学术投稿

FABP7基因真核表达载体的构建及其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

王毅君;车团结;张萍;闫琨;李琳;王勤;陈卫

关键词:脑脂肪酸结合蛋白, 真核表达, 乳腺癌, MCF-7细胞, 增殖
摘要:目的 构建脑脂肪酸结合蛋白(BLBP/B-FABP,FABP7)基因的真核表达载体,并检测其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响.方法 采用逆转录方法从星型细胞瘤组织中扩增FABP7基因,双酶切后插人线性化的pcDNA3.1载体真核启动子下游,构建重组真核表达载体,转染人乳腺癌细胞MCF-7后,采用半定量RT-PCR检测FABP7基因mRNA的表达,MTY法检测细胞的增殖活性、流式细胞术检测细胞的周期变化情况,并对细胞进行计数.结果 FABP7基因重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确,转染MCF-7细胞后48、72和96 h,pcDNA3.1-FABP7组的细胞数和细胞的A490值均比pcDNA3.1空质粒组明显降低,G1期细胞百分含量均明显升高.结论 已成功构建了FABP7基因的真核表达载体,该载体可抑制人乳腺癌细胞MCF-7的增殖.
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    作者:魏树源;祁春华;陈晓琦;桂金柱;王珍 刊期: 2008年第11期

  • 骨髓基质干细胞对大鼠肝纤维化细胞凋亡的影响

    目的 探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)对大鼠肝纤维化细胞(CFSCs)凋亡的影响.方法 常规培养BMSCs、CFSCs和大鼠肝细胞系BRL,并双层共培养CFSCs与BMSCs.用ELISA方法检测BMSCs培养上清中NGF、HGF和TGF-β1的浓度;RT-PCR检测与BMSCs共培养的CFSCs及BRL的p75表达;TUNEL法检测BMSCs分泌的细胞因子封闭后对CFSCs凋亡的影响.结果 BMSCs可分泌NGF、HGF、TGF-β1等细胞因子,且随着培养时间的延长,其分泌量逐渐增多;BRL不表达p75,CFSCs表达p75,且与BMSCs共培养后,其表达量增高;分别用p75的阻断剂TAT-Pep5、HGF的中和抗体和JNK的阻滞剂sp600125作用后,BMSCs诱导CFSCs凋亡的比例均明显降低;封闭TGF-β1后,BMSCs诱导CFSCs凋亡的比例增高.结论 BMSCs能够通过分泌NGF和HGF促进CFSCs的凋亡,这种凋亡诱导作用依赖于JNK的活性,并且在封闭TGF-β1后增强.

    作者:史立军;王菁华;徐克达;曹振远;孙博;王广友;王丹丹;孔庆飞;李呼伦 刊期: 2008年第11期

  • 神经内分泌因子对体外培养肝细胞ApoB100mRNA丰度的影响

    目的 分析神经内分泌因子胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白对体外培养肝细胞ApoB100 mRNA丰度的影响,以阐明其在奶牛肝极低密度脂蛋白(VLDL)组装与转运中的凋控作用.方法 在体外培养的肝细胞培养液中分别添加胰岛素、胰高血糖素和廋蛋白,应用实时荧光定量PCR法检测神经内分泌因子对体外培养肝细胞中载脂蛋白B100(ApoB100)mRNA丰度的影响.结果 随着细胞培养液中胰岛素和瘦蛋白浓度的增加,肝细胞中ApoB100 mRNA的水平逐渐降低;而随着培养液中胰高血糖素浓度的升高.ApoB100 mRNA水平呈先升高后降低的趋势.结论 神经内分泌因子胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白通过影响ApoB100 mRNA的表达水平来调控肝细胞中VLDL的组装与转运.

    作者:刘殿峰;孙玉成;夏强;惠琦;刘国文;陈健;文力正;王哲;张嘉保 刊期: 2008年第11期

  • 人源抗菌肽LL-37/hCAP-18真核表达载体的构建及其在人乳腺癌细胞MCF-7中的表达

    目的 构建人源抗菌肽LL-37/hCAP-18的真核表达载体,并在人乳腺癌细胞MCF-7中进行表达.方法 以重组质粒pcDNA4.0-LL-37为模板,采用PCR法扩增LL-37/hCAP-18基因,连入pEGFP-c1质粒,构建真核表达载体pEGFP-c1-LL-37,瞬时转染人乳腺癌细胞MCF-7,采用激光共聚焦显微镜观察重组质粒的转染效率,RT-PCR法检测目的 基因的表达.结果 所构建的抗菌肽LL-37/hCAP-18真核表达载体经双酶切和测序证明构建正确,在瞬时转染MCF-7细胞48 h后,目的 基因转染效率较高,约为40%,RT-PCR结果显示,重组质粒转染的细胞可扩增出339 bp的目的 基凼条带.结论 已成功构建了人源抗菌肽LL-37/hCAP-18的真核表达载体,并在人乳腺癌细胞中获得表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定了基础.

    作者:韩艳非;袁红艳;廖翔宇;刘超;常雅萍 刊期: 2008年第11期

  • 腺病毒载体介导gag基因在小鼠体内的生物分布

    目的 研究腺病毒载体介导gag基因在C57BL/6小鼠体内的生物分布.方法 经C57BL/6小鼠左后肢股四头肌部位单次注射0.05 ml Ad-gag,于给药后不同时间摘取组织脏器,采用Taqman探针实时荧光定量PCR法,以小鼠β-actin基因作为内参,外标绝对定量法分别定量样本中gag和β-actin基因拷贝数.计算每104个小鼠细胞中gag基因的拷贝数,比较各脏器的分布数量.结果 外标绝对定量法精密性良好.gag基因主要分布在注射位点、淋巴结、脾脏和肝脏,其他脏器没有分布.给药后3 d,gag基因在靶器官分布达峰值,注射位点分布多,伴随时间延长逐渐减少.结论 Ad-gag疫苗在体内不会蓄积并产生全身的特别是生殖系统毒性.本研究可作为重要的安全性试验数据,支持药物在临床应用.

    作者:王欣;苗玉发;周晓冰;沈连忠;李波 刊期: 2008年第11期

  • EGFP-PDGFRβ融合基因表达载体的构建及其转染COS-7细胞条件的优化

    目的 构建EGFP-PDGFRβ融合基因表达载体,并优化PEI介导基因转染COS-7细胞的条件.方法 PCR扩增EGFP和PDGFRβ基因,依次连接至pcDNA3.1(+)质粒中,构建融合基因表达载体H-E-P-pcDNA3.1(+),经PEI介导转染COS-7细胞,并对转染条件进行优化.结果 融合基因表达载体经酶切及测序证明构建正确.经PEI介导转染COS-7细胞的佳条件为:DNA浓度2 μg/ml,N/P比值15.5,在无血清条件下转染.此条件适用于滚瓶培养细胞的转染.结论 已成功构建了EGFP-PDGFRβ融合基因表达载体,并优化了经PEI介导转染COS-7细胞的条件.

    作者:任培君;易小萍;张元兴 刊期: 2008年第11期

  • FABP7基因真核表达载体的构建及其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

    目的 构建脑脂肪酸结合蛋白(BLBP/B-FABP,FABP7)基因的真核表达载体,并检测其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响.方法 采用逆转录方法从星型细胞瘤组织中扩增FABP7基因,双酶切后插人线性化的pcDNA3.1载体真核启动子下游,构建重组真核表达载体,转染人乳腺癌细胞MCF-7后,采用半定量RT-PCR检测FABP7基因mRNA的表达,MTY法检测细胞的增殖活性、流式细胞术检测细胞的周期变化情况,并对细胞进行计数.结果 FABP7基因重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确,转染MCF-7细胞后48、72和96 h,pcDNA3.1-FABP7组的细胞数和细胞的A490值均比pcDNA3.1空质粒组明显降低,G1期细胞百分含量均明显升高.结论 已成功构建了FABP7基因的真核表达载体,该载体可抑制人乳腺癌细胞MCF-7的增殖.

    作者:王毅君;车团结;张萍;闫琨;李琳;王勤;陈卫 刊期: 2008年第11期

  • LKB1(Thr336)磷酸化多克隆抗体的制备及其应用

    目的 制备LKB1(Thr336)磷酸化多克隆抗体.并以其检测细胞中LKB1的表达.方法 用生物信息学方法选取LKB1 Thr336位点附近10个氨基酸,且使Thr336位点磷酸化,并铰链到BSA上.以此为抗原免疫家兔,制备抗血清,纯化后通过ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性,并用LKB1抗体和p-LKB1(Thr336)抗体分别检测正常细胞及肿瘤细胞中LKB1的表达.结果 纯化后的p-LKB1(Thr336)抗体效价为1:1 000;LKB1抗体不仅识别His-LKB1蛋白,而且识别p-LKB1(Thr336)抗原,而p-LKB1(Thr336)抗体仅识别p-LKB1(Thr336)抗原;在正常细胞HL7702和HEK293中,LKB1表达较多,而在HeLa细胞中,LKB1基本没有表达;在这3种细胞中.p-LKB1(Thr336)基本没有表达;在肿瘤细胞S180、COS-7和Caco2中,LKB1和p-LKB1(Thr336)均有表达,p-LKB1表达相对较多.结论 已制备了特异性的p-LKB1(Thr336)多克隆抗体,LKB1-Thr336位点的磷酸化可能是某些肿瘤发生的特征,有望成为肿瘤诊断的指标之一.

    作者:任艳敏;黄蓓;魏浩;赖柳静 刊期: 2008年第11期

  • 聚合酶链式反应变性及退火温度与产物假阴性之间的关系

    目的 探讨聚合酶链式反应(PCR)变性及退火温度与产物假阴性之间的关系.方法 以含有HBV完整基因组的重组质粒pUC-19为模板进行PCR扩增,人为改变PCR循环的变性或退火温度,探讨其与产物假阴性之间的关系.结果 随着变性温度的降低和退火温度的升高,PCR扩增效率降低,产物量明显减少.当变性温度降低至85℃及85℃以下,退火温度升高至72℃时,琼脂糖凝胶电泳肉眼观察不到扩增产物.结论 过低的变性温度和过高的退火温度会导致PCR产物出现假阴性.

    作者:冉姝;周国燕;王景宇;李红卫;华泽钊 刊期: 2008年第11期

  • Lipocalin-2基因表达产物对人胚肾细胞增殖的影响

    目的 构建Lipocalin-2(Lcn-2)基凶真核表达质粒PL-2,并榆测其及前期原核表达的重组Lcn-2蛋白对人胚肾细胞HEK293增殖的影响.方法 利用RT-PCR从鼠巨噬细胞RAW264.7中扩增tcn-2基因,克隆人真核表达质粒pEGFP-C1中,构建蓖组质粒PL-2.转染HEK293细胞,通过荧光观察和RT-PCR鉴定Lcn-2基凶的表达.将重组质粒PL-2和前期原核表达的重组Lcn-2蛋白作用于HEK293细胞,通过MTT法检测细胞增殖情况,Western blot法检测细胞增殖核抗原(PCNA)的表达.结果 重组真核表达质粒PL-2经酶切和测序鉴定,证明构建正确.经荧光观察和RT-PCR鉴定,转染重组质粒PL-2的HEK293细胞中有Lcn-2基因的表达.加入重组Lcn-2蛋白后,HEK293细胞较对照组明显增殖,细胞中PCNA的表达也较对照组明显升高,而重组质粒PL-2对HEK293细胞增殖以及细胞中PCNA的表达均无影响.结论 已成功构建了Lcn-2基凶真核表达质粒,其对HEK293细胞的增殖无影响,而原核表达的重组Lcn-2蛋门对HEK293细胞的增殖有一定的促进作用,推测Lcn-2基因的表达产物可能通过与细胞膜受体结合促进HEK293细胞的增殖.

    作者:帖儒修;朱道银;李娜;王爽 刊期: 2008年第11期

  • 轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMBl7上的适应性

    目的 探讨轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上的适应性.方法 轮状病毒P[2]G3株在猴肾细胞MA104上经蚀斑筛选纯化后,得到的克隆以不同MOI接种至人二倍体细胞KMB17上.用微量滴定法与蚀斑法平行检测病毒滴度,用免疫荧光法检测病毒的增殖情况,后进行病毒基因组稳定性检测.结果 经MA104细胞培养的轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上可产生明显的细胞病变(CPE),但病变出现的时间随病毒传代次数的增加而延迟,抗原性也逐渐减弱.通过蚀斑筛选纯化得到的克隆病毒,可在KMB17细胞上稳定地增殖.以0.05 MOI病毒量接种可产生稳定的CPE,时间为72~96 h.连续传代至第10代,病毒滴度达105.5PFU/ml,病毒基因组稳定.结论 轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上表现出毒力及增殖能力的衰退;经蚀斑筛选纯化可获得毒力较强的病毒株,并在KMB17细胞中稳定复制、增殖.

    作者:张光明;刘馨;张永欣;徐婧雯;洪超;孙茂盛 刊期: 2008年第11期

  • 利用响应面分析法优化鸟苷发酵培养基

    目的 利用响应面分析法对鸟苷发酵培养基进行优化,提高鸟苷产量.方法 采用响应面分析法对鸟苷发酵培养基的3种主要成分葡萄糖、酵母粉和豆饼水解液进行优化.用Design-Expert软件对实验数据进行多元回归分析,并建立3种因素与鸟苷产量之间的函数关系.用终优化的配方进行3次验证试验.结果 通过岭脊分析,获得培养基中3因素佳浓度为:葡萄糖12.0%,酵母粉1.4%,豆饼水解液4.0%,发酵液鸟苷高产量可达28.3 g/L.3次验证试验所测得的鸟苷产量分别为28.14、28.32和27.86 g/L,平均值为28.10 g/L,与预测结果基本一致.结论 利用响应面分析法可优化鸟苷发酵培养基,显著提高鸟苷的产量.

    作者:盛翠;张一平;陆茂林 刊期: 2008年第11期

  • 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株的耐药性分析

    目的 分析临床分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的分布情况及耐药性.方法 收集吉林大学中日联谊医院临床标本中分离的221株大肠埃希菌和152株肺炎克雷伯菌,采用纸片扩散法检测抗菌素的敏感性;双纸片协同试验和纸片表型确证试验筛选并确证产超广谱β-内酰胺酶的菌株;按照美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)2005年版的标准判断结果.结果 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的敏感性高,均达100%;对头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦和头孢西丁的敏感性也较高,均大于70%,而对氨苄西林的耐药性均大于90%.共检出产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌118株,检出率为53.4%;肺炎克雷伯菌21株,检出率为13.8%;产超广谱β-内酰胺酶的两种菌株与非产超广谱β-内酰胺酶的同种菌株相比,对抗菌素的耐药性均明显增加.结论 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌仍是产超广谱的β-内酰胺酶的主要菌株,且对常用抗菌素产生了较高的耐药性.

    作者:谢风;王晶莹;崔红花;徐雪松 刊期: 2008年第11期

  • 突变型干扰素-τ的表达、纯化及其抗乙型肝炎病毒作用

    目的 在毕赤酵母中表达突变型干扰素-τ(TFN-τ),并检测其生物学活性及抗乙型肝炎病毒作用.方法 将绵羊IFN-τ序列中6个氨基酸突变为人IFN-α相应的氨基酸,将合成的基因克隆至pPICZa质粒.构建突变型IFN-τ表达质粒pPICZα-IFN-τ,转化巴斯德毕赤酵母中进行高密度发酵.发酵上清液经超滤浓缩、离子交换层析和分子筛层析纯化后,检测其生物学活性及抗乙型肝炎病毒作用,并与市售IFN-α2a进行比较.结果 发酵上清液中突变型IFN-τ的表达量为400~500 mg/L,占上清总蛋白的40%以上;纯化收率达31.4%,纯度约为95%;比活为2.1×107 IU/mg;对乙型肝炎病毒的抑制作用与IFN-α2a相当,但细胞毒性显著低于后者.结论 已在毕赤酵母中高效表达了突变型IFN-τ,表达的蛋白具有较高的生物学活性,对乙型肝炎病毒有良好的抑制作用,且细胞毒性较低.

    作者:张晴妮;徐骥;芮康宁;罗鹏;杨子义 刊期: 2008年第11期

  • 尾加压素Ⅱ对体外高糖培养大鼠肾小球系膜细胞周期的影响

    目的 观察尾加压素Ⅱ(UⅡ)对体外高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞周期的影响.方法 体外高糖培养大鼠肾小球系膜细胞,加入不同浓度的UⅡ(107、10-8、10-9和10-10mol/L),37℃孵育24 h,用碘化丙啶染色流式细胞术分析肾小球系膜细胞周期分布.结果 UⅡ对体外高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞有明显的促增殖作用,表现为细胞周期S期比例增加,以浓度为10-8mol/L时明显.Ca2+阻断剂尼卡地平、Ca2+合剂EDTA及抗UⅡ抗体能明显抑制其促增殖作用.结论 UⅡ能提高体外高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞S期DNA合成速率,提示UⅡ对其具有明显的促增殖作用.

    作者:赵岩;李才;林风武;田琳 刊期: 2008年第11期

  • 人β防御素-3的研究进展

    人防御素是一类人体内源性抗微生物阳离子短肽,富含精氨酸,以其广谱高效的抗菌活性和独特的作用机制,成为人体天然免疫体系的重要组成部分.在人防御素家族中,人β防御素-3(HBD-3)具有较强的抗菌活性和更广的抗菌谱,对盐浓度相对不敏感,对宿主细胞毒性低,这些特点使其成为当前研究的热点.本文就其结构特征、生物学功能及其在抗感染方面的应用前景等方面的研究进展作一概述.

    作者:王远亮;赵长虹 刊期: 2008年第11期

  • 穿膜肽HIV-TAT与呼吸道合胞病毒G蛋白片段G1及CTL表位融合蛋白的表达及纯化

    目的 在大肠杆菌中表达含穿膜肽HIV-TAT与呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白片段G1及CTL表位的融合蛋白,并进行纯化.方法 以质粒pET-G1F/M2为模板,扩增含TAT、RSV G蛋白片段G1和CTL表位F/M2的融合基因片段,与原核表达质粒pET-His连接,构建融合表达质粒pET-TAT-G1F/M2,转化E coli BL21(DE3)plysS进行诱导表达,采用Ni2+螯合亲和层析法纯化经尿素变性的包涵体,梯度透析复性纯化的目的 蛋白,并进行Western blot鉴定.结果 在E coli中可高效表达重组蛋白TAT-G1F/M2,表达量占菌体总蛋白的30%以上,目的 蛋白主要存在于包涵体中.经变性、纯化、复性可获得高纯度(>95%)特异性的TAT-G1F/M2蛋白.结论 已在大肠杆菌中成功表达了融合蛋白TAT-G1F/M2,为进一步进行RSV体内体外免疫学研究奠定了基础.

    作者:张竞;龚伟;梅兴国;阎浩林 刊期: 2008年第11期

  • 两种CpG寡核苷酸对乙型肝炎疫苗免疫小鼠淋巴细胞增殖的影响

    目的 观察人工合成的两种CpG寡核苷酸(CpG ODN)对乙型肝炎疫苗免疫小鼠淋巴细胞增殖效应的影响.方法 BALB/c小鼠分别经乙肝疫苗、乙肝疫苗+CPG1826和乙肝疫苗+CpG2006免疫后,取小鼠脾和胸腺淋巴细胞,进行非特异性和特异性淋巴细胞增殖试验,应用MTT法分别检测淋巴细胞增殖效应.结果 CpG两组与疫苗组及对照组相比,脾淋巴细胞增殖效应均显著增强,CPG1826组均优于CpG2006组,且差异有统计学意义;CpG两组的胸腺淋巴细胞非特异性增殖效应也显著增强,但CpG两组之间差异无统计学意义.结论 CPG1826和CpG2006均能明显刺激BALB/c小鼠脾脏及胸腺淋巴细胞增殖,且CPG1826显示出更强的脾淋巴细胞免疫刺激效应.

    作者:韩堃;郑源强;韩新荣;石艳春 刊期: 2008年第11期

  • 布鲁菌鉴别诊断方法的研究进展

    布鲁菌是严重危害人畜健康的病原菌之一,其鉴别诊断方法受到国内外的普遍关注.本文从布鲁菌感染与具有共同抗原的菌属细菌感染的鉴别以及人工免疫与自然感染的鉴别两方面作一综述.

    作者:张付贤;王英超;王兴龙 刊期: 2008年第11期

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    作者:张加利;蔡芳;高强;宋莉莉;于丹;桑建利 刊期: 2008年第11期

中国生物制品学杂志

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主管:中华人民共和国卫生部

主办:中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司