王振宇；佟雷；季丽莉；赵久红；唐源远
目的:目前国际上应用广泛的神经功能评估标准是2000年美国脊髓损伤学会制定的ASIA标准.通过实践作者发现ASIA标准主要偏重于神经学检查的评估,对于植物神经功能如大小便功能、出汗及皮肤营养等功能性的情况不能很好的评估.作者也曾经制定了ASIA标准的功能观察补充表,虽然此表能够较好的反映出脊髓损伤患者嗅鞘细胞移植术后植物神经功能的变化,但是必须要和ASIA标准同时使用,互为补充,使用较为繁琐.观察北京西山脊髓功能量表的使用效果.方法:选择2007-07/11来源于全国各地的陈旧性脊髓损伤患者21例,男17例,女4例,年龄8～54岁,损伤时间0.5～18年.受伤原因:创伤性脊髓损伤17例,手术创伤1例,生物源性损伤即脊髓炎3例.损伤节段:颈段8例,胸腰段13例.脊髓损伤程度:14例为完全性脊髓损伤,7例为不完全性脊髓损伤.13例曾行脊髓减压手术治疗.21例均接受过不同种类的神经营养因子等治疗.患者自愿接受细胞移植治疗并签自愿接受协议书.4～6个月中期引产胚胎由家属自愿捐献,并经过医院伦理委员会批准.取胚胎嗅球,经细胞分离、培养、纯化7～14 d,后消化成单细胞混悬液,然后在手术显微镜下移植到患者损伤脊髓区域的上下方.术后1～2个月,采用北京西山医院脊髓损伤功能量表进行术前和术后评定对比,该量表共9大项16小项,采用4分制,正常3分,差为0分,总分0～48分,0～16分为重度残障,17～32分为中度残障,33～47分为轻度残障,48分正常,能全面地体现患者的功能变化,不仅包括运动感觉的变化,还包括了膀胱、直肠、肌张力、皮肤营养状况、泌汗、性功能、疼痛、生存和生活质量的评价.结果:21例患者均进入结果分析.嗅鞘细胞移植术后1～2个月,21例患者的脊髓功能评分都有明显提高(术前:21.33±10.29,术后:25.19±11.16,P < 0.01)结论:西山医院脊髓功能量表能较全面的反映出术后脊髓患者功能的变化,使用较简便.
作者：刘超；郑遵成；高瑞；张林；张坤；张磊；魏树刚；张立清；匡乃峰；宋延军 刊期： 2008年第16期
目的:目前对于是否存在外周血来源间充质干细胞备受争议.实验拟进一步探讨在皮肤损伤与非损伤条件下,外周血来源间充质干细胞的分离培养及其成骨、成脂多向分化特性.方法:实验于1996-08/1997-11在解放军第四军医大学组织工程研发中心完成.①动物:清洁级SD大鼠24只,随机数字表法分为正常组、创面组,12只/组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:创面组大鼠麻醉后,背部切去3 cm×3 cm全层皮肤,建立创伤模型.术后5 d,两组大鼠腹主动脉抽血, 8 mL/只,加入含体积分数为0.1胎牛血清的α-MEM培养基,密度梯度法分离培养外周血来源间充质干细胞.取大鼠双侧股骨、胫骨,全骨髓法分离培养骨髓来源间充质干细胞作为对照.③实验评估:培养至第12天,计数原代培养每1×105个外周血单个核细胞所形成的间充质干细胞克隆数.取第3代外周血间充质干细胞,行CD45、CD34、I型胶原免疫组织化学鉴定细胞表型;按1×104密度接种于12孔板,细胞贴壁后分别换用成骨、成脂诱导液培养,以茜素红、油红染色检测其分化特性.结果:①细胞形态观察:原代培养的外周血来源间充质干细胞呈成纤维样.②克隆形成:外周血来源间充质干细胞形成的克隆数仅为骨髓来源间充质干细胞的1/6～1/8,创面组外周血间充质干细胞形成的克隆数是正常组3～4倍.③细胞表型鉴定:外周血来源间充干细胞CD45、CD34呈阴性,I型胶原呈阳性.④成骨及成脂诱导:外周血间充质干细胞成骨诱导后21 d出现钙沉积,茜素红染色呈阳性;成脂诱导后14 d有少量脂滴出现,油红染色为阳性.结论:①皮肤损伤状态下外周血间充质干细胞克隆数量是正常条件的3～4倍,但仍远低于骨髓来源间充质干细胞的克隆能力.②体外分离培养的外周血间充质干细胞具备成骨、成脂分化特性.
作者：徐军军；胡刚；邹运动；刘鹏；李裕强；金岩 刊期： 2008年第16期
目前人们对肝干细胞的分化潜能及特性已形成共识,但体外分离培养肝干细胞的方法还不成熟,肝干细胞体外分离培养方法的建立是在体外条件下对肝干细胞的生物学特性进行深入研究的前提和基础.肝细胞生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素、转化生长因子等细胞生长因子对肝干细胞的体外培养、生长和分化可能具有重要的调控作用.肝干细胞在一定条件下可以转化为肝癌细胞,肝干细胞在肝癌的发生中起着非常重要的作用.肝干细胞移植研究为肝细胞移植、生物型人工肝、肝癌靶向基因治疗提供细胞来源.
作者：陈强 刊期： 2008年第16期
背景:造血干细胞移植使恶性血液病的预后得到很大的改观,外周血造血干细胞移植逐渐取代了骨髓移植而成为造血干细胞移植的主要方式.目的:观察自体或异基因外周血造血干细胞移植对53例恶性血液病患者的治疗效果.设计:随机对照观察.单位:郑州大学第一附属医院血液科骨髓移植中心.对象:选择2003-07/2006-05在郑州大学第一附属医院血液科收治的53例恶性血液病患者,男33例,女20例,平均37岁.35例患者行异基因外周血造血干细胞移植,其中急性髓细胞性白血病13例、急性淋巴细胞白血病7例、慢性粒细胞白血病10例、多发性骨髓瘤2例、骨髓增生异常综合征3例.18例患者行自体外周血造血干细胞移植,其中急性髓细胞性白血病7例、急性淋巴细胞白血病6例、多发性骨髓瘤2例、非霍奇金病3例.33名供者与受者HLA配型完全相合,2名1个位点不合,男20例,女13例,平均35岁.性别不相合者16例.实验经过医院伦理委员会批准许可,所有受试对象均对检测项目知情同意.方法:①利用粒系集落刺激因子或化疗联合粒系集落刺激因子动员外周血干细胞,自体移植患者接受CD34+细胞中位数为3.0×106/kg,异基因移植患者接受CD34+细胞中位数为6.2×106/kg;自体移植采用MAC预处理方案,异基因移植采用改良的Bu/Cy预处理方案;移植物抗宿主病的预防采用甲氨喋呤、环孢菌素A联合骁悉,1例1位点不合患者加用抗淋巴细胞球蛋白.②观察患者移植后中性粒细胞＞ 0.5× 109 L-1和血小板＞20×109 L-1恢复时间.③观察患者移植物抗宿主病发生情况.④术后1年随访所有患者复发情况.主要观察指标:①中性粒细胞和血小板恢复时间.②移植后移植物抗宿主病发生情况.③随访结果.结果:纳入患者53例均进入结果分析.①自体移植患者移植后中性粒细胞＞ 0.5×109 L-1、血小板＞ 20×109 L-1的恢复时间分别为13和19 d,在异基因移植患者中分别为12和15 d.②异基因移植患者中Ⅰ～Ⅲ度急性移植物抗宿主病的发生率为31.4%,慢性移植物抗宿主病的发生率为71.4%.③术后患者自体移植和异基因移植患者复发率分别为38.9%和5.7%.结论:自体或异基因外周血造血干细胞移植较快建立恶性血液病患者造血能力,是治疗恶性血液病的重要手段.
作者：谢新生；万鼎铭；孙慧；孙玲；刘林湘；姜中兴 刊期： 2008年第16期
目的:应用原始生殖细胞进行全能干细胞的研究具有与胚胎干细胞同样广阔的前景,尤其适合于难以从囊胚内细胞团中分离培养胚胎干细胞的动物.但胚胎生殖细胞体外培养条件一直是制约这方面发展的瓶颈.实验设计了体外有效扩增小鼠原始生殖细胞的方法,拟搭建稳定高效的原始生殖细胞培养平台.方法:实验于2006-10/2007-08在重庆医科大学组织胚胎学教研室重庆市生物化学分子药理学重点实验室完成.①实验材料:清洁级昆明孕鼠由重庆医科大学动物实验中心提供,见阴栓计为0.5 d胚龄,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:取胚龄8.5 d胎鼠尾端尿囊及周围组织, 取胚龄9.5～10.5 d胎鼠后肠及周围组织,取胚龄11.5 d,12.5 d胎鼠生殖嵴及周围组织,分别经0.25%胰酶-0.02%EDTA消化并接种于0.1%明胶包被的培养皿中.比较不同妊娠时间点取材对原代、F1代胚胎生殖细胞克隆形成的影响.采用SSEA-1免疫组织化学法计数细胞阳性率,计数胚胎生殖细胞克隆联合MTT法比较胚龄11.5 d,12.5 d两个时间点原始生殖细胞的增殖能力.比较上述两种取材培养方法对胚龄11.5 d,12.5 d原始生殖细胞扩增的影响.采用碱性磷酸酶染色、免疫组化检测SSEA-1、免疫荧光检测Nanog,体外分化实验鉴定分化能力.结果:①胚龄11.5 d,12.5 d胎鼠原代和F1代集落形成率较胚龄8.5～10.5 d高,扩增效率显著提高(P < 0.01).②免疫组织化学法检测分离的胚龄11.5 d,12.5 d原始生殖细胞 SSEA-1阳性率差异不显著 (P > 0.05).原代第3天克隆计数显示,胚龄11.5 d胎鼠高于12.5胚龄胎鼠 (P < 0.01),MTT数据显示11.5胚龄组稍高于12.5胚龄组.③两种方法对胚龄11.5 d,12.5 d胎鼠胚胎生殖细胞集落形成无显著性差异(P > 0.05),但生长方式有所不同.④克隆胚胎生殖细胞呈典型的胚胎干细胞样集落生长,能稳定传代;碱性磷酸酶、SSEA-1、Nanog表达强阳性;体外能分化为囊状类胚体.结论:胚龄11.5 d和12.5 d胎鼠,尤其是胚龄11.5 d胎鼠扩增原始生殖细胞效率较高,在这两个时间点运用与周围组织共培养法和生殖嵴分离培养法均适宜.
作者：王璐；刘永刚；李芳菲；姜蓉；王亚平 刊期： 2008年第16期
背景:川芎嗪抑制血管内皮生长因子的表达,但对其诱导HL-60白血病细胞增殖是否有抑制效应尚需进一步实验.目的:观察川芎嗪对血管内皮生长因子诱导的白血病细胞HL-60细胞增殖的影响.设计:重复测量观察.单位:武汉科技大学医学院.材料:实验于2007-03/06在武汉科技大学医学院分子生物学实验中心完成.人白血病细胞系HL-60细胞购于上海细胞生物研究所.盐酸川芎嗪注射液为无锡市第七制药有限公司产品, 批号为011014,硫酸鱼精蛋白注射液购自上海第一生化药业公司,批号为010302, 免疫组化试剂盒购自博士德公司.方法:①取对数生长期人白血病细胞系HL-60细胞,加入100 μg/L 血管内皮生长因子,分别加入终浓度为1.5,15,150 mg/L川芎嗪实验培养基,以未加川芎嗪注射液的细胞为空白对照组,只含20 mg/L鱼精蛋白的细胞为阳性对照组,同时设立血管内皮生长因子对照组,细胞培养48 h后,采用MTT法检测HL-60细胞的生长抑制率.②川芎嗪影响HL-60细胞血管内皮生长因子蛋白表达实验:用终浓度为1.5,15及150 mg/L川芎嗪处理HL-60细胞,24 h后采用免疫组织化学法计算血管内皮生长因子蛋白阳性细胞表达率.主要观察指标:① HL-60细胞生长抑制率.②血管内皮生长因子蛋白表达情况.结果:① HL-60细胞生长抑制率:川芎嗪15, 150 mg/L作用血管内皮生长因子诱导的HL-60细胞吸光度值均低于血管内皮生长因子对照组,差异有显著性意义(P < 0.05).②血管内皮生长因子蛋白表达情况:川芎嗪作用HL-60细胞24 h后,血管内皮生长因子蛋白随川芎嗪给药浓度升高表达逐渐下调,呈一定依赖性,各川芎嗪浓度干预HL-60细胞血管内皮生长因子蛋白表达阳性细胞表达率与对照组比较差异均有显著性意义(P < 0.01).结论:川芎嗪可抑制血管内皮生长因子诱导HL-60细胞的增殖, 并下调血管内皮生长因子蛋白的表达.
作者：范可；李中明 刊期： 2008年第16期
目的:寻找白血病细胞和正常细胞之间生物特性的差异,进而利用这种差异进行靶向治疗,在大限度地杀伤白血病细胞的同时保护正常细胞是近年来白血病药物治疗一直在探索的领域.测定白血病细胞K562、HL-60细胞低密度脂蛋白胆固醇受体和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CoA)活性,并与正常细胞系HK-2比较,分析其活性变化,并寻找抑制K562、HL-60细胞增殖的有效方法.方法:实验于2006-07/2007-05在青岛大学医学院附属医院中心实验室及血液免疫研究室完成.实验过程中应用的K562(慢粒急变的的白血病)、HL-60(原髓细胞白血病)细胞株为中国医学科学院血液病研究所惠赠.参照孟凡青方法并加以改进,采用低浓度阿托伐他汀抑制细胞内源性胆固醇合成途径,提供外源性低密度脂蛋白胆固醇供细胞生长,应用MTT比色法检测细胞分裂生长抑制率,进而判断低密度脂蛋白受体活性.应用紫外分光光度法测定细胞3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶活性;采用MTT法观察HMG-CoA抑制剂阿托伐他汀对 K562、HL-60和HK-2细胞增殖作用的影响:将对数期生长的细胞按每孔100 μL接种于96孔培养板中,阿托伐他汀用RPMI1640分别配成10,20,40,80,160 μmol/L加入培养体系,每孔100 μL,以不加药物而加含10%胎牛血清的RPMI1640 100 μL及上述细胞100 μL的培养体系为对照.结果:与正常细胞HK-2比较,白血病细胞K562、HL-60低密度脂蛋白胆固醇受体活性增高、HMG-CoA 还原酶活性增高 (P < 0.05);阿托伐他汀以时间和剂量依赖性的方式抑制K562、HL-60细胞增殖,即随着阿托伐他汀处理浓度的加大、作用时间的延长,细胞存活率逐渐下降.阿托伐他对HK-2细胞增殖抑制作用与时间及剂量无关.结论:白血病细胞系K562、HL-60细胞低密度脂蛋白胆固醇受体和HMG-CoA 还原酶活性较正常细胞HK-2增高;阿托伐他汀具有抑制K562、HL-60细胞增殖的作用.
作者：于洁；赵春亭；孙慧丽；杨颉；陈兵；孟冬梅 刊期： 2008年第16期
目的:脂肪干细胞来源于成脂细胞,取材容易,已经成为干细胞研究一个新的方向.观察脂肪干细胞移植脑冻伤大鼠的脑组织局部组织学变化以及神经行为学变化.方法:实验于2006-01/2007-08在中南大学湘雅医院神经病学实验室完成.①实验材料:SD大鼠,雌雄不限,体质量300 g左右,由中南大学湘雅医学院动物学部提供.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:体外培养并传代SD大鼠脂肪干细胞,并用BrdU标记.制作大鼠的脑冷冻伤模型,实验组在冷冻伤动物脑内移植脂肪干细胞,对照组在冷冻伤动物脑内移植培养基,假手术组仅行颅骨开窗,每组15只.③实验评估:分别在移植细胞后1,3,5,7,14,30 d对实验动物进行NSS神经行为学评分,并制作脑组织切片,行免疫荧光染色检测BrdU阳性细胞.采用Tunel染色检测凋亡细胞,脑组织RT-PCR检测血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子等因子mRNA表达.结果:①与对照组相比,实验组大鼠在3～14 d NSS神经行为学评分降低(P < 0.05).②免疫荧光检测显示,Brdu标记的脂肪干细胞在大鼠脑组织内存活并且迁移.③Tunel法检测显示,3 d后实验组凋亡细胞数目明显少于其他组.④RT-PCR检测显示,与其他两组比较,移植脂肪干细胞的大鼠脑组织中血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子表达更高.结论:脂肪干细胞可以在中枢神经系统中存活,并分化为神经元样细胞,它可以引起血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子等因子的高表达从而减少细胞凋亡,加速神经功能修复过程并达到保护脑组织的目的.
作者：周向阳；邓永文；方芳；王飞；陈若琨；宋涛；方加胜 刊期： 2008年第16期
目的:细胞外基质蛋白是整合素重要的配体,通过信号转导系统可影响细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖和分化.细胞外基质蛋白是否参与小胶质细胞的活化过程,是否参与小胶质细胞调控表达整合素而进一步参与一些疾病的进展,目前尚不清楚.实验拟观察纤维结合蛋白、玻璃体结合蛋白和层黏连蛋白3种细胞外基质蛋白对大鼠小胶质细胞整合素表达的影响.方法:实验于2006-05/2007-08在华中科技大学同济医学院临床神经研究中心完成.①实验材料:新生Wistar大鼠由同济医学院实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:体外分离培养和纯化大鼠小胶质细胞,应用纤维结合蛋白、玻璃体结合蛋白和层黏连蛋白包被培养板,以未加任何细胞外基质成分的为对照.③实验评估:采用流式细胞术检测3种细胞外基质蛋白对小胶质细胞MHCⅠ类分子的表达和整合素表达的影响.结果:①相对于对照组,添加纤维结合蛋白和玻璃体结合蛋白的培养基使小胶质细胞MHCⅠ类分子表达明显增加(P < 0.001),添加层黏连蛋白的培养基使小胶质细胞MHCⅠ类分子表达明显下降(P < 0.05).②相对于对照组,添加纤维结合蛋白的培养基可以上调小胶质细胞α4亚基的表达、α5亚基和Mac-1整合素(即αMβ2)表达(P均 < 0.005),添加玻璃体结合蛋白的培养基同样可上调α4亚基表达、α5亚基和Mac-1表达(P < 0.05,P < 0.005).层黏连蛋白对α4亚基,α5亚基和Mac-1整合素表达无影响,但可以上调小胶质细胞表达αⅤ亚基(P < 0.005),纤维结合蛋白和玻璃体结合蛋白对αⅤ亚基表达无影响.纤维结合蛋白、层黏连蛋白和玻璃体结合蛋白可小胶质细胞LFA-1(即αLβ2)表达增加(P < 0.001,P < 0.005),α6亚基表达下调(P < 0.005).结论:细胞外基质成分纤维结合蛋白和玻璃体结合蛋白可促进小胶质细胞的活化,使小胶质细胞α4β1和α5β1和Mac-1的表达增加.层黏连蛋白不能促进小胶质细胞的活化.
作者：薛峥；张苏明 刊期： 2008年第16期
目的:目前对于体外诱导分化的多巴胺能神经元的生物学功能、体内存活状况,以及与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠的疗效比较方面尚缺乏深入的研究.观察神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠的作用,并与胚胎中脑多巴胺能神经元组织移植治疗帕金森病大鼠的疗效进行比较.方法:实验于2006-06/2007-09在中山大学附属第一医院完成.①实验材料:健康成年雄性SD大鼠及孕14～15 d的SD大鼠由中山大学动物实验中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:在含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中培养胚胎大鼠中脑神经干细胞.经传代扩增后,在含白细胞介素1a、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中向多巴胺能神经元分化,并进行免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测.参考Sauer和Lee等方法制备帕金森病大鼠模型,并将造模成功大鼠随机分组,每组9只:分化细胞组向每一坐标点注入1×1011 L-1神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元;胚胎中脑组注入 1×1011 L -1胚胎中脑多巴胺能神经元;手术对照组注入DMEM/F12细胞培养液.③实验评估:移植术后10、20、40、60 d诱发大鼠不对称旋转行为以观察治疗效果,并对移植区进行酪氨酸羟化酶免疫组织化学检测以了解移植细胞体内存活的情况.结果:①大鼠神经干细胞球在诱导分化液中呈贴壁生长,球内细胞从球体中央逐渐向四周分化扩展出形态各异的细胞.免疫细胞化学染色显示,分化细胞中含有酪氨酸羟化酶染色阳性细胞.流式细胞仪检测诱导分化6 d的细胞中酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比率为(16.7±2.8)%.②移植后20 d分化细胞组大鼠的不对称旋转行为开始明显下降(P < 0.05).移植后40 d和60 d,分化细胞组大鼠的旋转圈数与胚胎中脑组比较差异不显著(P > 0.05).③分化细胞组和胚胎中脑组大鼠纹状体移植区有酪氨酸羟化酶染色阳性细胞,多数细胞位于移植针道边缘.结论:神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠具有相同的疗效.
作者：柯春龙；陈白莉；金华伟；郭少雷 刊期： 2008年第16期
目的:研究发现,应用骨髓间充质干细胞联合周围神经移植治疗脊髓损伤有协同作用.实验拟验证自体骨髓间质干细胞联合周围神经移植治疗脊髓损伤的临床疗效,为脊髓损伤的治疗开辟新途径.方法:选择2003/2004河南省人民医院神经外科干细胞移植治疗中心收治的78例完全性脊髓损伤患者.男52例,女26例,年龄18～52岁.其中颈髓损伤12例,胸髓损伤46例,腰骶髓损伤20例,损伤1周至60个月.患者对治疗知情同意,并要求采用该方法治疗.无菌条件下,自患者髂前上棘及髂后上棘通过骨髓穿刺抽取骨髓,分离、纯化、培养骨髓间充质干细胞.选取患者自体腓肠神经作为周围神经移植供体,将自身腓肠神经应用显微外科方法去除外膜、束膜,并剪神经,使神经组织的质地、外观类似于马尾组织,将其排列呈多条状、纵行植入已切开的脊髓处或原囊肿腔内,然后用分离纯化的骨髓间充质干细胞移植焊接移植的神经,对患者行自体骨髓间充质干细胞联合周围神经移植治疗,术后给予神经生长因子等药物应用, 疗程为1个月,以促进损伤神经的修复.实验评估:通过电话随访和患者定时回医院复查的方式,术后每3个月随访1次,随访1年.术前、术后和随访按国际截瘫医学会评分标准ASIA评分标准评分,评分的增高表示患者的运动和感觉的功能的恢复.同时进行神经电生理、影像学等方面对比分析.结果:78例患者中除1例严重复合伤患者出现并发症,经积极治疗无效死亡,其余患者术后均顺利出院,原有症状改善情况,未出现明显不良毒副反应.患者术后ASIA评分的平均数较术前提高.37例出现运动、感觉、影像学、神经电生理方面的不同改善,25例出现不同程度的运动,感觉、神经电生理方面的改善,9例出现神经电生理方面的改善,6例无变化,1例死亡;在随后的1年随访中,除2例失访外,其余患者均有不同程度进一步恢复的趋势,无明显毒副反应发生.结论:自体骨髓间质干细胞联合周围神经移植治疗脊髓损伤促进脊髓损伤患者的功能恢复,安全有效,有临床推广应用的价值.
作者：李志营；步星耀；张圣旭；梁庆华；李太平；陈书连；李六一；赵耀武；翟亚平；张永福 刊期： 2008年第16期
目的:脂肪间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的干细胞,在特定培养条件下可分化为骨、软骨、脂肪、神经、心肌、内皮细胞等.实验拟采用高密度、多种生长因子体外诱导兔脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化.方法:实验于2007-01/12在解放军兰州军区总医院实验中心完成.①实验材料:7 d龄乳兔6只,雌雄不限,体质量150～200 g,由兰州生物制品研究所动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:分离乳兔脂肪间充质干细胞,体外扩增至第3代,高密度诱导组按Zuk等高密度微团培养法调整细胞密度为1×1010 L-1高密度培养,加入 10 μg/L转化生长因子β1、50 μg/L胰岛素样生长因子、100 μmol/L地塞米松、50 mg/L维生素C诱导成软骨;低密度诱导组按5×108 L-1低密度培养,并加入与高密度诱导组相同的诱导剂诱导培养;高密度常规培养组按1×1010 L-1高密度加入常规培养基培养;对照组按5×108 L-1的密度接加入常规培养基培养.③实验评估:诱导7、14、21 d后观察细胞形态学变化,应用MTT法检测细胞生长曲线,RT-PCR、免疫细胞化学法检测Ⅱ型胶原表达,阿尔新蓝染色检测糖氨多糖的合成.结果:①兔脂肪间充质干细胞经诱导后生长速度减慢,由长梭形细胞变为短梭多角细胞,呈铺路石状.常规培养的脂肪间充质干细胞潜伏期为一二天,3 d为对数增殖期,第5天以后进入生长平台期.诱导的脂肪间充质干细胞潜伏期为1～3 d,4 d为对数增殖期,第6天进入平台期.②RT-PCR、免疫细胞化学法检测显示,高密度诱导组诱导14、21 dⅡ型胶原阳性表达, 阿尔新蓝染色见胞浆和细胞基质有棕黄色颗粒.低密度诱导组组诱导14、21 dⅡ型胶原弱阳性表达,阿尔新蓝染色仅少量细胞基质着色.高密度常规培养组和对照组Ⅱ型胶原与阿尔新蓝染色均为阴性.结论:高密度培养的脂肪间充质干细胞经多种生长因子诱导可以向软骨细胞分化.
作者：王海燕；耿排力；吕同德；哈小琴；张晓岩 刊期： 2008年第16期
背景:诱导因子及软骨微环境是影响骨髓基质干细胞成软骨分化及软骨形成的主要因素.目的:利用少量软骨细胞以共培养方式诱导骨髓基质干细胞体内成软骨.设计、时间及地点:2004-09/2005-03在解放军第四军医大学口腔医院病理教研室完成的随机对照动物实验.材料:选择清洁级新西兰兔15只用于细胞支架复合物的种植,随机分为混合细胞组、软骨细胞组、骨髓基质干细胞组,5只/组.取新生1～3 d龄新西兰兔5只用于骨髓基质干细胞、软骨细胞的分离培养.聚羟基乙酸无纺网支架为上海易括公司产品,材料直径15 μm,平均间距150～200 μm,孔隙率97%,厚2 mm.方法:混合细胞组将骨髓基质干细胞与软骨细胞按3:1混匀,调整细胞密度为6.0×1010 L-1,接种于经培养液预湿的塑形聚羟基乙酸 5 mm×5 mm的支架上,然后在复合物周围滴加含胎牛血清的DMEM液培养1周.软骨细胞组、骨髓基质干细胞组的细胞密度调整为6.0×1010 L-1后同法接种于支架上.各组兔麻醉后于背部一侧皮下组织植入对应的细胞-支架复合物.主要观察指标:植入后第8周行新生软骨大体观察和苏木精-伊红、Masson三色染色.结果:各组细胞与聚羟基乙酸支架黏附情况良好.植入8周后,混和培养组和软骨细胞组均形成了成熟的软骨样组织,并基本保持复合物初始的大小和形状,两组新生软骨外观及组织学特征较接近.骨髓基质干细胞组在体内培养过程中未形成软骨组织,而是形成了纤维结缔组织.结论:骨髓基质干细胞与软骨细胞按3:1混合形成的微环境,能有效诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化,并促进骨髓基质干细胞的体内成软骨.
作者：倪云峰；李小飞；刘源；雷战军；卢强 刊期： 2008年第16期
目的:经冠状动脉途径行自体骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死已有较多改善心功能的肯定结论.实验拟验证骨髓间充质干细胞自体移植心肌梗死犬的细胞因子分泌情况,及其对血管新生和心肌细胞凋亡的作用.方法:实验于2005-12/2007-05在安徽医科大学第一附属医院动物实验室和中心实验室完成.选择健康杂种犬36只,无菌抽取犬骨髓液10 mL,经Percoll液密度梯度离心后贴壁法体外培养骨髓间充质干细胞,传2代后行5-氮胞苷诱导,5-溴脱氧尿苷标记备用.结扎冠状动脉途左前降支建立急性心肌梗死模型,术后随机分为细胞移植组、模型对照组,12只/组.细胞移植组分别在梗死区边缘4个不同部位点局部注射植入骨髓间充质干细胞悬液2 mL,模型对照组在相同对应部位注射等量DMEM培养基.术后取心肌梗死组织进行指标检测.结果:①经流式细胞仪检测,传至第3代后的骨髓间充质干细胞CD34和CD11b阳性率小于5%,CD44和CD105阳性率高达90%以上.②原位末端标记结果示,细胞移植组心肌细胞凋亡指数显著低于模型对照组(P < 0.01).③免疫组织化学检测显示,移植后2周细胞移植组梗死区微血管密度明显高于模型对照组(P < 0.05);随移植时间的延长,细胞移植组梗死区新生微血管密度逐渐增加,趋势检验差异有显著性意义(F=439.588,P < 0.01).移植后1,2,4周与模型对照组比较,细胞移植组心肌梗死区血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的表达均显著升高(P均 < 0.01).结论:自体骨髓间充质干细胞移植心肌梗死犬后,能分泌血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子,诱导血管新生,同时抑制心肌细胞凋亡.
作者：余其贵；王永；吴继雄 刊期： 2008年第16期
目的:赤芍总苷能诱导鼠HepA和S180细胞凋亡,但赤芍总苷能否抑制K562细胞增殖及其诱导K562细胞凋亡的机制尚不明确.观察赤芍总苷诱导人红白血病细胞株K562细胞凋亡及线粒体膜电位与Ca2+水平的变化,以探讨凋亡机制.方法:实验于2007-03-02/2007-10-20在北京中医药大学细胞生化实验室,国家重点实验完成.①实验材料:赤芍总苷由西安奥晶科技发展有限公司提供,批号:060417,纯度>95%.人红白血病K562细胞株购自上海中科院细胞库.②实验方法:取对数生长期的K562细胞,培养24 h后加入50 mg/L赤芍总苷进行干预,光镜下观察细胞形态.MTT显色法检测25,50,75,100,150,200,400 mg/L赤芍总苷对K562细胞增殖的抑制作用,以仅加入无血清培养基培养的为对照.③实验评估:采用Annexin V/PI双标记法检测凋亡效应,罗丹明123(Rh123)染色流式检测线粒体膜电位和荧光染料Fluo-3AM流式检测K562细胞内游离Ca2+浓度.结果:①50 mg/L 赤芍总苷作用K562细胞24 h后,出现核固缩、核碎裂和凋亡小体等形态学改变.②与对照组相比,不同质量浓度赤芍总苷能明显抑制K562细胞的增殖(P < 0.01),并具有量效关系,呈时间和剂量依赖性.③细胞线粒体经Rh123染色呈现明亮绿,不同质量浓度赤芍总苷干预组荧光强度均较对照组明显减弱,膜电位水平较高.④赤芍总苷可引起细胞线粒体膜电位下降.不同质量浓度赤芍总苷组细胞内游离Ca2+浓度均升高, 线粒体膜电位下降,与对照组比较差异显著(P < 0.01).结论:赤芍总苷诱导K562细胞凋亡的可能机制是通过减低细胞内线粒体膜电位及提高游离Ca2+水平,从而导致细胞凋亡.
作者：许惠玉；陈志伟；牛建昭；邹宇；孙勇伟；彭波 刊期： 2008年第16期
目的:梭华-Sofast是新一代阳离子聚合物转染试剂,具有高效率转染所必备特征,如浓缩DNA,将DNA运送到细胞内,并使其在细胞核内释放等,且细胞毒性很低,很稳定,不被血清清除等特点.观察梭华-Sofast介导绿色荧光蛋白转染骨髓间充质干细胞的转染效果及细胞毒性.方法:实验于2006-03-01/12-31在福建医科大学神经生物学研究中心完成.①实验材料:实验动物选用清洁级健康雄性SD大鼠10只,二三月龄,体质量150～250 g,由福建医科大学实验动物中心提供.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:SD大鼠10只,用密度梯度离心及贴壁法相结合的方法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,分别以Sofast、阳离子聚合物Jet PEI、Superfect和阳离子脂质体Lipofectamine 2000为转染试剂,转染绿色荧光蛋白入骨髓间充质干细胞,倒置荧光显微镜下检测转染细胞的绿色荧光蛋白基因表达,并通过MTT法检测转染细胞毒性.结果:梭华-Sofast、阳离子聚合物Jet PEI、Superfect和阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导的绿色荧光蛋白能有效转染入骨髓间充质干细胞,转染效率分别为(85.62±8.76 )%、(73.34±7.32)%、(75.61±7.79)%和(76.62±8.21)%,梭华-Sofast转染率高(P < 0.05);转染细胞的存活分数分别为(92.18±9.27)%、(86.98±8.54)%,(87.84±8.59)%和(87.17±8.61)%,梭华-Sofast细胞毒性低(P < 0.05).结论:梭华-Sofast介导绿色荧光蛋白转染骨髓间充质干细胞具有高转染效率和低细胞毒性的优点.
作者：吴碧莲；陈少强；贾小力 刊期： 2008年第16期
背景:目前神经干细胞的定向分化是神经干细胞研究的热点.脑源性神经生长因子作为诱导剂可否诱导神经干细胞分化为神经元.目的:观察在表皮生长因子培养条件下,不同质量浓度脑源性神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化的影响.设计:对比实验.单位:中国医科大学人体解剖学教研室.材料:实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成.提取成年SD大鼠海马神经干细胞,无血清技术培养.清洁级成年SD大鼠3只,体质量200～250 g,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.实验过程中应用的表皮生长因子、脑源性神经生长因子均由R&D公司提供.方法:①无菌条件下分离大鼠海马组织,用含碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养神经干细胞.②取第4代神经干细胞,利用有限稀释法进行单细胞克隆培养.将单细胞克隆传代后的克隆球细胞进行神经干细胞的鉴定.克隆球细胞行巢蛋白免疫细胞化学染色,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色.③单细胞克隆的神经干细胞脑源性神经生长因子诱导分化实验,根据脑源性神经生长因子质量浓度不同分成0 μg/L浓度的对照组和50、100、150、200μg/L浓度的4个实验组,各组的培养液中均加入表皮生长因子,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色,检测神经干细胞向神经元分化情况.主要观察指标:神经干细胞分化为神经元的比例.结果:①神经干细胞免疫细胞化学染色结果显示,单细胞克隆培养后克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达.②50,100μg/L组脑源性神经生长因子组神经干细胞分化为神经元比例明显高于对照组、150,200 μg/L脑源性神经生长因子组组(t=2.502～5.025,P < 0.05);50,100 μg/L脑源性神经生长因子组之间神经干细胞分化为神经元的比例差异不显著 (P > 0.05);对照组、150,200 μg/L组3组间神经干细胞分化为神经元比例差异不显著(P > 0.05)结论:在20 μg/L 表皮生长因子培养条件下,脑源性神经生长因子促使神经干细胞向神经元分化的较佳质量浓度为50 μg/L.
作者：王振宇；佟雷；季丽莉；赵久红；唐源远 刊期： 2008年第16期
背景:骨髓基质细胞能透过血脑屏障在脑中存活并迁移至脑梗死区,而在脑梗死区转化生长因子β1的增加将有助于减轻神经元的损害.目的:观察静脉移植骨髓基质细胞对大鼠脑缺血再灌注损伤神经元转化生长因子β1的影响.设计、时间及地点:随机对照设计,于2005-09/2006-03在中国医科大学实验动物中心完成.材料:清洁级成年Wistar大鼠36只,随机分为模型对照组、盐水组、细胞移植组,12只/组.另取2月龄Wistar大鼠2只用于制备骨髓基质细胞.方法:贴壁法+胰蛋白酶消化分离培养骨髓基质细胞,传至3～5代用于实验,移植前24 h向培养基中加入BrdU进行体外标记.采用改良线栓法建立左侧大脑中动脉梗死大鼠模型,造模后24 h,细胞移植组于尾静脉输入浓度为3×109 L-1骨髓基质细胞悬液1 mL,盐水组尾静脉注射1 mL生理盐水,模型对照组不给予任何处理.主要观察指标:免疫组化染色检测BrdU阳性细胞及转化生长因子β1的表达,原位TUNEL法检测神经细胞凋亡情况.结果:造模后3 d,细胞移植组脑梗死灶周围可见大量BrdU阳性细胞,盐水组及模型对照组未见BrdU阳性细胞;细胞移植组转化生长因子β1的表达明显高于盐水组及模型对照组(P < 0.01);细胞移植组纹状体梗死区神经细胞凋亡数明显低于盐水组及模型对照组(P < 0.01).结论:经静脉移植的骨髓基质细胞可选择性进入脑缺血区,增强脑损伤区转化生长因子β1的表达,从而减少神经细胞的凋亡.
作者：陈敬；赵彬 刊期： 2008年第16期
目的:关节软骨创伤难以自行修复,传统疗法因修复的组织以纤维软骨为主,缺少正常透明软骨的力学性能及耐用性.种子细胞是组织工程化软骨形成的首要条件,为此拟建立一套较为简便、有效和实用的脐血间充质干细胞体外分离培养体系,探讨其向软骨细胞分化的可行性.方法:实验于2005-07/2006-09在右江民族医学院组织学与胚胎学教研室完成.①细胞来源:无妊娠并发症足月分娩后的胎盘脐静脉血,均征得供者同意,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:穿刺抽取15 mL脐带血,密度梯度法分离吸取分层界面的白色环形絮状物,其中富含单个核细胞,离心后沉积细胞用含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM高糖培养基悬浮,调整细胞密度为1×109 L-1接种于25 T培养瓶内,放置在37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养,72 h后更换培养基,去除红细胞及其他未贴壁细胞,至70%～80%融合时传代.③实验评估:取传至第2代的脐带血间充质干细胞进行增殖能力检测;加入含终浓度为100 μg/L胰岛素样生长因子1,15%胎牛血清的DMEM软骨细胞诱导培养基,倒置显微镜下连续观察细胞生长情况,并行苏木精-伊红染色,应用扫描电子显微镜对诱导后细胞进行鉴定.结果:①细胞形态学观察:来源于脐血的单个核细胞接种24 h少量贴壁,近似圆形或短梭形;体外培养3 d后可见分散的间充质干细胞小集落,集落细胞为长梭形,呈放射状生长;2周后细胞集落彼此融合,呈旋涡状或菊花状生长.传代后3周细胞基本融合成层.②细胞增殖能力检测:脐带血间充质干细胞传代后8～12 h贴壁,7～13 d细胞处于对数生长期,16～19 d进入平台期,扩增速度快于原代培养,倍增时间为8.5 d.③脐带血间充质干细胞向软骨细胞诱导分化结果:胰岛素样生长因子1诱导12 d,脐带血间充质干细胞苏木精-伊红染色可见分泌少量细胞外基质.扫描电子显微镜下呈现软骨细胞特点,多边形,外围被分泌细胞外基质所围绕,呈蜘蛛网样.结论:从人脐带血中成功分离获取间充质干细胞,在体外经胰岛素样生长因子1条件培养液诱导短期内可获得软骨细胞.
作者：解继胜；黄海玲；唐毓金；陈维平；罗小琼 刊期： 2008年第16期
目的:糖尿病及大血管病变是自身免疫反应介导的炎症反应, 近年研究表明,糖尿病的各种并发症与血糖的波动性有密切关系.文章拟进一步对比观察波动性高血糖和稳定高血糖对树突状细胞分化成熟及免疫功能的影响.方法:实验于2006-12/2007-09在佛山市第一人民医院中心实验室完成.人外周血样品取自中山大学肿瘤防治中心健康医务工作者, 年龄27～35岁, 共12份,所有抽血者对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准.①实验方法:从健康人新鲜血分离外周血单个核细胞,并将其在含重组人粒巨噬细胞集落刺激因子和重组人白细胞介素的完全培养基中培养为不成熟树突状细胞.将不成熟树突状细胞分别在含有正常血糖(5.5 mmol/L葡萄糖),稳定性高血糖(20 mmol/L葡萄糖),波动性高血糖(5.5 mmol/L和20 mmol/L葡萄糖交替作用)的完全培养基中培养48h.②实验评估:采用流式细胞术检测树突状细胞表型.以混合淋巴细胞反应强度观察树突状细胞对淋巴细胞增殖的影响.采用ELISA法检测细胞培养上清细胞因子白细胞介素12浓度.结果:①与正常血糖组比, 稳定性高血糖组和波动性高血糖组树突状细胞表面协同刺激分子CD86表达、特征性表面标志CD1a、成熟度标志CD83以及HLA-DR表达明显增高(P < 0.01).波动性高血糖组对树突状细胞的作用明显高于稳定性高血糖组(P < 0.05).②与正常血糖组相比,稳定性高血糖组和波动性高血糖组可激发强烈的异种T淋巴细胞的增殖反应( P < 0.01),随着细胞数的增多,促增殖作用增强;波动性高血糖组激发混合淋巴细胞反应的强度明显大于稳定性高血糖组(P < 0.05).③20 mmol/L葡萄糖或5.5 mmol/L葡萄糖和20 mmol/L葡萄糖交替培养干预后的树突状细胞分泌细胞因子白细胞介素12明显高于正常血糖组(P < 0.05).结论:波动性高血糖和稳定性高血糖均可促进和增强树突状细胞的成熟分化和免疫功能,波动性高血糖的效果更加明显.
作者：梁明；栾晓军；陈小雨；梁敏 刊期： 2008年第16期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
