廖文婷；陈璐；曹洁；陈秋莉；王锦红；唐萍；庞强；黄德胜；潘卫
目的 构建人NIRF基因真核表达质粒,并在HepG2.2.15细胞中表达NIRF蛋白.方法 从HeLa细胞中提取总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增NIRF基因编码区全长序列,插入到pIRES2-EGFP真核表达载体中,构建重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-NIRF,转染HepG2.2.15细胞,检测细胞中NIRF基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平.结果 重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-NIRF经双酶切及测序鉴定证明构建正确.转染HepG2.2.15细胞后,可检测到细胞中NIRF基因mRNA的转录及蛋白的表达.结论 已成功构建了人NIRF基因真核表达质粒,并在HepG2.2.15细胞中表达了NIRF蛋白,为下一步研究其在肿瘤组织中的功能奠定了基础.
作者：常蕾；段昌柱 刊期： 2009年第11期
目的 构建多样性良好的抗白念珠菌人源性单链抗体库,筛选抗白念珠菌特异性的噬菌体抗体.方法 从20份人外周血淋巴细胞(包括正常成年人5份、新生儿5份和白念珠菌感染恢复期患者10份)中提取总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增人抗体重链(V_H)和轻链(V_L)可变区基因,以重叠延伸PCR法将V_H和V_L拼接成scFv基因,克隆人噬菌粒载体pCANTAB-5E中,电转化大肠杆菌XLI-Blue,构建人源抗白念珠菌天然噬菌体抗体库,并从中筛选阳性克隆抗体.结果 构建的人源性抗白念珠菌天然噬菌体抗体库库容为2.8 ×10~9.多样性良好.共筛选出18个阳性克隆.结论 已成功构建了1个多样性良好的抗白念珠菌人源性噬菌体抗体库,为筛选有效治疗白念珠菌和耐药性白念珠菌感染的药物提供了条件.
作者：路艳；韩跃武；韩亚萍；刘玲玲；王春霞；李真真 刊期： 2009年第11期
目的 筛选冻干乙型脑炎灭活疫苗(Veto细胞)非动物源性稳定剂,以替代传统的动物源性稳定剂.方法 取同一批乙型脑炎灭活疫苗(Veto细胞)原液,分别加入A、B、c、D稳定剂(非动物源性),制备成冻干剂型,分别检测其外观、水分、有效抗原含量和效力等,以传统稳定剂作对照,并考察其稳定性.结果 冻干前后,疫苗的有效抗原含量及效力与对照无明显差异.加入D稳定剂(不含人血白蛋白和明胶)的冻干乙型脑炎灭活疫苗于37℃放置6个月,效力降低15.1%;于2～8℃放置2年.效力仍高于参考品.其他检测指标均符合要求.结论 D稳定剂可替代传统稳定剂,用于制备冻干乙型脑炎灭活疫苗.
作者：张晋；张颖；杨阳；佟芳；董建春；白亮；郝宇；高春龙；康岚 刊期： 2009年第11期
目的 原核表达天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,并进行纯化和发酵.方法 全基因合成带有凝血酶切割位点的天蚕素B和表皮生长因子融合基因.克隆人pET22b(+)-X表达载体中.构建重组质粒pET22b-Cecropin B-EGF,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta-gami2(DE3),经IPTG诱导后.进行SDS-PAGE及Western blot分析.镍离子亲和层析纯化融合蛋白并复性后,对其促表皮生长活性进行测定,后在5 L发酵罐中进行发酵.结果 酶切及测序结果显示,融合蛋白基因已克隆入pET22b(+)-X表达载体中;SDS-PAGE分析显示,天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白在Rosetta-gami2(DE3)宿主菌中得到了有效表达,表达量约占全菌总蛋白的30%;Western blot分析显示,表达产物可与表皮生长因子单克隆抗体特异结合;融合蛋白的表达形式为包涵体;纯化、复性后的融合蛋白具有促BALB/c 3T3细胞生长的活性,在5 L发酵罐中进行发酵,1次可收获菌体约60 g.结论 已成功地在大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)中表达了天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,为研究具有抗菌和促伤口愈合的双功能药物奠定了基础.
作者：万一；沈卫荣；韩丽萍；王小霞；李玥；张月娟；孙晓宇；陈锐；沈俭 刊期： 2009年第11期
目的 建立无细胞百日咳疫苗血清学效价检测方法(PSPT),并对其适用性进行初步验证.方法 采用纯化的百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)包被酶标板,以羊抗鼠IgG酶标抗体为指示抗体,建立检测小鼠抗PT抗体和抗FHA抗体的间接ELISA法,并对该方法进行初步验证.在此基础上建立PSPT法,并与MICA法进行相关性分析.结果 建立了小鼠抗PT抗体ELISA和抗FHA抗体ELISA,标准曲线线性范围内R≥0.99;经验证,两系统与无关抗体之间均无交叉反应;检测限度分别为93.750 0和59.062 5 mEU/ml.检测限量分别为100和70 mEU/ml.将10批无细胞百日咳原液分别以PSPT法和MICA法进行效价测定,两者呈正相关,两种方法检测结果差异无统计学意义.且PSPT法比MICA法重复性更好.结论 抗PT抗体ELISA和抗FHA抗体ELISA灵敏度高.准确性及精密性均较好,在此基础上建立起来的PSPT法有望替代MICA法,用于检测无细胞百日咳疫苗的效价.
作者：李世慧；肖詹蓉；刘保奎 刊期： 2009年第11期
目的 研究SD大鼠单次及多次皮下注射聚乙二醇干扰素α2b(PEG-IFNα2b)的药代动力学特征.方法 单次皮下注射按18、180、900 μg/kg给药;多次皮下注射按180μg/kg,1、4、7 d给药;在不同时间点采集血样.ELISA法检测血药浓度,并计算药代动力学参数.结果 SD大鼠单次给药的血药浓度.时间曲线呈剂量依赖关系,体内呈一级动力学过程,具有线性动力学特征;多次给药后,未见PEG-IFNα2b的达峰值时间延长及峰浓度升高的现象,曲线下面积(AUC)亦未见增加,末次给药后大鼠的血药浓度曲线呈一室开发模型,半衰期与单次给药半衰期无明显差异,多次皮下给药元蓄积倾向.结论 PEG-IFNα2b半衰期比IFNα2b显著延长,使用PEG-IFNα2b可以减少用药频次,并可能提高疗效.
作者：吴建国；陈晓虹；宓现强；陶群；叶丹；鞠佃文 刊期： 2009年第11期
目的 原核表达犬重组干扰素α(rCaIFNα),并检测其抗病毒活性.方法 PCR扩增CaIFNα成熟蛋白基因,并克隆至pGEX-5X-1表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG低温诱导表达.表达的重组蛋白经亲和层析纯化后,进行SDSPAGE及Western blot鉴定,并检测其效价及抗犬细小病毒活性.结果 PCR、双酶切及序列分析证实CalFNα成熟序列已插入pGEX-5X-1载体中.表达产物经SDS-PAGE分析,可见相对分子质世约45 000的目的蛋白条带,表达量约占菌体总蛋白的(32±2.4)%.纯化的重组蛋白纯度约为85%.且具有良好的反应原性.制备的3批rCaIFNα效价均达到1.1×10~6 IU/ml以上.并可抑制犬细小病毒对MDCK细胞的致病变作用.结论 已成功地在大肠杆菌中高效表达了rCaIFNα,表达产物具有良好的抗病毒活性.
作者：王新满；张玮；赵俊；王明丽 刊期： 2009年第11期
目的 研究我国生产用卡介菌上海株在传代过程中分子遗传学特性的稳定性.方法 应用多重PCR法,对我国生产用卡介菌上海株工作种子批及其不同代次菌的各缺失区、插入序列IS6110及基因座SenX3-RenX3串联重复序列拷贝数进行检测.结果 我国生产用卡介菌上海株的工作种子批及其第6、9、12代菌均缺失RD1、RD2,未缺失RD8、RD14、RD16、nRD18及RDDenmark/Glaxo;含有1个IS6110插入序列和3个SenX3-RenX3基因座串联重复序列.结论 我国生产用卡介菌上海株在传12代以内,其分子遗传学特性是稳定的.
作者：赵爱华；乔来艳；贾淑珍；寇丽杰；王国治 刊期： 2009年第11期
核酶是一类具有催化功能的核酸分子.能够与双链DNA或RNA分子结合,从而抑制其转录或翻译.由于核酶能够在相应位点切割核酸序列,具有酶的活性,使其在病毒的基因治疗中具有广阔的应用前景.随着有效的转运和表达方法的建立及核酸化学的进步,核酶有望成为基因治疗中有效的工具之一.本文就核酶在病毒基因治疗中的研究进展作一综述.
作者：卜范峰；王明旭；陈建春 刊期： 2009年第11期
2009年4月16日20时,北京市朝阳区发生一起12名外地农民工被同一条流浪犬咬伤的事件,经街乡政府、公安联防、区卫生局、区疾控中心、辖区社区卫生服务中心等部门的通力协作,进行了妥善,现报道如下.
作者：时念民；罗凤基；李书明；白云骅；屈燕；艾星 刊期： 2009年第11期
乙型肝炎疫苗和抗病毒药物在全球的广泛应用有效地防止了乙肝病毒(HBV)的感染.但随之而来的问题是在疫苗免疫后的人群、进行抗病毒治疗的患者以及慢性HBV感染的人群中,出现了HBV表面抗原的变异,而大量文献报道了免疫诊断试剂对变异表面抗原的漏检.本文对乙肝病毒表面抗原变异对免疫诊断试剂检测结果的影响作一综述.
作者：姚昕；周诚；祁自柏 刊期： 2009年第11期
目的 构建白眉蝮蛇去整合素Adinbitor的RIARGD→RPTRGD突变体,研究其主要功能及其作用的分子机制.方法 重叠延伸PCR法获得Adinbior定点突变cDNA序列.表达并纯化突变体蛋白.血小板聚集试验检测其对血小板聚集的影响;鸡绒毛尿囊膜模型体内血管新生试验检测其对血管新生的抑制功能;流式细胞仪检测其对血小板膜受体去整合素αⅡbβ3与CD41结合的影响.结果 双酶切、PCR及测序证实突变体构建止确,纯化的突变体蛋白纯度在90%以上.野生型Adinbitor可识别αⅡbβ3,竞争性抑制纤维蛋白原与血小板结合,从而发挥抑制血小板聚集的功能;在相同剂量下,突变型Adinbitor几乎不具备此功能,而保留了抑制血管新生的功能.结论 已成功构建了白眉蝮蛇去整合素Adinbitor定点突变体,与野生型Adinbitor比较,突变体抑制血小板聚集的功能得到了有效抑制.抑制血管新生功能保持不变,为其今后的功能开发奠定了理论基础.
作者：胡燕荣；刘淑清；赵霆；田余祥；洪艳；于丽华；崔秀云；赵宝昌 刊期： 2009年第11期
目的 建立口蹄疫病毒(FMDV)Asial型江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法.方法 在比较大量国内外FMDV流行毒株序列的基础上,设计检测不同基因型Asial型FMDV江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联PCR引物,优化单项和二联RT-PCR反应条件.并进行特异性及相关病毒检测.结果 优化的单项和二联RT-PCR特异性均良好.检测9份FMDV,病料的结果与其基因序列测定结果完全一致.结论 已建立了FMDV Asial型江苏/05谱系和新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法,为FMDV的诊断、流行病学调查及疫苗应用奠定了基础.
作者：于长勇；金宁一；王春凤；鲁会军；胡博；刘昊；张丹；牟伟锋；丛艳昭；谷长维；常巧呈；刘存霞；颜雯；叶明 刊期： 2009年第11期
目的 构建乙型肝炎病毒(HBV)P基因分段重组原核表达质粒,并进行目的蛋白的表达和纯化.方法 PCR扩增HBV P基因的不同片段(1～534、1008～2040和2043～2526 bp).分别经双酶切后克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行可溶性分析.用Ni~(2+)-NTA凝胶亲和层析柱纯化融合蛋白,并进行Western blot分析.结果 重组原核表达质粒经酶切及测序证明构建正确.表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,表达量分别约占菌体总蛋白的34%、40%和36%.经Ni~(2+)-NTA纯化的目的蛋白纯度达90%以上,且具有良好的反应原性.结论 已成功构建了HBV P基因分段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了重组蛋白,为研究HBV P蛋白的功能及病毒复制机制奠定了基础.
作者：任鹏程；张旭东；吕海港；祁富军；昝玉玲；刘怡；安丽君 刊期： 2009年第11期
目的 对中华绒螯蟹组织蛋白中的变应原组分进行分析鉴定和分离提取,为研制蟹类食物过敏反应的检测试剂和脱敏制剂奠定基础.方法 中华绒螯蟹粗提蛋白经SDS-PAGE分离,用蟹过敏症患者血清经Western blot分析其变应原组分.粗提蛋白经硫酸铵分段盐析和DEAE-52离子交换层析,分离提取中华绒螯蟹的主要变应原成分,并用蟹过敏症患者血清对层析产物进行ELISA分析.结果 SDS-PAGE分析显示,中华绒螯蟹粗提蛋白有20多条可辨蛋白带,相对分子质量在15 700～1 18 000之间.Western blot分析显示,7份蟹过敏患者血清与粗提蛋白均呈阳性反应,主要有9条反应带.其中相对分子质量为35 000、41 000、48 000和66 000的4条蛋白带与7份患者血清均呈阳性反应.经DEAE-52离子交换层析分离后,变应原主要出现在30%盐析段0.2mol/L洗脱峰、50%盐析段0.2和0. 4mol/L洗脱峰、70%盐析段0. 2和0. 3mol/L洗脱峰、90%盐析段0. 2mol/L洗脱峰内.结论 中华绒螫蟹组织蛋白中的相对分子质量为35 000、41 000、48 000和66 000的组分是其主要变应原.
作者：吴兴达；陈伟；黄海波；刘平静；刘群英 刊期： 2009年第11期
目的 分析Bel亚型的血型血清学特征及其遗传背景.方法 采用红细胞凝集试验检测先证者及其家庭成员红细胞上的A、B、H抗原和血清中的抗-A、抗-B抗体;凝集抑制试验检测唾液中的A、B、H血型物质;吸收放散试验检测红细胞表面是否存在B抗原.用序列特异性引物多聚酶链式反应技术(PCR-SSP)进行ABO血型基因分型.结果 先证者与其父确定为Bel亚型;先证者的两个妹妹分别为Abel亚型和A型;先证者的母亲、配偶、女儿、儿子分别为A、AB、A和B型.结论 Bel亚型有家族遗传性.
作者：周英；李健；吕文彬；陈雪；王乃红；杨群身 刊期： 2009年第11期
目的 优化猪源罗伊乳杆菌冷冻干燥的保护剂配方,提高冻干后的菌体存活率.方法 应用SAS V8.0统计分析软件中的二次正交旋转组合设计方案.进行冷冻干燥保护剂组分配比优化的试验设计,并通过响应面法分析各因素对响应值的效应关系.应用优化的冻干保护剂配方进行3次重复冻干试验,验证预测结果的准确性.结果 经优化后,保护剂各组分佳配比为:蔗糖15%,甘油3%,山梨醇15%,脱脂乳15%.应用优化保护剂进行的3次重复冻干试验,菌体冻干存活率的平均值为71.6%.与预测值(73.6%)基本相符.结论 应用二次正交旋转组合设计结合响应面法,优化了猪源罗伊乳杆菌的冷冻干燥保护剂组分.
作者：朱战波；刘存霞；刘宇；贾永全；谭磊；崔莉；马晓静；车车；崔玉东 刊期： 2009年第11期
目的 构建针对Aurora-A基因的特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,并探讨其对人乳腺癌细胞株MCF-7中Aurora-A基因表达的抑制作用.方法 将具有短发夹结构的2条DNA序列,经退火形成互补双链,再克隆至载体pGCsi.U6/Neo/GFP中,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行序列测定.并通过脂质体法转染至MCF-7细胞中,48 h后观察转染效率,并采用RT-PCR及Western blot法检测siRNA对MCF-7细胞Aurora-A基因mRNA及蛋白表达的影响.结果 测序鉴定证实目的寡核苷酸片段已被克隆至pGCsi-U6/Neo/GFP载体中,Aurora-A-siRNA质粒转染MCF-7细胞48 h后转染效率约为60%,与对照组比较,Aurora-A-siRNA质粒转染的细胞Aurora-A基因mRNA和蛋白的表达均明显下降.结论 已成功构建了Aurora-A-siRNA真核表达质粒,其能明显抑制MCF-7细胞Aurora-A基因的表达,为进一步研究Aurora-A基因的功能奠定了基础.并可能为肿瘤的生物学治疗提供新的方法.
作者：王晓霞；解军；张悦红；赵虹；闫峻 刊期： 2009年第11期
目的 建立CHO细胞表达的重组人白细胞介素-12(rhIL-12)的纯化工艺,并检测纯化的rhIL-12的生物活性.方法 取高效表达rhIL-12的CHO工程细胞培养上清液.采用层析结合硫酸铵沉淀的方法进行分离纯化,ELISA法测定目的蛋白的含量.并计算回收率;SDS-PAGE、SEC-HPLC和Western blot对纯化样品进行鉴定;以PBMC IFNγ诱生法检测纯化rhIL-12的生物活性.结果 纯化的rhIL-12的总回收率为56.4%;经SEC-HPLC检测.其纯度达99.2%;SDS-PAGE分析显示,两个亚基的相对分子质量分别与理论值(40 000和35 000)相符;Western blot分析显示.rhIL-12可与相应抗体发生特异性结合;rhIL-12诱生IFNγ量与rhIL-12浓度呈典型的S型曲线关系,具有剂量依赖性,其效价为8.3×10~6 IU/mg.结论 已建立了CHO细胞表达的rhIL-12纯化丁艺,该工艺成本低,操作简便.纯化产物回收率和纯度高,适于工业化生产.
作者：赵峰；罗慧娟；叶倩君；张霞；张桂铃；王兴勇；张宜俊 刊期： 2009年第11期
目的 优化重组人成纤维细胞生长因子-21(SUMO-rhFGF-21)融合表达工程菌的表达条件及目的蛋白纯化工艺.方法 对工程菌的诱导温度、时间及诱导剂浓度进行优化,并进行罐发酵,对菌体裂解液进行离子交换层析、Ni离子亲和层析及分子筛层析等.纯化产物经SDS-PAGE和HPLC鉴定纯度.结果 在诱导温度为37℃,诱导时间为4 h,IPTG浓度为0.5 mmol/L时,目的蛋白的表达量高,达20.5%;罐发酵收菌量可达66 g/L,目的蛋白的表达量达20.2%;纯化后的rhFGF-21纯度达96%以上.结论 优化了rhFGF-21的表达条件及纯化工艺.为rhFGF-21用于新药开发奠定了基础.
作者：赵宏鑫；邵明龙；杨苹；张耀方；万晓姗；孔祥鑫；王会岩；李校堃 刊期： 2009年第11期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
