刘景春；邹文涛；何子毅；吴远军；车嘉琳；刘赴平
目的 对小鼠神经生长因子(NGF)基因治疗型DNA质粒进行质量控制.方法 用酶切鉴定法和PCR法进行DNA质粒的结构确认,鸡胚背根神经节法和免疫印迹测定DNA质粒表达产物的生物学活性,分光光度法测定浓度,琼脂糖凝胶电泳法和DNA-NPR-HPLC法测定纯度,气相色谱法测定乙醇和异丙醇残留量,琼脂糖凝胶电泳法测定RNA残留量,其余检测项目按<中国药典>三部(2005版)规定进行.结果 用上述方法 对原液和成品进行了检定,各项指标均符合<预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则>和<中国药典>三部(2005版)的要求.结论 所采用的质控方法 和质量标准能够保证该DNA质粒的安全、有效,可用于治疗型DNA质粒的质控.
作者：袁力勇；饶春明；韩春梅；刘兰；李响；郭莹；裴德宁 刊期： 2008年第06期
生物技术的快速发展,导致了生物制品新老产品的快速更替.本文在阅读大量资料基础上,对在2005～2007三年内美国FDA批准和待批准的生物制品进行了概述和比较,以此为据,概括未来几年的国际生物制品市场的主流,以便中国生物制药企业把握生物制品的方向,为企业的产品研发提供信息和建议.
作者：王妍；李世敏 刊期： 2008年第06期
目的 研究同时表达SS1、SS2两种多肽(含前S1、前S2和S三种抗原成分)的重组毕赤酵母工程菌株(GS115-SS1S2)基凶和表达的稳定性.方法 取工程菌原代种子,连续传代至30代,提取15和30代工程菌基因组DNA,PCR分别扩增SS1和SS2基因片段,克隆到pBluescriptⅡSK(十)载体中,进行基因序列测定.对第5、10、15、20、25、30代菌种进行培养和诱导,制备抗原粗提液,并用ELISA法检测其中的前S1、前S2和S的抗原性,同时用RPHA法检测抗原效价.结果 第15和30代菌种基因组中SS1和SS2基因序列与原始菌种完全一致,第5、10、15、20、25、30代菌种表达产物的前S1、前S2和S抗原均为阳性;菌种传至20代,抗原滴度无变化,25代和30代菌种抗原滴度有一定程度下降.结论 重组毕赤酵母工程菌GS115-SS1S2在20代传代过程中,基因和表达稳定性良好.
作者：蒋丽明；谭昌耀；胡波；袁进；金瓯 刊期： 2008年第06期
目的 克隆HIV-1 Vif基因编码区序列,并在原核细胞中表达.方法 构建原核表达载体pMRI,将Vif基因序列克隆至该载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,菌体裂解后获得特异性表达蛋白,用组氨酸标签特异性亲和树脂分离纯化该蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果 表达质粒pMRI-Vif经双酶切,可见约600 bp的Vif基因片段,测序结果 证明质粒构建正确.在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了可溶性Vif蛋白,纯化后经凝胶自动扫捕分析,纯度达85%以上,蛋白浓度约为1 g/L.纯化产物具有良好的抗原特异性.结论 在大肠杆菌中高效表达了可溶性Vif蛋白.
作者：朱可彤；杜娟；王小丹；郭博；孔维；于湘晖 刊期： 2008年第06期
目的 构建蓖麻毒素A链(RTA)和RTA-KEEL/KDEL基因表达载体,并检测重组蛋白的细胞毒性作用.方法 用PeR法从蓖麻毒素基因组中扩增出RTA及RTA-KEEL/KDEL基因,连接T载体,测序正确后,定向插入质粒pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-RTA和pET-28a-RTA-KEEL/KDEL,转化感受态E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行鉴定.结果 所表达的RTA及RTA-KEEL/KDEL非融合蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量约为31 000,Westernblot分析具有反应原性,MTS法检测,RTA-KEEL/KDEL对CHO细胞具有比RTA更强的杀伤作用.结论 已成功构建RTA和RTA-KEEL/KDEL表达载体,表达的重组蛋白具有生物学活性.
作者：廖鹏；马青原；刘文森；万家余；邢丽杰；李吉平；高宏伟 刊期： 2008年第06期
目的 表达并纯化重组蛹虫草超氧化物歧化酶脱辅基蛋白,并考查各种金属离子对其活性重建的作用.方法 用不含Cu2+和Zn2+的培养基培养重组菌株,并表达重组蛋白,采用DEAE-FF和CM-52进行纯化;在脱辅基蛋白溶液中加入Cu2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+Ag+,测定SOD酶活力的变化.结果 蛹虫草脱辅基Cu,Zn-SOD在不含Cu2+和Zn2+的培养基中得到表达,纯化后的样品经SDS-PAGE分析,在相对分子质量17 000处出现单一条带,经活性电泳分析无酶活力;脱辅基蛋白活性重建的适宜Cu2+浓度为0.005 mmol/L,但其紫外吸收图谱与天然SOD不同;0.1mmol/L的Mn2+、Mn2+、Ni2+、Ag2+重建的酶活力远低于Cu2+重建的cm-SOD的酶活力.结论 已成功表达并纯化了蛹虫草脱辅基Cu,Zn-SOD,各种金属离子只能有限地重建脱辅基Cu,Zn-SOD的活性.
作者：胡圣尧；聂志妍；王尊生；袁勤生 刊期： 2008年第06期
目的 构建复合通用CD4Th细胞表位基因的原核表达载体,检测表达蛋白的免疫学特性,并探讨其作为载体蛋白的可能性.方法 以限制性核酸内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切重组质粒pUC19-Pep10,回收长度为650 bp左右的目的 片段.插入原核表达载体pQE30中,获得重组质粒pQE30-Pep10,转化大肠杆菌M15后进行诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Westem blot分析后,进行亲和层析纯化及透析复性,获得重组蛋白Pep10,将Pep10和TT分别免疫雌性BALB/c小鼠,以间接ELISA法和流式细胞术分别检测其免疫原性和淋巴细胞增殖效应.结果 SDS-PAGE显示重组蛋白Pep10相对分子质量约为23 000,表达量达41%,主要以包涵体形式表达,Western blot检测可见特异性染色条带,纯化后纯度达94%,共获得42 mg重组蛋白.其体外淋巴细胞增殖效应与TT相当,增殖指数分别为4.216和4.736,而免疫原性远低于TT,特异性IgG几何平均滴度(GMT)分别为1:15 758.65和1:67 558.81.结论 已成功构建重组原核表达载体pQE30-Pep10,并在大肠杆菌中高效表达,且表达的重组蛋白Pep10具有良好的淋巴细胞增殖效应和较低的免疫原性,有可能作为一种新型载体蛋白,用于多糖结合疫苗的研制.
作者：刘汉平；方志正 刊期： 2008年第06期
目的 表达、纯化重组人B7-H4IgV融合蛋白,并检测其活性.方法 将人B7-H4胞外片段IgV区基因插入pQE-30原核表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达.表达产物经Ni2+-NTA柱亲和层析纯化,并进行Western blot鉴定.用纯化的rhB7-H4IgV蛋白免疫昆明小鼠,经ELISA、流式细胞术测定小鼠抗血清的活性;免疫SP2/0荷瘤小鼠,观察对肿瘤细胞生长的抑制作用.结果 表达的rhB7-H4IgV蛋白约占菌体总蛋白的25%,纯化后蛋白纯度为93%,浓度约为0.5 mg/ml,与抗His单抗可产生特异性反应条带.免疫昆明小鼠产生的抗血清效价可达1:10 000,可与SP2/0肿瘤细胞结合.rhB7-H4IgV蛋白对SP2/0移植瘤生长具有一定的抑制作用.结论 已成功表达并纯化了重组人B7-H4IgV融合蛋白,纯化蛋白可诱发小鼠体内免疫应答,产生的抗体能与表达B7-H4的肿瘤细胞SP2/0结合,rhB7-H4IgV蛋白在一定程度上能抑制SP2/0移植瘤的生长.
作者：朱文华；姜昌丽；张存；游彦杰；王伟华；刘艳；张珍；冉永刚；叶星明；李维娜；韩苇；张英起 刊期： 2008年第06期
目的 构建水泡性口炎病毒(VSV)保护性抗原基因的重组核酸疫苗质粒,并检测其免疫原性.方法 利用RT-PCR从VSV中扩增G蛋白基凶,构建重组表达质粒pIRES-G1500,转染BHK-21细胞,以间接免疫荧光、PCR、SDS-PAGE、ELISA和Western blot检测质粒的表达,用核酸疫苗质粒免疫BALB/C小鼠,检测小鼠的细胞免疫和体液免疫水平.结果 构建的重组核酸疫苗质粒在BHK-21细胞中获得正确表达,质粒免疫小鼠后,可刺激脾细胞、T淋巴细胞亚类数量及CTL杀伤活性显著升高,并可产生高滴度的抗VSV特异性抗体.结论 该重组核酸疫苗质粒可作为VSV的候选疫苗.
作者：周学章；李元刚；高丰 刊期： 2008年第06期
目的 比较5μg/剂重组乙型肝炎疫苗(酵母)和10μg/剂重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)免疫儿童后的抗体应答和免疫持久性.方法 1 151和996名6～12岁儿童分别按0,1,6月免疫程序接种14批酵母疫苗和5批CHO疫苗,于第1针免后3(T3)、7(T7)、12(T12)、24(T24)、36(T36)、60(T60)月检测抗-HBs应答,分别对接种10批酵母、5批CHO,4批酵母、4批CHO,2批酵母和2批CHO疫苗的儿童进行首针免疫后T24、T36和T60的随访,采用放免法(RIA)检测抗-HBs水平.结果 首针免疫后12个月内,接种两种疫苗的儿童抗体阳转率和抗体滴度差异均无显著意义;T24、T36时,接种CHO疫苗的儿童抗体阳转率显著高于酵母疫苗.结论 应提高酵母疫苗免疫儿童现用剂量.
作者：何鹏；吴晓音；荆庆；杨超关；时景璞；李荣成；李艳萍；胡忠玉；李河民；梁争论 刊期： 2008年第06期
目的 了解韶关地区人群的ABO、Rh、MN、P及Jk(a-b-)血型的分布规律,为献血者招募及科学合理储存血液提供理论依据.方法 采用U型96孔微量板法,对献血者血样进行ABO正反定型及Rh、MN、P血型检测,结果 可疑者用试管法确认,并进行Jk(a-b-)表型筛查.结果 ABO血型基因频率rPq,表型分布规律为0ABAB;Rh(D)阴性占0.16%;A2亚型在AB型的检出率高于A型;MN血型的基因频率mn,表型分布规律为MNMN;P血型的基因频率P2P2,表型分布特征为P2P1;Jk(a-b-)表型检出率为1:22 161.5.结论 韶关地区血型分布以O型所占比例多,且A型多于B型,A2亚型检m率高,Rh(D)阴性率低,Jk(a-b-)表型更低;应加大0型、A型献血者的招募并相应增加其库存量,特别是要加强Rh(D)阴性和Jk(a-b-)表型献血者的档案管理、Rh.用性血液和Jk(a-b-)血液的冰冻保存工作及Jk(a-b-)人员的自身储血工作.
作者：罗洪清；元霞；刘凯波；汤永毅；郑静敏 刊期： 2008年第06期
发光免疫分析技术是近年来发展起来的免疫标记技术.该技术包括化学发光免疫分析法、时间分辨免疫荧光法、电化学发光免疫分析法和光激化学发光免疫分析法.本文分别对上述各种方法 的检测原理及在病毒性肝炎标志物检测中的应用作简要综述.
作者：吴星；祁自柏 刊期： 2008年第06期
目的 表达幽门螺杆菌hpaA基因的重组蛋白,并检测其抗原性和免疫原性.方法 用PCR方法 从H. pylriDNA中扩增hpaA基因片段,插入原核表达载体pQE-30,转化大肠杆菌DH5α,进行诱导表达,SDS-PAGE分析表达蛋白的相对分子质量和表达形式,Ni2+-NTA树脂纯化后,用Western blot鉴定其反应原性.用重组蛋白免疫家兔,检测其免疫原性.用重组蛋白免疫小鼠.分别检测胃黏膜、PP细胞悬液及小肠黏液中的IgG和sIgA的含量.结果 重组表达质粒pQE30-hpaA构建正确,所得序列完整,插入的基因片段全长783 bp,与基因文库中的hpaA基因同源性达97.3%.表达产物相对分子质量为30 000,目的 蛋白表达量占全菌总量的31.67%,主要存在于碎菌后上清中,纯度在90%以上.Western blot显示该蛋白可与病人血清特异性结合,免疫血清能与重组蛋白反应,双扩散效价为1:16.小鼠体内IgG、IgA、sIgA含量明显高于PBS对照组.结论 已获得高纯度的HpaA重组蛋白,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,可用于研制幽门螺杆菌疫苗.
作者：栗俊杰；杨致邦；张任飞；周侠；夏丽君 刊期： 2008年第06期
目的 优化猪源罗伊乳杆菌的发酵培养基4个组分的配比.方法 应用SAS V8.0统计分析软件中的二次正交旋转组合设计方案进行试验设计,并通过响应面法分析各因素对响应值的效应关系.结果 优化后培养基各组分比例为:大豆蛋白胨5%,葡萄糖1%,酵母浸粉1.7%,低聚糖0.3%.应用此配比进行了3次重复发酵试验,A620的平均值为1.073,与预测值(1.092)基本相符.结论 二次正交旋转组合设计结合响应面法可用于发酵培养基组分的优化和分析.
作者：朱战波；刘宇；贾永全；张军；崔玉东 刊期： 2008年第06期
目的 从人的肠道中分离具有高黏附性能的益生乳酸菌,为其应用于临床研究提供依据.方法 采用改良的LAMVAB选择性培养基.取肠黏膜活检标本进行分级分离.对分离的乳酸菌进行生理、生化鉴定和16S rRNA序列测定,并对其耐酸、耐胆盐特性、黏附性能以及抑菌特性等进行分析.结果 从人肠黏膜活检标本中分离出1株乳酸菌L2,该菌能在改良的LAMVAB选择性培养基上生长,并能抵抗pH 2.5的酸性环境和0.3%的高胆盐环境;体外黏附试验显示,该菌株具有较好的黏附性能,对人肠上皮样细胞Caco-2和大鼠小肠上皮细胞IEC-6的黏附指数分别达(595±125.76)/100 cells和(538±65.2)/100 cells,且黏附具有Ca2+依赖性.对大肠杆菌、铜绿假单胞菌等具有较强的抑制作用,对益生菌鼠李糖乳杆菌LGG和嗜酸乳杆菌L05013-12无抑制作用.该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum).结论 植物乳杆菌L2具有较好的黏附性能,且耐酸、耐胆盐性能以及抑菌特性均较佳,具备作为益生菌使用的潜能.
作者：王斌；李秋荣；刘放南；罗楠；李幼生；李宁；黎介寿 刊期： 2008年第06期
目的 对1份正反定型不符的献血者标本进行血清学及分子特性分析.方法 采用吸收放散试验进行红细胞弱抗原检测,SSP-PCR方法 进行基因分型,PCR产物克隆后进行测序分析.结果 该标本血清学反应格局符合Ax亚型,分子生物学检测为A型.测序结果 表明,Exon4含有2个连续碱基错义突变位点,分别为nt187GA,nt188CT,导致第63位氨基酸的改变(Arg63His).结论 该Ax亚型是由于Exon4 2个碱基突变,引起氨基酸的改变,导致糖基转移酶活性的降低,从而使红细胞上表达的A抗原大大减少.
作者：刘景春；邹文涛；何子毅；吴远军；车嘉琳；刘赴平 刊期： 2008年第06期
目的 制备抗霍乱弧菌O1群特异性单克隆抗体(McAb),并进行鉴定.方法 以福尔马林灭活的O1群霍乱弧菌免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术建立分泌抗O1群霍乱弧菌McAb的杂交瘤细胞株.对配对较好的6个细胞株分泌的McAb进行腹水效价、免疫球蛋白类及亚类、抗体亲和常数测定及凝集试验和稳定性试验.与细菌培养法对比检测208份临床标本.结果 6个细胞株分泌的McAb腹水效价均为105,均为IgM;抗体亲和常数为1.84×105～5.38 × 107;且均与O1群霍乱弧菌菌株发生凝集反应,与霍乱弧菌O139群、大肠杆菌、出血性大肠杆菌O157:H7、副溶血弧菌、麦弧菌、河弧菌、结肠炎耶尔森菌、普通变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌及各型副伤寒杆菌均不发生凝集反应.6个分泌McAb的细胞株连续培养15周,经液氮冻存12个月后复苏,仍能稳定分泌抗体;与细菌培养法对比检测208份临床标本,特异性和灵敏度均达100%.结论 制备的McAb具有较高的特异性,有可能用于开发霍乱弧菌O1群的检测试剂.
作者：杨璇；李学民；杜英；杨书豪；付庆；朱沙 刊期： 2008年第06期
目的 构建携带颗粒裂解肽G13结构域的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达目的 蛋白,并检测其对大肠杆菌活力的影响.方法 人工合成G13结构域编码DNA序列,PCR扩增后,用T.A克隆法与pBAD/TOPO ThioFusion表达载体连接.通过PCR鉴定及测序筛选阳性重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经阿拉伯糖诱导表达,SDS-PAGE检测表达情况,同时监测诱导表达前后工程菌A600值的变化及菌液中的突变体.结果 工程菌经诱导,表达出相对分子质量约15 000的特异蛋白,表达量占菌体总蛋白的3%左右.随着外源蛋白的表达,菌液A600值下降,随后又缓慢上升.提取的质粒测序结果 表明,其启动子的-35区和-10区均发生了突变,随着诱导时间的增加,突变细胞的比例不断增加.结论 已成功构建了G13结构域原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达出G13融合蛋白.该异源蛋白的表达导致丁程菌的活力降低.
作者：杨金环；查向东；方红；刘小强；屈满义 刊期： 2008年第06期
目的 制备检测抗狂犬病马血清效价的ELISA试剂.方法 采用ELISA间接法.先用抗狂犬病病毒IgY包被酶标板,并确定其适包被浓度;制备酶标二抗,并确定其佳使用浓度.对试剂的灵敏度、特异性、精密性、稳定性及与小鼠中和试验结果 的相关性进行考核.结果 抗狂犬病病毒IgY和酶标二抗的适浓度分别为10μg/ml和1:1 500,试剂灵敏度为0.072 IU/ml,特异性良好,批间及试验间变异系数均小于11%,37℃放置3和5 d检测样品结果 与放置前差异无显著意义,与小鼠中和试验结果 呈正相关.结论 所制备的抗狂犬病马血清效价ELISA检测试剂盒,可用于抗狂犬病马血清效价的检测.
作者：薛向光；柳春红；贾媛；张梅；匡科伟；李文娟；郭立君；郭凤云 刊期： 2008年第06期
目的 制备壳聚糖(CTS)微珠亲和层析介质,并进行初步应用.方法 采用多种化学方法 对CTS的表面基团进行改造,使其活化.用此改性CTS进行羊抗人IgG及小牛血清纤维连接蛋白(FN)的纯化.结果 此改性的CTS微珠粒径在40～160μm之间,每克可溶胀至4 ml.活化的CTS对人丙种球蛋白的吸附量为15～25 mg/g CTS,对明胶的吸附量为5.8-6.5 mg/gCTS.采用此方法 纯化的羊抗人IgG及FN与Sepharose 4B法纯化效果一致.结论 已制备的壳聚糖微珠亲和层析介质,其性质稳定且价格较低,是一种可以广泛应用的亲和层析介质.
作者：栾勇；王丹；何小曼；孔维臣 刊期： 2008年第06期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
