学术投稿

PCR介导嗜肺军团菌疫苗候选基因lvgA和Hsp60的融合及其在大肠杆菌中表达的初步研究

刘明杰;陈建平;王涛;廖涛;陈宪;芦殿香;田玉

关键词:嗜肺军团菌, lvgA基因, Hsp60基因, 重组聚合酶链反应, 基因表达
摘要:目的采用PCR法进行嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的拼接融合,克隆并检测该融合基因在原核系统中表达情况,为进一步研究其免疫性能作必要的准备.方法采用重组聚合酶链反应,设计引物首先分别从嗜肺军团菌基因组DNA中扩得待融合端互补的军团菌毒力基因(lvgA)和热休克蛋白60基因(Hsp60),经琼脂糖电泳纯化回收,再以适量lvgA和Hsp60为模板变性、退火、重叠延伸,实现二基因的PCR水平融合,随后采用外引物进行新一轮扩增,扩得足量lvgA/Hsp60融合基因的PCR产物,继而将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒,转化宿主菌BL21,经PCR、酶切及测序鉴定后,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析等鉴定.结果扩增出了约2292bp的lvgA/Hsp60融合基因,构建了原核表达重组质粒pGlvgA/Hsp60,并检测到Mr约117000的GST-lvgA-Hsp60融合蛋白表达条带.结论采用PCR法实现了嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的融合,构建了其原核表达重组质粒,并使该融合蛋白在原核系统中得到了有效的表达,为进一步研究该融合基因的免疫学特性奠定了基础.
南方医科大学学报杂志相关文献
  • 经尿道等离子体切除术治疗前列腺增生症的临床观察

    目的探讨前列腺增生症经尿道等离子体切除术的临床效果及安全性.方法采用经尿道等离子体前列腺切除术治疗BPH68例.结果前列腺质量30~75g,手术时间45~110min,无前列腺电切综合征发生,术后留置尿管4~6d,术后住院时间6~8d,术后3个月大尿流率由术前平均9.2ml/s升至19.6ml/s.前列腺症状评分由术前平均30.8分降至8.2分(P<0.05).结论经尿道等离子体前列腺切除术效果好,并发症少,手术安全,易于推广.

    作者:李学;陈新;廖国强;罗建军;王志远 刊期: 2006年第07期

  • 实时荧光定量PCR检测外周血TREC的方法研究

    目的建立及优化检测移植后患者外周血TREC拷贝数的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)的方法及实验影响条件,为临床研究造血干细胞移植的免疫功能重建机制提供方法学基础.方法在ABI7000PCR仪上实时扩增检测构建的TREC质粒标准品,摸索佳扩增条件及建立标准曲线,然后用优化的FQ-PCR方法检测临床样本.结果T3、T4引物和R3、R4引物的扩增效率分别优于T1、T2引物和R1、R2引物.TaqMan-MGB探针比普通的TaqMan探针扩增效率高.金牌热启动Taq酶,比较普通Taq酶而言,提高了PCR的特异性和敏感性.FQ-PCR的反应条件设定:95℃10min后95℃5s,53℃30s,40循环结束.结论通过摸索与优化实验条件,建立了实时荧光定量PCR检测外周血单个核细胞中TREC的方法.

    作者:阴继霞;武大林;许文娟;孙竞 刊期: 2006年第07期

  • 白藜芦醇抑制HepG2细胞生长和对细胞间隙连接通讯的影响

    目的研究白藜芦醇对人肝癌细胞HepG2的生长抑制作用以及对细胞间隙连接通讯(GJIC)的影响.方法利用MTT法观察白藜芦醇对HepG2细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期的时相分布,使用荧光探针5'-CFDA/AM标记细胞,采用荧光漂白后重恢复技术(FRAP)和共聚焦显微镜技术观察白藜芦醇对HepG2细胞间隙连接通讯的影响.结果不同浓度的白藜芦醇处理细胞不同时间后,HepG2细胞的生长增殖明显受到抑制,抑制率高达92.1%,各处理组间比较均有显著性差异(F=18.532,P<0.05);细胞周期分析显示,白藜芦醇能诱导HepG2细胞在S期停滞,抑制细胞DNA的合成并可诱导细胞凋亡;另外,白藜芦醇有恢复HepG2细胞间隙连接通讯的功能,且随浓度增加而增加.结论白藜芦醇可抑制HepG2细胞增殖,使细胞停滞于S期,并能诱导细胞凋亡;白藜芦醇还有恢复HepG2细胞间隙连接通讯功能的作用,提示此作用可能是白藜芦醇抑制HepG2细胞增殖和抗肿瘤作用的机制之一.

    作者:晏芳;田雪梅;马晓冬 刊期: 2006年第07期

  • 同种异体骨在治疗骨肿瘤中的应用

    目的评价同种异体骨填充良性骨肿瘤切除后形成腔隙性骨缺损的效果,以探讨同种异体骨修复骨缺损的机制、临床应用价值.方法回顾分析我科应用异体骨治疗135例良性骨肿瘤患者手术后骨缺损病例.结果在随诊的104例患者中,除1例因感染手术失败,7例肿瘤复发外,其余96例骨肿瘤患者的骨缺损均得到良好治愈,平均愈合时间9.7个月.未发现由于植入异体骨而引起传染病发生.结论同其他骨缺损填充方法和自体髂骨相比,此种方法可操作性强,安全性较高.在骨愈合率,骨愈合时间以及感染、复发等并发症的发生上同自体骨植骨手术无明显差异.

    作者:李冀;王志强;张育敏;宋会平;原林 刊期: 2006年第07期

  • 医学图像数据网格的实现

    根据现有医学影像归档及通信系统(PACS)应用需求,分析探讨了建立医学图像数据网格的必要性.并提出了医学图像数据网格的软件基本框架,深入研究了医学图像数据网格中用户验证、元数据目录和存储代理三个关键组件的实现方法.

    作者:张海;郭文明 刊期: 2006年第07期

  • 致死性高浓度氧对新生鼠发育和肺损伤的影响

    目的探讨致死浓度氧(95%)与新生鼠肺发育及损伤的关系,建立支气管肺发育不良动物模型.方法将3dSD新生鼠随机分为高氧(95%)和空气氧组,并和成年鼠对照,观察记录体质量、身长;HE染色观察肺组织形态结构,做辐射状肺泡计数(RAC).结果(1)高氧新生鼠和成年鼠死亡率分别为12.5%、35.2%,与正常空气氧组比较,新生鼠体质量(18.02±0.68vs13.24±0.59)和身长(8.83±0.25vs6.76±0.51)增长明显减少(P<0.05).(2)高氧新生鼠RAC值为9.50±1.05,较正常同日龄新生鼠(13.00±1.79)明显减少(P<0.05),高氧成年鼠RAC值(12.67±2.25)比高氧新生鼠为高(P<0.05),跟正常空气组新生鼠差异不明显(P>0.05).(3)10d新生鼠肺结构已接近成年鼠肺,高氧组新生大鼠可见肺泡壁较薄、结构简单化、数目明显减少,肺泡大小不均,有些肺泡融合、体积增加,部分间隔细胞增多,小血管扩张、充血;成年鼠高氧组肺间质水肿、肺间隔增厚、肺泡腔缩小,肺间隔伊红显色强度增强,肺泡腔内出现红细胞、巨噬细胞及脱落的肺上皮细胞.结论新生大鼠暴露于92%~95%氧7d可致生长障碍和肺泡化阻滞,出现类似早产儿支气管肺发育不良的肺组织形态特征.

    作者:朱翠平;杜江;李秋平;封志纯 刊期: 2006年第07期

  • 胶片剂量分析系统及其在放疗验证中的应用

    目的利用计算机软件编程和医学图象处理技术,采用高分辨率数字扫描仪,将模拟定位图象和放疗验证图象数字化后进行分析和处理,并在此基础上建立相应的剂量分布图,与三维治疗计划系统所形成的剂量分布曲线进行对比分析,从而有效完成放疗定位验证和剂量验证功能.方法在WINDOWS2000平台下,采用面向对象编程技术,编程语言为VISUALC++.NET,整体系统以模块化设计为主,分段开发调试完成后进行整合,从而有效节约开发时间同时保证了系统的稳定性和可移植性.结果本系统融合有数据获取、自动分析、计算以及图像处理功能,能同时从剂量图像和剂量曲线两方面验证放疗定位和剂量的精度.结论实验证明本系统具有较好的准确性和稳定性,能在有效节约成本的条件下同时实现放疗定位和剂量的验证.

    作者:王顺官;洪文松;蔡长青 刊期: 2006年第07期

  • 肾上腺髓质素原N端20肽对血管紧张素刺激心肌成纤维细胞生成NO的影响

    目的探讨肾上腺髓质素原N端20肽(PAMP)对血管紧张素Ⅱ刺激心肌成纤维细胞(CFs)生成NO的影响及意义.方法采用胰酶消化、差速贴壁法培养新生SD大鼠CFs,以硝酸还原法测定细胞培养液中NO的浓度,分别观察不同浓度AngⅡ、PAMP、及AngⅡ+PAMP对CFs生成NO的影响.结果(1)10-9、10-8、10-7、10-6μmol/LAngⅡ组细胞培养液中的浓度是:(73.88±2.23)、(64.34±3.02)、(54.12±2.82)、(40.21±1.45)μmol/L,各组之间有显著性差异(P<0.01).(2)10-9、10-8、10-7、10-6μmol/LPAMP组细胞培养液中NO的浓度分别为(74.40±3.42)、(74.91±2.66)、(75.77±3.31)、(74.23±2.43)μmol/L,而空白组为(74.57±2.49)μmol/L.各组之间无显著性差异(P>0.05).(3)10-7μmol/LAngⅡ+(10-9、10-8、10-7、10-6μmol/L)PAMP组培养液中NO合成浓度分别为(66.15±2.95)、(80.58±3.77)、(88.67±1.46)、(96.22±2.96)μmol/L,各组间有显著性差异(P<0.01).结论随AngⅡ浓度增加可显著抑制CFs分泌NO,而PAMP对CFS合成NO无明显影响,但PAMP与AngⅡ共同培养时,随PMAP浓度增加,NO的合成呈依从性增多.

    作者:薛世荣;李志樑;徐春生;严全能;江海龙;吴宏超;唐朝枢 刊期: 2006年第07期

  • 玻璃体切除硅油填充术后并发白内障的手术治疗

    目的探讨玻璃体切除硅油填充术后并发白内障的手术方法及治疗效果.方法回顾性分析32例33眼玻璃体切除硅油填充术后并发性白内障病例的临床资料,晶体囊外摘除+一体式人工晶体植入术8眼,联合取出硅油3眼;单纯晶体囊外摘除术+硅油取出3眼;超声乳化白内障摘除+折叠人工晶体植入术18眼,联合取出硅油1眼;单纯超声乳化白内障摘除术4眼,比较两种方法术后视力、手术并发症情况.结果囊外摘除术¨眼中,8眼视力有提高,占72.73%;超声乳化术22眼中,16眼视力提高,占72.73%.囊外摘除术6眼硅油溢出,高达45.55%,超声乳化术仅2眼后囊破口.结论两种手术方法术后的视力较术前均有显著提高;晶体超声乳化具有更安全、稳定的优点,是目前首选的手术方式;熟练、轻巧的手术操作也是手术成功的关键.

    作者:周斌兵;臧晶;张少冲;林文雄;韩钟琳 刊期: 2006年第07期

  • 原发性气管肿瘤的外科治疗(附27例报告)

    目的总结原发性气管肿瘤外科手术治疗的临床经验.方法回顾性分析我科1978~2005年27例,颈段8例,胸上段4例,胸下段15例原发性气管肿瘤的外科治疗临床资料.结果颈领式切口7例,颈纵隔切口12例,右后外径路8例.长度:气管切除大长度、平均长度,颈领式切口为4.4、3.3cm;颈纵隔切口为5.1、3.9cm;右后外径路为5.4、4.1cm.良性肿瘤3例,恶性肿瘤24例.其中腺样囊性癌和鳞癌是常见的类型.5年生存率为66.7%(12/18).结论手术切除是治疗气管肿瘤有效的方法.气管节段切除气管重建是治疗气管恶性肿瘤的主要术式.

    作者:蔡瑞君;王武军;李梅 刊期: 2006年第07期

  • 磷酸化细胞外信号调节激酶和P21ras在高血压血管平滑肌细胞中表达增强

    目的探讨高血压血管平滑肌细胞增生和ERK激活的机制.方法采用免疫组织化学和Westernblotting技术,对比观察肾血管性高血压和自发性高血压大鼠肾细小动脉平滑肌细胞中磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和P21ras表达.结果实验期间,Wistar肾血管性高血压组动脉血压从(104±18)mmHg升高到实验结束时的(198±33)mmHg,自发性高血压大鼠16周龄时的血压为(163±23)mmHg.肾血管性高血压组肾小球发生了明显的纤维化(P<0.05),自发性高血压大鼠肾小球纤维化等与对照组无显著性差异.肾血管性高血压组入球动脉、小叶间动脉、叶间动脉和弓形动脉血管平滑肌细胞中磷酸化ERK1/2染色阳性率分别为7.09%、14.57%、29.44%和13.63%,均明显高于对照组(P<0.01).自发性高血压大鼠入球动脉、小叶间动脉、叶间动脉和弓形动脉血管平滑肌细胞中磷酸化ERK1/2染色阳性率分别为16.09%、24.17%、32.44%和18.61%,均明显高于对照组(P<0.01);肾血管性高血压组和16周龄自发性高血压大鼠入球动脉、小叶间动脉和弓形动脉平滑肌细胞中P21ras的阳性率明显高于对照组(P<0.01);Westembloting检测可见高血压组和16周龄自发性高血压大鼠肾组织磷酸化ERK1/2和P1ras蛋白含量明显高于对照组(P<0.01).结论在大鼠两肾一夹型高血压和自发性高血压时,P21ras基因表达增加使部分血管平滑肌细胞丝裂原激活蛋白激酶系统激活,导致部分小动脉血管平滑肌细胞增生.

    作者:景丽;张建忠;王一理;郭风英 刊期: 2006年第07期

  • 广州及周边地区蝙蝠携带SRAS冠状病毒的流行病学调查

    目的了解野生动物市场果蝠携带SARS冠状病毒(SARS-CoV)和SARS样冠状病毒(SARS-like-CoV)情况.方法2004年9月至2005年11月,在广州及广州野生动物市场收集来自广州及周边地区的分属两个亚目9个种的蝙蝠共905只,有犬蝠(Cynopterus sphinx)、棕果蝠(Rousettus leschenaulti)、普通长翼蝠(Miniopterus schreibersi)、普氏蹄蝠(Hipposideros prati)、中华菊头蝠(Rhinolophus sinicus)、小黄蝠(Scotophilus kuhlii)、大耳双色蹄蝠(Hipposideros Pomona)、中菊头蝠(Rhinolophus affinis)和小菊头蝠(Rhinolophus pusillus).收集的蝙蝠分别取得咽拭813份、血清524份、肺组织853份及直肠粪便853份标本共计3043份,用新型冠状病毒(N-蛋白)测定试剂盒(酶联免疫法)、SARS-CoVRNA检测试剂盒、荧光PCR及基因芯片检测并通过RT-PCR和细胞分离培养检测SARS-CoV和SARS-like-CoV.结果收集的9个种905只蝙蝠共3043份标本未检测、分离出SARS-CoV和SARS-like-CoV.结论调查的广州及周边地区的9种蝙蝠均未检测到SARS-CoV和SARS-like-CoV.

    作者:李志峰;胡勇;詹惠春;云雪霞;杜玉萍;柯雪梅;余德宪;李建栋;戴迎春;陈清;俞守义 刊期: 2006年第07期

  • 以抗体竞争结合抗原测定单抗亲和力常数的研究

    目的在Friguent方法基础上建立更加稳定可靠的基于抗原/抗体竞争结合原理的单抗亲和力常数(Kd)检测方法.方法以抗体对抗原进行竞争结合,通过双抗体夹心法检测在一定抗体浓度竞争下抗原的结合率计算Kd值.结果用改良方法在两次不同条件下检测抗IL-8单抗的Kd值分别为:2.61×10-12mol/L和2.39×10-12mol/L,而使用Friguent方法在两次不同条件检测抗IL-8单抗的Kd值分别为:5.57×10-10mol/L和1.41×10-10mol/L.结论相对于Friguent方法,本研究计算出的Kd值更能反映抗原/抗体结合的真实情况,而且在不同实验条件下检测结果重现性强.

    作者:郭杰标;郭锐;刘艳华 刊期: 2006年第07期

  • 图像分类数的自适应估计准则与优分割算法

    在图像分割算法中,将图像灰度分为多少类是首先需要决定的问题,它将直接影响分割的终结果.因此,必须合理地估计图像分类数,它在理论分析和应用上都是很重要的一步.本文提出了一种基于马尔可夫场的图像分类数的自适应估计准则.当该准则达到小时对应的类数就是图像正确分割所要求的分类数.准则中各参数由期望大法和大伪似然法来估计.试验表明,本文的算法能通过自适应的调整参数而正确地找到图像的分类数,并且在此分类数下能自动得到图像的大后验分割.

    作者:颜刚;陈武凡 刊期: 2006年第07期

  • 中国小型猪原位肝移植的实验研究

    目的总结中国小型猪非转流条件下原位肝移植的手术特点,探索建立成熟、稳定的移植模型.方法通过18例次非转流条件下中国小型版纳猪原位肝脏移植术,结合手术特点进行技术改进,观察围手术期血液动力学及重要代谢指标的变化,观察手术技术改进及术后处理对存活率的影响.结果所有手术无术中死亡,术后7d存活率88.9%.平均手术时间(179.6±14.3)min,平均无肝期(27.3±3.4)min.无肝期血液动力学及生化代谢波动明显.术后当天麻醉清醒,术后3~5h左右开始自行排出小便,术后第3天正常进食.结论无肝期手术时间的缩短及血液动力学的相对稳定是非转流条件下猪原位肝移植成功的关键.

    作者:潘明新;李爱辉;高毅;谢金敏;张翌;张新建;张鸿飞;郭跃虎;张会迎 刊期: 2006年第07期

  • 习惯性流产的病毒病因探讨

    目的用多种技术方法研究探讨柯萨奇B组病毒(CBV)与习惯性流产的病毒病因.方法采用ELISA、RT-PCR和病毒分离对86例习惯性流产和40例人工流产妇女进行了CBV-IgM抗体、病毒RNA和病毒粒子检测.结果检测结果表明习惯性流产和人工流产两组妇女柯萨奇B组病毒IgM阳性率分别为87.2%和35.0%,血淋巴细胞CBVRNA阳性率则为53.5%和17.5%;而胎盘组织中病毒RNA阳性率各为59.3%和17.5%,胎盘组织中病毒分离阳性率在两组妇女各为41.9%和6.9%.其各项指标经x2检验,两组均有显著性差异(P<0.01).结论柯萨奇B组病毒可能是习惯性流产的发生因素之一.

    作者:蒋文玲;刘钊;杨占秋;徐顺先;罗宪玲 刊期: 2006年第07期

  • 大鼠喉移植改进模型的研究

    目的探讨大鼠喉移植改进模型的可行性.方法近交系F344大白鼠80只,分为2组,对照组采用Strome喉移植模型,实验组保留咽升动脉,供体大鼠双侧颈总动脉分别与受体大鼠颈总动脉和颈前静脉行端端吻合,比较2组术后动静脉通畅率及移植喉存活率.结果对照组的动、静脉通畅率和移植喉存活率分别为30%、15%、30%,实验组为75%、65%、80%,两组比较差异有显著性(P<0.05).结论改进的大鼠喉移植模型提高了受体鼠和移植喉的存活率,能更好地进行喉移植抗免疫排斥研究.

    作者:李浩;彭汉伟;曾宗渊;郭朱明 刊期: 2006年第07期

  • 从噬菌体随机十二肽库中筛选乙酰胆碱酯酶的抑制肽

    目的从随机肽库中筛选乙酰胆碱酯酶(AChE)的抑制性多肽.方法以人AChE作为靶标,应用噬菌体随机12肽库进行筛选,经过3轮筛选,对阳性克隆进行测序并进行序列分析及抑酶活性测定.结果筛选得到6个能与人AChE较强结合的噬菌体克隆,其中有4个克隆可以抑制AChE的酶活性,其保守序列为W(S/P)HY.结论通过噬菌体肽库技术能够筛选到抑制人AChE活性的多肽,为进一步研究AChE的多肽抑制剂奠定了基础.

    作者:张兴梅;石玉生;王春霞 刊期: 2006年第07期

  • PCR介导嗜肺军团菌疫苗候选基因lvgA和Hsp60的融合及其在大肠杆菌中表达的初步研究

    目的采用PCR法进行嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的拼接融合,克隆并检测该融合基因在原核系统中表达情况,为进一步研究其免疫性能作必要的准备.方法采用重组聚合酶链反应,设计引物首先分别从嗜肺军团菌基因组DNA中扩得待融合端互补的军团菌毒力基因(lvgA)和热休克蛋白60基因(Hsp60),经琼脂糖电泳纯化回收,再以适量lvgA和Hsp60为模板变性、退火、重叠延伸,实现二基因的PCR水平融合,随后采用外引物进行新一轮扩增,扩得足量lvgA/Hsp60融合基因的PCR产物,继而将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒,转化宿主菌BL21,经PCR、酶切及测序鉴定后,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析等鉴定.结果扩增出了约2292bp的lvgA/Hsp60融合基因,构建了原核表达重组质粒pGlvgA/Hsp60,并检测到Mr约117000的GST-lvgA-Hsp60融合蛋白表达条带.结论采用PCR法实现了嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的融合,构建了其原核表达重组质粒,并使该融合蛋白在原核系统中得到了有效的表达,为进一步研究该融合基因的免疫学特性奠定了基础.

    作者:刘明杰;陈建平;王涛;廖涛;陈宪;芦殿香;田玉 刊期: 2006年第07期

  • 不同运动强度与骨骼肌细胞凋亡的时序性实验研究

    目的研究不同运动强度、运动持续时间与骨骼肌细胞凋亡时序性关系,探讨运动与骨骼肌细胞凋亡的关系.方法采用不同速度跑台训练,以力竭运动训练建立骨骼肌运动损伤动物模型,PI染色、流式细胞术检测骨骼肌细胞凋亡率.结果正常运动量组腓肠肌细胞凋亡率在运动第1、3、7、14天之间差异无显著性意义(P>0.05);中等运动量组和力竭运动组腓肠肌细胞凋亡率在运动第1、3、7、14天之间差异都有显著性意义(P<0.05).安静组与正常运动量组腓肠肌细胞凋亡率无显著性差异;正常运动量组骨骼肌细胞凋亡率变化不明显;中等运动量组、力竭运动组腓肠肌细胞凋亡率在运动训练前3d迅速升高,随后相对稳定;力竭运动组腓肠肌细胞凋亡率高.结论运动可引起细胞凋亡和加速机体对凋亡细胞清除两种结果,这两种结果之间调控失衡,可能是造成骨骼肌运动损伤原因之一,说明运动具有双向性.

    作者:蔡保塔;余斌;赵江萍;张幸 刊期: 2006年第07期

南方医科大学学报杂志

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