栗俊杰；杨致邦；张任飞；周侠；夏丽君
目的 构建含大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(LTB)和鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(MOMP)融合基因(LTB-MOMP)的表达载体,并在原核细胞中表达融合蛋白.方法 应用PCR从质粒EWD299和鹦鹉热衣原体中扩增LTB和MOMP基因,经与柔性肽连接后,插入pET-28a载体中,酶切鉴定正确后,转化大肠杆菌Rosetta,IPTG诱导表达,并纯化目的 蛋白.SDS-PAGE和Western blot分析外源蛋白的表达及表达产物的抗原特异性.结果 重组工程菌可以表达相对分子质量约为54 000的LTB-MOMP融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的42%,LTB-MOMP融合蛋白具有良好的抗原特异性.结论 已成功构建了LTB-MOMP融合基因表达载体,并在原核细胞中获得表达.
作者：张秀香；袁子国；李景文；于慧；郭振南；赵艳；王洪预；王庆钰 刊期： 2008年第06期
目的 制备检测抗狂犬病马血清效价的ELISA试剂.方法 采用ELISA间接法.先用抗狂犬病病毒IgY包被酶标板,并确定其适包被浓度;制备酶标二抗,并确定其佳使用浓度.对试剂的灵敏度、特异性、精密性、稳定性及与小鼠中和试验结果 的相关性进行考核.结果 抗狂犬病病毒IgY和酶标二抗的适浓度分别为10μg/ml和1:1 500,试剂灵敏度为0.072 IU/ml,特异性良好,批间及试验间变异系数均小于11%,37℃放置3和5 d检测样品结果 与放置前差异无显著意义,与小鼠中和试验结果 呈正相关.结论 所制备的抗狂犬病马血清效价ELISA检测试剂盒,可用于抗狂犬病马血清效价的检测.
作者：薛向光；柳春红；贾媛；张梅；匡科伟；李文娟；郭立君；郭凤云 刊期： 2008年第06期
目的 构建蓖麻毒素A链(RTA)和RTA-KEEL/KDEL基因表达载体,并检测重组蛋白的细胞毒性作用.方法 用PeR法从蓖麻毒素基因组中扩增出RTA及RTA-KEEL/KDEL基因,连接T载体,测序正确后,定向插入质粒pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-RTA和pET-28a-RTA-KEEL/KDEL,转化感受态E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行鉴定.结果 所表达的RTA及RTA-KEEL/KDEL非融合蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量约为31 000,Westernblot分析具有反应原性,MTS法检测,RTA-KEEL/KDEL对CHO细胞具有比RTA更强的杀伤作用.结论 已成功构建RTA和RTA-KEEL/KDEL表达载体,表达的重组蛋白具有生物学活性.
作者：廖鹏；马青原；刘文森；万家余；邢丽杰；李吉平；高宏伟 刊期： 2008年第06期
目的 对小鼠神经生长因子(NGF)基因治疗型DNA质粒进行质量控制.方法 用酶切鉴定法和PCR法进行DNA质粒的结构确认,鸡胚背根神经节法和免疫印迹测定DNA质粒表达产物的生物学活性,分光光度法测定浓度,琼脂糖凝胶电泳法和DNA-NPR-HPLC法测定纯度,气相色谱法测定乙醇和异丙醇残留量,琼脂糖凝胶电泳法测定RNA残留量,其余检测项目按<中国药典>三部(2005版)规定进行.结果 用上述方法 对原液和成品进行了检定,各项指标均符合<预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则>和<中国药典>三部(2005版)的要求.结论 所采用的质控方法 和质量标准能够保证该DNA质粒的安全、有效,可用于治疗型DNA质粒的质控.
作者：袁力勇；饶春明；韩春梅；刘兰；李响；郭莹；裴德宁 刊期： 2008年第06期
目的 克隆HIV-1 Vif基因编码区序列,并在原核细胞中表达.方法 构建原核表达载体pMRI,将Vif基因序列克隆至该载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,菌体裂解后获得特异性表达蛋白,用组氨酸标签特异性亲和树脂分离纯化该蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果 表达质粒pMRI-Vif经双酶切,可见约600 bp的Vif基因片段,测序结果 证明质粒构建正确.在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了可溶性Vif蛋白,纯化后经凝胶自动扫捕分析,纯度达85%以上,蛋白浓度约为1 g/L.纯化产物具有良好的抗原特异性.结论 在大肠杆菌中高效表达了可溶性Vif蛋白.
作者：朱可彤；杜娟；王小丹；郭博；孔维；于湘晖 刊期： 2008年第06期
目的 从人的肠道中分离具有高黏附性能的益生乳酸菌,为其应用于临床研究提供依据.方法 采用改良的LAMVAB选择性培养基.取肠黏膜活检标本进行分级分离.对分离的乳酸菌进行生理、生化鉴定和16S rRNA序列测定,并对其耐酸、耐胆盐特性、黏附性能以及抑菌特性等进行分析.结果 从人肠黏膜活检标本中分离出1株乳酸菌L2,该菌能在改良的LAMVAB选择性培养基上生长,并能抵抗pH 2.5的酸性环境和0.3%的高胆盐环境;体外黏附试验显示,该菌株具有较好的黏附性能,对人肠上皮样细胞Caco-2和大鼠小肠上皮细胞IEC-6的黏附指数分别达(595±125.76)/100 cells和(538±65.2)/100 cells,且黏附具有Ca2+依赖性.对大肠杆菌、铜绿假单胞菌等具有较强的抑制作用,对益生菌鼠李糖乳杆菌LGG和嗜酸乳杆菌L05013-12无抑制作用.该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum).结论 植物乳杆菌L2具有较好的黏附性能,且耐酸、耐胆盐性能以及抑菌特性均较佳,具备作为益生菌使用的潜能.
作者：王斌；李秋荣；刘放南；罗楠；李幼生；李宁；黎介寿 刊期： 2008年第06期
目的 表达并纯化重组蛹虫草超氧化物歧化酶脱辅基蛋白,并考查各种金属离子对其活性重建的作用.方法 用不含Cu2+和Zn2+的培养基培养重组菌株,并表达重组蛋白,采用DEAE-FF和CM-52进行纯化;在脱辅基蛋白溶液中加入Cu2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+Ag+,测定SOD酶活力的变化.结果 蛹虫草脱辅基Cu,Zn-SOD在不含Cu2+和Zn2+的培养基中得到表达,纯化后的样品经SDS-PAGE分析,在相对分子质量17 000处出现单一条带,经活性电泳分析无酶活力;脱辅基蛋白活性重建的适宜Cu2+浓度为0.005 mmol/L,但其紫外吸收图谱与天然SOD不同;0.1mmol/L的Mn2+、Mn2+、Ni2+、Ag2+重建的酶活力远低于Cu2+重建的cm-SOD的酶活力.结论 已成功表达并纯化了蛹虫草脱辅基Cu,Zn-SOD,各种金属离子只能有限地重建脱辅基Cu,Zn-SOD的活性.
作者：胡圣尧；聂志妍；王尊生；袁勤生 刊期： 2008年第06期
目的 构建复合通用CD4Th细胞表位基因的原核表达载体,检测表达蛋白的免疫学特性,并探讨其作为载体蛋白的可能性.方法 以限制性核酸内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切重组质粒pUC19-Pep10,回收长度为650 bp左右的目的 片段.插入原核表达载体pQE30中,获得重组质粒pQE30-Pep10,转化大肠杆菌M15后进行诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Westem blot分析后,进行亲和层析纯化及透析复性,获得重组蛋白Pep10,将Pep10和TT分别免疫雌性BALB/c小鼠,以间接ELISA法和流式细胞术分别检测其免疫原性和淋巴细胞增殖效应.结果 SDS-PAGE显示重组蛋白Pep10相对分子质量约为23 000,表达量达41%,主要以包涵体形式表达,Western blot检测可见特异性染色条带,纯化后纯度达94%,共获得42 mg重组蛋白.其体外淋巴细胞增殖效应与TT相当,增殖指数分别为4.216和4.736,而免疫原性远低于TT,特异性IgG几何平均滴度(GMT)分别为1:15 758.65和1:67 558.81.结论 已成功构建重组原核表达载体pQE30-Pep10,并在大肠杆菌中高效表达,且表达的重组蛋白Pep10具有良好的淋巴细胞增殖效应和较低的免疫原性,有可能作为一种新型载体蛋白,用于多糖结合疫苗的研制.
作者：刘汉平；方志正 刊期： 2008年第06期
目的 分析武汉地区人呼吸道合胞病毒(RSV)分离株的G蛋白基因的遗传特征.方法 使用不同的特异性引物,对武汉地区2006年分离的9株RSV进行G基因3'末端第2个高变区的序列测定,并进行基因分型和基因亲缘关系分析.结果 分离的9株RSV中,33.3%(3/9)为A亚型,属GA2基因型;66.7%(6/9)为B亚型,其中1株属于BA基因型,5株属于GB8基因型.9株RSV G蛋白与原型株核苷酸同源性为84.5%-99.0%,且与原型株相比,在205～230位氨基酸中有5-8个位点氨基酸变异,还存在糖基化位点的改变.结论 2006年初在武汉地区存在着由不同RSV株引起的传播链,A、B亚型共循环,B亚型足优势流行亚型;9株RSV G蛋白与原型比较,存在明显的差异.
作者：陈晓琦；徐葛林；全家妩 刊期： 2008年第06期
目的 构建水泡性口炎病毒(VSV)保护性抗原基因的重组核酸疫苗质粒,并检测其免疫原性.方法 利用RT-PCR从VSV中扩增G蛋白基凶,构建重组表达质粒pIRES-G1500,转染BHK-21细胞,以间接免疫荧光、PCR、SDS-PAGE、ELISA和Western blot检测质粒的表达,用核酸疫苗质粒免疫BALB/C小鼠,检测小鼠的细胞免疫和体液免疫水平.结果 构建的重组核酸疫苗质粒在BHK-21细胞中获得正确表达,质粒免疫小鼠后,可刺激脾细胞、T淋巴细胞亚类数量及CTL杀伤活性显著升高,并可产生高滴度的抗VSV特异性抗体.结论 该重组核酸疫苗质粒可作为VSV的候选疫苗.
作者：周学章；李元刚；高丰 刊期： 2008年第06期
发光免疫分析技术是近年来发展起来的免疫标记技术.该技术包括化学发光免疫分析法、时间分辨免疫荧光法、电化学发光免疫分析法和光激化学发光免疫分析法.本文分别对上述各种方法 的检测原理及在病毒性肝炎标志物检测中的应用作简要综述.
作者：吴星；祁自柏 刊期： 2008年第06期
生物技术的快速发展,导致了生物制品新老产品的快速更替.本文在阅读大量资料基础上,对在2005～2007三年内美国FDA批准和待批准的生物制品进行了概述和比较,以此为据,概括未来几年的国际生物制品市场的主流,以便中国生物制药企业把握生物制品的方向,为企业的产品研发提供信息和建议.
作者：王妍；李世敏 刊期： 2008年第06期
目的 对1份正反定型不符的献血者标本进行血清学及分子特性分析.方法 采用吸收放散试验进行红细胞弱抗原检测,SSP-PCR方法 进行基因分型,PCR产物克隆后进行测序分析.结果 该标本血清学反应格局符合Ax亚型,分子生物学检测为A型.测序结果 表明,Exon4含有2个连续碱基错义突变位点,分别为nt187GA,nt188CT,导致第63位氨基酸的改变(Arg63His).结论 该Ax亚型是由于Exon4 2个碱基突变,引起氨基酸的改变,导致糖基转移酶活性的降低,从而使红细胞上表达的A抗原大大减少.
作者：刘景春；邹文涛；何子毅；吴远军；车嘉琳；刘赴平 刊期： 2008年第06期
目的 构建表达人巨细胞病毒(HCMV)pp65336-507基因的毕赤酵母工程菌.方法 扩增HCMVpp65336-507基因,构建重组表达质粒pPIC9/pp653336-507,转化毕赤酵母菌GS115.PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE及Western blot鉴定表达产物.结果 已构建和筛选到阳性表达克隆株,表达的pp653336-507蛋白的相对分子质量约为26 000,能与特异的pp65抗体结合.结论 已成功构建了分泌表达pp65336-507蛋白的毕赤酵母工程菌,表达的目的 蛋白具有良好的反应原性.
作者：郭海英；时成波；隋红；迟春萍；刘淑玲；张勇；郭风云；郭立君 刊期： 2008年第06期
目的 表达、纯化重组人B7-H4IgV融合蛋白,并检测其活性.方法 将人B7-H4胞外片段IgV区基因插入pQE-30原核表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达.表达产物经Ni2+-NTA柱亲和层析纯化,并进行Western blot鉴定.用纯化的rhB7-H4IgV蛋白免疫昆明小鼠,经ELISA、流式细胞术测定小鼠抗血清的活性;免疫SP2/0荷瘤小鼠,观察对肿瘤细胞生长的抑制作用.结果 表达的rhB7-H4IgV蛋白约占菌体总蛋白的25%,纯化后蛋白纯度为93%,浓度约为0.5 mg/ml,与抗His单抗可产生特异性反应条带.免疫昆明小鼠产生的抗血清效价可达1:10 000,可与SP2/0肿瘤细胞结合.rhB7-H4IgV蛋白对SP2/0移植瘤生长具有一定的抑制作用.结论 已成功表达并纯化了重组人B7-H4IgV融合蛋白,纯化蛋白可诱发小鼠体内免疫应答,产生的抗体能与表达B7-H4的肿瘤细胞SP2/0结合,rhB7-H4IgV蛋白在一定程度上能抑制SP2/0移植瘤的生长.
作者：朱文华；姜昌丽；张存；游彦杰；王伟华；刘艳；张珍；冉永刚；叶星明；李维娜；韩苇；张英起 刊期： 2008年第06期
目的 观察复肝肽口服液(主要成分为新生牛肝活性肽)对大鼠四氯化碳(CCI4)慢性肝损伤的保护作用.方法 制备大鼠CCI4慢性肝损伤模型,观察复肝肽口服液对慢性肝损伤大鼠红、白细胞数、血色素、血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、白球蛋白比例(A/G)的影响.结果 与模型对照组比较,复肝肽3个剂量组大鼠的A/G值均明显升高,肝组织病变明显减轻,高剂量组ALT、AST明显降低.结论 复肝肽口服液对慢性肝损伤有明显的保护作用.
作者：傅颖；刘冬英；王茵 刊期： 2008年第06期
目的 观察重组人干扰素α2b(rhIFNα2b)脂质体乳膏的抗病毒及毒性作用.方法 采用体外和体内抗病毒试验以及大鼠急性和长期毒性试验,检测rhIFNα2b脂体乳膏的抗病毒及毒性作用.结果 rhIFNα2b脂质体乳膏对单纯疱疹病毒和水痘疱疹病毒均有明显的抑制作用.在大鼠试验中,10 000倍临床剂量用药后1周以及4 000倍临床剂量用药后4周,均未出现毒性反应.结论 rhIFNα2b脂质体乳膏用于治疗病毒性疱疹病是安全有效的.
作者：李云富；张水华；何凌冰；田建明；李龙云；王妍 刊期： 2008年第06期
目的 比较5μg/剂重组乙型肝炎疫苗(酵母)和10μg/剂重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)免疫儿童后的抗体应答和免疫持久性.方法 1 151和996名6～12岁儿童分别按0,1,6月免疫程序接种14批酵母疫苗和5批CHO疫苗,于第1针免后3(T3)、7(T7)、12(T12)、24(T24)、36(T36)、60(T60)月检测抗-HBs应答,分别对接种10批酵母、5批CHO,4批酵母、4批CHO,2批酵母和2批CHO疫苗的儿童进行首针免疫后T24、T36和T60的随访,采用放免法(RIA)检测抗-HBs水平.结果 首针免疫后12个月内,接种两种疫苗的儿童抗体阳转率和抗体滴度差异均无显著意义;T24、T36时,接种CHO疫苗的儿童抗体阳转率显著高于酵母疫苗.结论 应提高酵母疫苗免疫儿童现用剂量.
作者：何鹏；吴晓音；荆庆；杨超关；时景璞；李荣成；李艳萍；胡忠玉；李河民；梁争论 刊期： 2008年第06期
目的 利用毕赤酵母表达系统表达IL-6(23)-PE40KDEL重组靶向毒素,并检测其杀伤肿瘤细胞的活性.方法 采用PCR技术,将目的 基因IL-6(23)-PE40KDEL插入到pPIC9载体中SnaB I与Not I位点,电转化至巴斯德毕赤酵母GS115中,筛选Mut型重组酵母;甲醇诱导表达,体外细胞试验检测其细胞毒性.结果 获得12株Mut-重组酵母,其中8株具有细胞毒性,表达产物占上清液蛋白的9%～12.7%;15μl以上的表达产物在体外对SP2/0、HL-60、HepG2、BGC-832和HCT-116细胞具有高度杀伤活性,对CK、HeLa和NIH/3T3细胞无明显影响.结论 IL-6(23)-PE40KDEL重组靶向毒素在毕赤酵母GSI15中获得表达,并具有选择杀伤肿瘤细胞的活性.
作者：郭德军；柳增善；潘风光 刊期： 2008年第06期
目的 表达幽门螺杆菌hpaA基因的重组蛋白,并检测其抗原性和免疫原性.方法 用PCR方法 从H. pylriDNA中扩增hpaA基因片段,插入原核表达载体pQE-30,转化大肠杆菌DH5α,进行诱导表达,SDS-PAGE分析表达蛋白的相对分子质量和表达形式,Ni2+-NTA树脂纯化后,用Western blot鉴定其反应原性.用重组蛋白免疫家兔,检测其免疫原性.用重组蛋白免疫小鼠.分别检测胃黏膜、PP细胞悬液及小肠黏液中的IgG和sIgA的含量.结果 重组表达质粒pQE30-hpaA构建正确,所得序列完整,插入的基因片段全长783 bp,与基因文库中的hpaA基因同源性达97.3%.表达产物相对分子质量为30 000,目的 蛋白表达量占全菌总量的31.67%,主要存在于碎菌后上清中,纯度在90%以上.Western blot显示该蛋白可与病人血清特异性结合,免疫血清能与重组蛋白反应,双扩散效价为1:16.小鼠体内IgG、IgA、sIgA含量明显高于PBS对照组.结论 已获得高纯度的HpaA重组蛋白,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,可用于研制幽门螺杆菌疫苗.
作者：栗俊杰；杨致邦；张任飞；周侠；夏丽君 刊期： 2008年第06期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
