI和考马斯亮蓝R-250染色,切取含目的蛋白的凝胶,经背部皮下免疫家兔,共免疫4次.第4次免疫后1周采血,分离血清,Western blot分析Fv57蛋白多克隆抗体的特异性,ELISA检测抗体效价.结果 表达的Fv57蛋白相对分子质量约26000;两种染色方法制备的多抗均能与Fv57蛋白特异性结合,与考马斯亮蓝R-250染色法相比,KCI法的非特异性杂带较少,结合效果更好；两种方法制备的多抗效价均在1∶10000以上.结论 已成功采用凝胶免疫法制备了Fv57多克隆抗体,为检测Fv57与狂犬病病毒糖蛋白的特异性结合奠定了基础.
作者：谷铁军；张海玉；段冶；韩明明；卫巍；姜春来；吴永革；孔维 刊期： 2011年第09期
目的 修饰犬干扰素α1(Canine interferon alpha1,CaIFNα1)基因,提高其在毕赤酵母中的表达水平及抗病毒活性.方法 根据巴斯德毕赤酵母表达系统对密码子的偏爱性,将CaIFNα1基因改造后,克隆至分泌表达载体pPICZαC中,电转化巴斯德毕赤酵母X33,甲醇诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定和氨基酸测序后,检测重组蛋白的表达量及抗水疱性口炎病毒( Vesicular stomatitis virus,VSV)的活性.结果 重组表达质粒pPICZαC-CaIFNα1经双酶切及测序证明构建正确；表达的重组CaIFNα1蛋白相对分子质量约为24 000,蛋白氨基酸序列与天然的CaIFNα1氨基酸序列相同,3批重组酵母菌表达产物的蛋白含量分别为0.253、0.198和0.224 mg/ml,在Vero细胞上均无抗VSV活性,在MDCK细胞上的抗VSV活性分别为1.58×108、1.30× 108和1.50× 108U/mg.结论 已成功改造了CaIFNα1基因,并在毕赤酵母中实现了高效表达,为大量发酵生产干扰素奠定了基础.
作者：王玉；朱艳平；郭霄峰 刊期： 2011年第09期
目的 应用母血浆中AIRE基因作为胎儿DNA遗传学标记,探讨无创性产前筛查唐氏综合征(Down syndrome,DS)的可行性.方法 提取随机选取的45名正常孕妇血浆中游离DNA,同时以15名非妊娠健康妇女血浆游离DNA作为对照,通过巢式甲基化特异性PCR检测游离DNA中AIRE基因的甲基化状态；提取15名产妇胎盘组织和母血单核细胞中的DNA,检测AIRE基因的甲基化状态；采集20例确诊为DS胎儿的高危孕妇外周血,以45名正常孕妇外周血作为对照,检测AIRE基因甲基化状态.结果 正常孕妇血浆中AIRE基因的甲基化率比非妊娠健康妇女高(P＜0.01)；所有产妇胎盘组织中均能检测到AIRE基因的甲基化,而在母血单核细胞中未检测到；在确诊为DS胎儿的高危孕妇外周血中,AIRE基因的甲基化率远远低于正常胎儿孕妇外周血(P＜0.01).结论 应用巢式甲基化特异性PCR技术检测妊娠期母血浆中AIRE基因的甲基化状态对胎儿DS进行非创伤性产前诊断是可行的.
作者：方爱平；陈德珩；文景丽；范海波；王英兰；张悦；胡泓 刊期： 2011年第09期
目的 采用直接ELISA法测定重组人源化兔抗血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)单克隆抗体的抗原结合活性.方法 以VEGF-Fc为包被抗原,采用直接ELISA法测定不同浓度重组人源化兔抗vEGF单扰参考品和供试品与抗原的结合活性,根据供试品及参考品的EC50值计算供试品的相对结合力,并分析该法的精密性.结果 重组人源化兔抗VEGF单抗供试品及参考品的抗原结合均存在量效关系,且符合四参数方程.同一批次的供试品单抗原液的相对结合活性分别为参考品的(90.43±18.74)%、( 123.56±18.40)%和(106.83±18.47)%,均值为(106.94±16.57)%.3次试验的变异系数分别为20.72%、14.89%和17.29%.同一批次的供试品成品的相对结合活性分别为(97.34±18.42)%、( 123.30±11.08)%和(93.91±4.57)%,变异系数分别为18.93%、8.96%和4.87%.结论 直接ELISA法精密性良好,操作简便,可用于重组人源化兔抗VEGF单抗抗原结合活性的常规检测.
作者：范文红；毕华；饶春明 刊期： 2011年第09期
目的 建立固定金属亲和层析法(Immobilized metal affinity chromatography,IMAC)纯化重组Kringle 5蛋白的工艺,为Kringle5蛋白的制备及生物学活性研究奠定基础.方法 常规制备IMAC蛋白上样样品,分别采用pH梯度洗脱和咪唑梯度洗脱的方法获取Krinoe 5蛋白洗脱液,分段收集洗脱样品,SDS-PAGE检测蛋白纯度,Western blot鉴定其反应原性.结果 咪唑梯度洗脱法获得的Kringle 5蛋白纯度达98%以上,得率为21.3 mg/柱体积,但不能充分将Kringle 5蛋白与杂蛋白分离；pH梯度洗脱法获得的Kringle5蛋白纯度在98%以上,得率为62.7 mg/柱体积,且可与杂蛋白充分分离.结论 已建立了重组Kringle 5蛋白的纯化方法,为Kringle 5蛋白的制备及生物学活性研究奠定了基础.
作者：陈显久；解军；张悦红；牛勃 刊期： 2011年第09期
目的 探讨不同种类乙型肝炎(乙肝)疫苗免疫小鼠后诱导抗原特异性细胞因子反应的差异及单个核细胞产生TH1型细胞因子的能力,评价不同种类乙肝疫苗的免疫原性.方法 应用重组汉逊酵母、酿酒酵母、CHO细胞来源的乙肝疫苗分别免疫BALB/c小鼠(H-2d),于免疫后4、7、10、14、25和35 d处死,分离脾单个核细胞(Mononuclear cell,MNC),经HBsAg体外刺激后,采用液相芯片酶联( Luminex)技术测定小鼠IFNγ、IL-2和TNF-α分泌水平.结果 3种乙肝疫苗诱导小鼠产生IFNγ和TNF-α的峰值均出现在免疫后10d,之后开始下降；IL-2水平呈逐渐上升趋势.免疫后10和14d,酿酒酵母疫苗组诱导小鼠产生IFNγ的水平显著高于CHO疫苗组(P＜0.01)；免疫后10、25和35 d,汉逊酵母疫苗组诱导小鼠产生IL-2的水平显著高于CHO疫苗组(P＜0.05)；免疫后10、14和35 d,酿酒酵母疫苗组诱导小鼠产生TNF-o的水平显著高于CHO疫苗组(P＜0.05);免疫后7和25 d,汉逊酵母疫苗组诱导小鼠产生TNF-α的水平显著高于CHO疫苗组(P＜0.05).结论 不同种类乙肝疫苗诱导小鼠的细胞免疫反应强度与变化趋势不同.酵母疫苗诱导的TH1型细胞因子水平高于CHO疫苗.
作者：何鹏；胡忠玉；梁争论；李河民；庄辉 刊期： 2011年第09期
抗肿瘤药物联合作用是通过选择已知或未知作用机制的不同药物,经不同途径协同作用放大较弱的死亡信号,确保发生有效的细胞死亡.本文对抗肿瘤药物联合作用的研究现状、药物选择的基本依据、常用的研究方法作一综述.
作者：李清；金英花 刊期： 2011年第09期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
