目的 乳酸乳球菌中表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)ORF2与猪繁殖及呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF5的嵌合抗原表位.方法 按乳酸乳球菌密码子使用偏好设计并合成PCV2ORF2及PRRSV ORF5的串联抗原表位基因,插入至乳酸菌表达质粒pNZ8148,构建重组表达质粒,转化乳酸乳球菌NZ9000中,经乳酸菌素(nisin)诱导表达嵌合蛋白,采用Ni-NTA亲和层析纯化,进行12％SDS-PAGE分析.结果 重组表达质粒经双酶切鉴定,构建正确.嵌合蛋白相对分子质量约25 000,在乳酸乳球菌中主要以可溶性形式表达,纯化后纯度达96％以上,浓度约1 mg/mL,产量可达60 mg/L细菌培养物.结论 PCV2ORF2与PRRSV ORF5的嵌合抗原表位在乳酸乳球菌中得到高效可溶性表达.
作者：沈克飞；杨柳；杨睿；周雪；张素辉；付利芝 刊期： 2019年第01期
目的 分析EB病毒(EB virus,EBV)抑制小肠上皮细胞增殖的机理,初步探讨EBV导致腹泻的病理机制.方法 应用EBV作用于小肠上皮细胞,作用后0、12、24、36和48 h,采用MTT法检测细胞的增殖情况,Western blot法检测细胞MAPK(磷酸化的ERK1/2、JNK、p38)通路的表达情况.结果 经EBV作用36及48 h的小肠上皮细胞存活率较24及12 h显著降低,并显著低于0h (P＜0.05);磷酸化ERK1/2的表达在36和48 h低,显著低于其他3个时间点(P＜0.05).结论 EBV可抑制小肠上皮细胞的增殖,且通过抑制ERK1/2磷酸化途径实现.本实验为进一步研究EBV导致腹泻的发病机理提供了参考.
作者：胡香珍；张艳飞 刊期： 2019年第01期
目的 探讨睡眠剥夺(sleep deprivation,SD)对小鼠肾组织中炎症因子IL-6和TNF-α表达的影响.方法 将C57雄性小鼠随机分为空白对照组及SD 24、48和72 h组,利用COBAS INTEGRA 800全自动生化分析仪检测小鼠血清中尿素氮(urea nitrogen,BUN),肌酐(creatinine,CREA)和尿酸(uric acid,URCA)的含量;黄嘌呤氧化酶法检测肾脏组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,硫代巴比妥酸法检测丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量;对动物进行组织学检查,ELISA法检测肾脏组织中IL-6和TNF-α含量.结果 与空白对照组比较,随SD时间延长,小鼠血清中BUN、CREA和URCA含量在SD24h后显著增高(P＜0.01),48和72 h持续增高(P＜0.01);小鼠肾脏组织中SOD活性随SD时间延长持续下降(P＜0.01),MDA含量持续增加(P＜0.01);HE染色可见肾小管上皮细胞空泡样变性、轻度水肿,肾小球和间质内可见炎症细胞浸润和红细胞,肾小囊腔闭塞;IL-6、TNF-α含量随SD时间延长持续增加(P＜0.01).结论 SD诱发肾组织氧化损伤,引起脂质过氧化,使得肾脏结构和功能受损,促进炎症因子IL-6和TNF-α的大量释放,激活炎症反应,加重对肾脏的损伤.
作者：刘刚；侯良绢 刊期： 2019年第01期
目的 抑制JNK通路后,分析LPS对皮肤成纤维细胞的作用.方法 用400 ng/mL JNK磷酸化激动剂Anisomycin和20 ng/ mL脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)同时作用于皮肤成纤维细胞,并设LPS单独作用组,MTT法检测作用0、24、48和72 h时的细胞生长率,Western blot法检测作用0、20、40、60 min时,细胞中ERK、JNK和P38的磷酸化情况.结果 Anisomycin和LPS同时作用皮肤成纤维细胞24 h开始,细胞生长率明显高于对应的LPS单独作用组(P＜0.05);磷酸化ERK、JNK、P38的表达未发生变化,而LPS单独作用细胞20和40 min,磷酸化JNK的表达逐渐降低(P＜0.05).结论 在LPS作用于皮肤成纤维细胞过程中,是通过JNK途径刺激皮肤成纤维细胞产生炎性反应,为进一步研究LPS作用于皮肤成纤维细胞的发病机制奠定了基础.
作者：王永祥；王春燕；赵鹏伟 刊期： 2019年第01期
目的 利用重组杆状病毒高效表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)Cap蛋白,并分析该蛋白的免疫特性.方法 将PCV2 Cap基因克隆至转移载体pFastBac Ⅰ,转化感受态E.coli DH10Bac细胞,获得重组杆粒rBacmid-Cap,转染Sf9细胞,SDS-PAGE和Western blot法检测重组杆状病毒,并于High Five(H5)细胞中进行高效表达.将小鼠随机分为PBS对照组、杆状病毒组、重组杆状病毒组及疫苗对照组,均经小鼠肌内注射,100 μL/只,分别于第0和14天进行免疫,于首免后第21、28、35及42天经小鼠眼眶静脉丛采血,分离血清,ELISA法进行检测.结果 PCR和测序分析结果表明,重组转移质粒和重组杆粒构建正确.重组PCV2 Cap蛋白的相对分子质量约28 000,可与抗His标签单克隆抗体及抗PCV2 Cap多克隆抗体发生特异性结合.重组杆状病毒按MOI=5及1感染H5细胞约72 h,PCV2 Cap蛋白表达量高,表达产量约150 μg/mL.首免后第21、28、35及42天,重组杆状病毒组小鼠血清抗体水平明显高于PBS对照组及杆状病毒组(P＜0.001);首免后第21、28、35天,重组杆状病毒组小鼠血清抗体水平明显高于疫苗对照组(P＜0.05),首免后第42天,两组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功利用杆状病毒表达系统高效表达了PCV2 Cap,重组蛋白可诱导小鼠产生较高水平抗体,本研究为PCV疫苗的研制奠定了基础.
作者：张艳艳；张静远；缪发明；陈腾；杨金金；阮晓凤；张守峰；扈荣良 刊期： 2019年第01期
目的 原核表达、纯化树鼩干细胞生长因子(stem cell factor,SCF),并检测其免疫原性.方法 根据GenBank预测的树鼩SCF基因序列设计引物,PCR扩增SCF基因,克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-SCF,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达的融合蛋白经Ni柱纯化后,免疫家兔,Western blot和ELISA法检测其免疫原性,并检测SCF在树鼩不同组织中的分布情况.结果 重组表达质粒pET-30a(+)-SCF经酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为34 500,表达量约占菌体总蛋白的35.6％,以包涵体形式存在;纯化后的重组蛋白纯度达90％以上,可与兔抗人SCF多克隆抗体特异性结合,且免疫原性良好,抗血清效价为1∶256 000.在鼻、气管、肺、脾、肾、食管中能检测到SCF的分布.结论 在大肠埃希菌中高效表达了重组SCF蛋白,纯化复性后具有良好的免疫原性.
作者：龙琼；郝嘉茂；徐盟；毕研伟；肖红剑；李智华；闫玲梅；丁晨；李育中；姚月婷；寸韡 刊期： 2019年第01期
目的 对几种天然环二核苷酸(cyclic dinucleotide,CDN)作为人体佐剂作用的潜力进行比较.方法 以相同剂量的CDN(c-di-GMP、c-di-AMP、3′3′cGAMP和2′3′cGAMP)同人体来源的单核细胞白血病细胞(human monocyticleukaemia cells,THP-1)共孵育,同时将CDN(c-di-GMP和2′3′cGAMP)与脂质体混合后同THP-1细胞共孵育,刺激5h后,收集细胞及培养液,采用实时定量PCR及ELISA法检测IFNβ基因及蛋白的表达水平,同时检测脂质体对不同类型CDN刺激作用的影响.结果 4种CDN均能有效刺激THP-1细胞IFNβ基因及蛋白表达水平的提高,且对人体细胞作用从强到弱依次为2′3′cGAMP、3′3′cGAMP、c-di-AMP和c-di-GMP,各自之间差异有统计学意义(P＜0.01).脂质体能显著增强典型和非典型CDN对THP-I细胞的刺激作用,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 4种天然CDN对人体均具有潜在的佐剂效应,从作用强度看,2′3′cGAMP是优选择,同时脂质体能增强CDN的这种效应,为将来进一步对CDN类化合物的佐剂作用的研究奠定基础.
作者：王志标；单璞；魏多前；徐静 刊期： 2019年第01期
目的 分离鉴定一株疑似为牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)的毒株,并分析系统进化树.方法 从内蒙古某牛场患有呼吸道疾病的病牛鼻液中分离一株疑似为BPIV3的毒株,将分离毒株在MDBK细胞上进行增殖,并通过血凝试验及RT-PCR鉴定,同时对其N基因序列进行测定及分析,建立亲缘关系进化树.结果 该分离病毒可在MDBK细胞上增殖,且可产生特异性细胞病变,第6代细胞的毒力为107.1 TCID50/100 μL,与GenBank中已发表的BPIV3毒株N基因片段的同源性为99.9％,与序列号为D84095.1的BPIV3等亲缘性近.结论 本研究获得的分离株为BPIV3,与日本分离株(D84095.1)同源性较高.
作者：崔一龙；杨达汉；石芸；尹有勤；薛江东；马德慧 刊期： 2019年第01期
目的 在原核系统中表达铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)PAO1的调控蛋白RhlR,制备兔抗RhlR抗血清.方法 构建重组表达载体pGEX-4T-1-rhlR和pET-22b-rhlR并转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达GST-RhlR和His-RhlR蛋白,经GST或Ni2+亲和层析纯化重组蛋白.将His-RhlR蛋白免疫新西兰大白兔,制备RhlR抗血清,GST-RhlR蛋白包被ELISA板,检测效价.结果 构建的表达载体pGEX-4T-1-rhlR和pET-22b-rhlR经双酶切及测序鉴定证明构建正确;构建的工程菌表达的目的蛋白His-RhlR和GST-RhlR相对分子质量分别为29 000和54 000,表达量均约占菌体总蛋白的85％,纯度大于90％.制备的RhlR抗血清效价可达1∶80000.结论 获得高效价的RhlR抗血清,为PA中rhl调控系统的研究奠定基础.
作者：訾静；王军；高磊；张琨；张绪；万一 刊期： 2019年第01期
目的 比较两种免疫途径制备的肠道病毒71型(enteroviarus 71,EV71)兔血清抗体效价.方法 将EV71灭活疫苗原液分别经皮下及肌内注射途径免疫两组家兔,每组5只,剂量均为5 μg/只,两组均分别于0、7、14及28 d各免疫1次,初次免疫抗原与等量弗氏完全佐剂充分混合,后续免疫抗原与等量弗氏不完全佐剂充分混合.两组均于初次免疫前及每次免疫后7d经家兔耳缘动脉采血,分离血清,检测血清中和抗体效价.结果 两种免疫注射途径均可诱导家兔产生较高的抗体效价,7只家兔血清抗体效价均＞1∶10000,皮下注射组有3只,肌内注射组有4只;肌内注射组血清抗体效价整体优于皮下注射组,在初次免疫后第21天时尤其明显(P＜0.05).结论 肌内注射途径制备的兔血清抗体效价高于皮下注射,本实验为今后制备高效价血清抗体提供了参考.
作者：胡云光；沈冬；李亚东；杨晓蕾；洪超；付杰；王玺 刊期： 2019年第01期
目的 建立全人源单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)库的噬菌体展示技术.方法 采集100名健康老年志愿者的外周血,5 mL/人,混合所有全血并分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),抽提RNA,反转录合成cDNA,以其为模板,IgG类抗体基因为引物,PCR扩增获得重链可变区片段(VH)和轻链可变区片段(VL),然后以VH和VL为模板,经重叠PCR获得scFv,经sfi Ⅰ酶切,插入pComb3xss载体,电转后获得一定容量的抗体库;加入辅助噬菌体VCSM 13过夜培养,上清液经PEG-NaC1沉淀,无菌PBS重悬噬菌体沉淀,即完成噬菌体抗体库的构建;采用Phage ELISA法进行噬菌体单克隆抗体的特异性鉴定.结果 成功构建了库容为2.6× 109的噬菌体抗体库;随机挑选的100个噬菌体单克隆中共筛选到2个疑似H1N1株HA抗原的噬菌体抗体.结论 成功构建了噬菌体抗体库的技术平台,可用于各类功能抗体的筛选.
作者：张雨超；丁龙飞；陈健；张晓燕；徐建青 刊期： 2019年第01期
目的 建立登革病毒Ⅰ型(dengue virus-Ⅰ,DENV-Ⅰ)拷贝数标准质粒及其检测体系.方法 将DENV-Ⅰ的前膜蛋白基因克隆至pMD19-T载体,建立DENV-Ⅰ标准质粒,采用实时荧光定量PCR法进行扩增,获得Ct值与病毒拷贝数的关系,绘制标准曲线,得到相应的标准曲线方程.采用建立的标准质粒及检测体系对3份2017年云南西双版纳DENV-Ⅰ患者的血清进行检测.结果 经双酶切及测序鉴定,DENV-Ⅰ拷贝数标准质粒构建正确.实时荧光定量PCR得到的标准曲线方程为y=-0.3005x+ 12.133,R2=0.991 9.3份血清样品原液的病毒拷贝数分别为9 417 703.12、21 949 591.01及19 027 096.91 copies/μL.结论 成功建立了DENV-Ⅰ拷贝数标准质粒及其检测体系,且准确性较好,灵敏度较高,可用于血清样品中DENV-Ⅰ拷贝数的检测.
作者：林垚；洪珊；文送娇；席珏敏；王晓丹；陈俊英；潘明；叶超；管娇琼；孙强明 刊期： 2019年第01期
目的 建立重组人干扰素α2b(recombinant human interferon α2b,rhIFNα2b)注射液中间甲酚含量高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测方法,并对方法进行验证.方法 采用RP-HPLC法,选用ZORBAX 300SB-C18(4.6 mm×250 mm 5-Micron)色谱柱,流动相为水∶甲醇(50∶50),柱温45℃,上样量20 μL,流速0.5 mL/min,检测波长270 nm.对方法进行线性、专属性、准确性、精密性、定量限及耐用性验证.分别采用建立的方法及《中国药典》四部(2015版)4-氨基安替比林分光光度法测定3批rhIFNα2b注射液中的间甲酚含量,比较两种方法的测定结果.结果 该方法在间甲酚含量为1 000～0.1 μg/mL范围内线性良好,R2为0.999 3;药用辅料与IFN蛋白对间甲酚含量检测无干扰;该方法检测高、中、低3种浓度样品的平均回收率分别为97.10％、99.00％和103.94％,总的平均回收率为100.01％;重复性验证中RSD为0.105％,中间精密性验证中RSD为0.26％;该方法的定量限为0.1 μg/mL;同一色谱柱条件下,不同设备与不同时间配制的流动相对检测结果无明显影响;而使用不同程度色谱柱理论塔板数有明显差异.结论 建立的HPLC检测方法专属性、精密性、耐用性良好,准确性高,可用于检测rhIFNα2b注射液中的间甲酚含量.
作者：孙瑞欣；王江林；刘涵；刘云南；刘琳琳；张波；朱秋媚；李利 刊期： 2019年第01期
目的 试验设计(design of experiment,DOE)法优化肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)培养基,以期提高MP产量.方法 以MP(FH株)为试验菌株,PPLO培养基为基础,菌体蛋白含量为响应值,采用Plackett-Burman试验、陡爬坡试验及Box-Behnken试验对脑心浸液、水解乳蛋白、(月示)胨3号、精氨酸、小牛胸腺DNA、葡萄糖和胰蛋白胨7种培养基添加成分进行筛选及优化.以菌体蛋白含量及颜色变化单位(color change unit,CCU)为指标,验证改良培养基培养MP的效果.结果 培养基各添加成分对MP生长影响作用大小依次为葡萄糖、胰蛋白胨、脑心浸液、精氨酸、(月示)胨3号、水解乳蛋白、小牛胸腺DNA,终筛选出脑心浸液、葡萄糖及胰蛋白胨3种添加物,适浓度分别为5.68、1.34及2.64g/L.采用改良培养基培养MP 96 h时,菌体蛋白含量及CCU达大,分别为851.29 μg/mL及109 ccu/mL.结论 DOE法实现了对MP培养基的优化,获得了影响MP生长的主要参数,提高了MP菌体产量.
作者：李双丽；李泽华；朱文勇；陈枫；李卫东；廖国阳 刊期： 2019年第01期
目的 建立人胎盘来源的造血干细胞(placenta hematopoietic stem cells,hP-HSCs)和间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,hP-MSCs)的分离方法,并进行鉴定和组分分析.方法 选取10份新生健康婴儿胎盘组织,采用机械破碎法联合磁珠分选法分离hP-HSCs,胎盘绒毛膜组织块贴壁法分离hP-MSCs,利用形态学观察、集落培养、流式细胞术等进行鉴定.结果 hP-HSCs:分离后有核细胞数(total nucleated cell number,TNC)为(11.82±2.46)×108个,TNC回收率≥80％;细胞活性为(99.7±0.3)％;细胞表面抗体CD34+CD45dim表达率为(8.69±0.36)％,CD34+总数为(108.0±6.48)×106个;集落形成总数为(1.88±1.07)×106.hP-MSCs:冻存细胞总数为(40.78±9.35)×107个;细胞活性为(99.0±1.5)％;细胞表面抗体CD34+CD45+表达率为(0.1±0.1)％,CD44+CD105+为(99.6±0.2)％,CD14+CD19+为(0.1±0.1)％,CD90+CD73+为(98.9±0.2)％;且具有良好成脂、成骨分化潜能.结论 成功建立了hP-HSCs和hP-MSCs体外分离培养方法,为胎盘的临床应用奠定了基础,并提供了细胞种子资源.
作者：李欣；赵中利；罗晓彤；李珈莹；曹阳；于永生 刊期： 2019年第01期
登革热(Dengue fever,DF)由登革病毒(Dengue virus,DENV)感染引起,主要经埃及伊蚊和白纹伊蚊传播,是目前世界流行广且严重的虫媒性疾病之一,主要流行于东南亚、西太平洋、中南美洲、加勒比海和非洲等地区.目前,全球约36亿人生活在DF流行区,每年造成约4亿人感染,1亿人出现临床症状,超过200万人发展为重症DF,2万多人死亡.接种疫苗是预防该疾病的有效措施,目前虽已有DF疫苗上市,但效果不够理想.本文对目前DF疫苗研发中的主要障碍作一综述.
作者：王伟善 刊期： 2019年第01期
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国南方地区常见的恶性肿瘤之一,研究表明,其病因与EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)的感染密切相关.本文旨在对鼻咽癌、EBV、鼻咽癌诊断和治疗现状进行简要综述,并对国内外鼻咽癌相关预防和治疗性疫苗的研究现状进行概述,对未来相关疫苗的研究方向进行展望.
作者：李海龙；杨宇飞 刊期： 2019年第01期
α2-巨球蛋白(α2-macroglobulin,α2-M)是一种大分子糖蛋白,主要存在于人体的血浆中,是一种广谱蛋白酶抑制剂,可清除内源性及外源性蛋白酶.制备α2-M工艺的起始原料多为人血浆,实验室制备工艺大多结合使用免疫亲和层析、凝胶过滤、Cibacron蓝色琼脂糖亲和层析等,而规模化制备工艺一般先使用硫酸铵、利凡诺、聚乙二醇等方法进行粗分离,再使用锌离子亲和层析、凝胶过滤等方法进行精细分离.α2-M用于治疗放射性皮肤黏膜溃疡损伤、放射性肺炎、放射性膀胱炎、角膜炎及角膜溃疡具有良好效果.α2-M还可作为判断肝纤维化分期、胰腺炎病情轻重的一个生物标记物.本文主要就α2-M的制备工艺及临床应用作一综述.
作者：皇甫超济；党明安 刊期： 2019年第01期
狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种人和动物共患的急性传染病,对人类的身体健康造成了巨大的威胁.当前人类预防狂犬病的有效措施是注射具有较强免疫原性的狂犬病疫苗.本文主要对狂犬病疫苗在近年来的研究进展作一综述.
作者：周猛冲；李春明；李海龙 刊期： 2019年第01期
金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)是造成医院和社区获得性细菌感染的主要原因.在过去的研究中,抗金葡菌的特异性抗体反应占主导地位.新的研究正逐渐认识到T细胞不同亚群共同参与由金葡菌所引起的免疫应答,起到保护机体的作用.本文综述了金葡菌在动物和人机体中T细胞应答的新研究进展.
作者：曾江闽 刊期： 2019年第01期
目的 构建表达水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)gE抗原的重组腺病毒载体疫苗,并对其免疫原性进行评价.方法 采用AdEasy系统构建携带gE基因的重组腺病毒质粒pAdEasy-gE,PCR及Western blot法鉴定AD293细胞系包装的重组腺病毒rAd-gE,采用阴离子和复合介质Capto Core 700两步法对其进行纯化.以3.3×106、1×107、3×107 ifu剂量的rAd-gE分别单针肌内注射免疫NIH小鼠,检测小鼠血清抗体滴度.结果 PCR及Pac I酶切鉴定表明,携带gE基因的pAdEasy-gE构建成功;PCR及Western blot分析显示,AD293细胞系成功包装可表达gE糖蛋白的rAd-gE;经两步法纯化,可回收18.2％的rAd-gE.1×107和3×107 ifu剂量的rAd-gE可引起小鼠的体液免疫响应.结论 已成功构建表达高度糖基化gE糖蛋白的rAd-gE,可有效引起小鼠的体液免疫响应,为VZV新型重组腺病毒疫苗的进一步研发奠定基础.
作者：陈伟伟；崔海燕；温晔；彭少丹；朱涛 刊期： 2019年第01期
目的 对Vero细胞培养H3N2流感病毒条件进行优化.方法 使用Vero细胞培养H3N2流感病毒,对病毒感染复数(MOI)、吸附时间、维持液中NaHC03含量、TPCK-胰酶终浓度和细胞病变效应(CPE)等培养条件进行优化.结果 在MOI为0.05,病毒吸附1.5h,病毒维持液中6.6％ NaHCO3溶液加入量为2％,TPCK-胰酶终浓度为1 mg/L,40％～50％细胞出现CPE情况下收获病毒,血凝(hemagglutination,HA)效价高.结论 优化后的培养条件可用于大规模流感疫苗的生产.
作者：纪燕燕；范家佑 刊期： 2019年第01期
