在对单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染KMB-17细胞后的早期基因反应的研究中,从HSV-1感染后细胞特异性cDNA文库中筛选出一个1 381bp基因-HTRP,基因测序分析表明为与HSV-1感染相关基因(GenBank登录号:AF450482),含有完整的ORF框架,cds全长924bp,编码308个氨基酸.构建了pGEX-HTRP表达质粒,在大肠杆菌BL21中获得了较高的表达,采用Glutathione Sepharose4B进行亲和纯化后获得较高纯度的HTRP蛋白.用该蛋白免疫小鼠后制备的特异抗血清,在蛋白印迹实验中表现出抗体的特异性.
作者：刘龙丁；董承红；董少忠；王丽春；胡方；赵红玲；李琦涵 刊期： 2003年第01期
病毒基因组有限的编码能力和以病毒蛋白为靶的抗病毒药物易出现耐药性,使从病毒感染宿主筛选病毒感染相关生物大分子作为抗病毒药靶和诊断标志物成为新的研究方向.为了筛选流行性感冒(流感)病毒感染相关基因,采用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,以流感病毒A/鲁防/93-9(H3N2)感染的MDCK细胞及正常MDCK细胞为材料,构建病毒感染特异性差减cDNA文库.从文库中随机挑取约800个克隆,PCR扩增其中插入片段,经纯化、紫外定量后,用基因芯片自动点样仪点在氨基片上,制备cDNA芯片.将流感病毒感染的MDCK细胞和正常MDCK细胞的总RNA分别用Cy3、Cy5反转录荧光标记后,与cDNA芯片杂交,用芯片扫描仪扫描获得芯片杂交信号,经阳性对照校正和归一化处理后,以如下条件作为判定基因差异表达的标准;(a)Cy3与Cy5的信号比值大于1.5(正常细胞用Cy5标记)或小于0.67(正常细胞用Cy3标记);(b)Cy3和Cy5信号值之一必须大于1 000.经cDNA芯片筛选获得了18个流感病毒感染特异性克隆,经测序和生物信息学分析发现均为流感病毒感染相关新基因EST.流感病毒感染相关基因cDNA片段的获得,为新型病毒药靶诊断标志物发现和功能研究提供了基础.
作者：陈忠斌；杨静；王华；孙偶军；王升启 刊期： 2003年第01期
利用真核表达载体pCIneo和pcDNA3.1(+)分别构建了含有猪细小病毒VP1基因的pCIneo VP1和含有VP2基因的pCIneo VP2与pcDNA VP2三种真核表达质粒.将上述三种真核表达质粒分别转染IBRS-2细胞,利用间接ELISA检测表达情况,结果表明上述三种质粒均能在IBRS-2细胞表达,表达产物位于细胞中.在此基础上,利用这三种质粒分别以肌内注射的方式,间隔2周2次免疫小鼠,结果发现所有表达质粒均能诱导产生明显的细胞免疫和体液免疫,其中pCIneo VP1质粒诱导的体液免疫强,与猪细小病毒灭活疫苗免疫组相当,pCIneo VP2诱导的细胞免疫应答强于PPV灭活组,pCIneo VP1和pCIneo VP2联合免疫并没有加强作用.
作者：赵俊龙；陈焕春；吕建强；王祥；肖少波；周复春 刊期： 2003年第01期
PrP蛋白多肽序列上存在有不同的功能区域,影响着蛋白质构象、理化特性和生物学功能.为了获得不同缺损及突变的仓鼠PrP蛋白,以PCR方法获得不同大小的PrP基因片段,利用PCR大引物点诱变法获得带有突变糖基化位点PrP序列.所有PCR产物测序鉴定正确后,分别与pFASTBAC Hb质粒连接,与穿梭载体DH10BAC转座,构建各种重组病毒.Western blot证实,8种不同长度的仓鼠PrP蛋白可在昆虫细胞Sf9中表达,包括全序列的PrP1-231,信号肽缺失的PrP23-231;N端缺损的PrP90-231和PrP120-231;C端缺损的PrP1-199、PrP1-174和PrP1-160.糖基化位点突变:PrP23-231(N181Q).其中不带信号肽序列的PrP蛋白均呈HIS融合蛋白,而N端带有信号肽的PrP蛋白则不能与Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱结合,但可以同PrP特异性抗体发生免疫沉淀反应.这提示PrP信号肽序列在昆虫细胞中可能也发挥着与哺乳动物细胞相似的作用.不同缺损及突变的PrP蛋白的表达和纯化为进行蛋白生物学性状研究奠定了基础.
作者：张瑾；张福萍；聂凯；陈岚；周伟；刘勇；董小平 刊期： 2003年第01期
为研究重组病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)免疫血清的抗感染作用,用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达制备的人乳头瘤病毒6型(human papillomavirus type 6,HPV-6)L1 VLP和HPV-6 L1+L2 VLP免疫BALB/c小鼠,获得抗血清,ELISA法测定抗体滴度,在细胞水平和裸鼠异源组织移植模型中评价了免疫血清的中和病毒抗感染作用.VLP诱导了高滴度(＞1∶10 000)的血清抗体,抗血清可以特异地阻断人胚上皮细胞对VLP的摄入,并且能抑制从尖锐湿疣活检标本提取的HPV对人上皮组织的感染.重组HPV-6 VLP免疫小鼠诱导的血清抗体具有中和病毒、抑制感染的作用.提示重组VLP可以用于研制HVP预防性疫苗.
作者：王淼；陈连凤；许雪梅；王立良；陈建国；刘士德；司静懿；宋国兴 刊期： 2003年第01期
根据GenBank发表的传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)Beaudette毒株核衣壳(nucleocapsid,N)基因序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR方法分别扩增了疫苗毒株IBV-H52、嗜腺胃ZJ971株、嗜肾IBV-X和N株的N基因ORF,并克隆到质粒载体pBluescript SK(+),测序后用PCgene和DNA Star软件分析.结果显示:4株IBV的N基因均含有一个长1 230bp的ORF,编码一由409个氨基酸残基组成的N蛋白.嗜肾IBV-X和N毒株的N基因存在Hind Ⅲ酶切位点.与来自GenBank的另外8株IBV比较,ZJ971株与它们的N蛋白的核苷酸及氨基酸序列同源性分别在88.2%～98.6%和91.2%～97.8%;N株则分别为86.6%～87.4%和90.5%～91.5%;X株分别为86.3%～87.4%和90.0%～91.5%;H52分别为90.4%～98.3%和92.0%～98.0%.ZJ971株、N和X株的N基因的突变特点是散在的点突变.嗜腺胃ZJ971株核衣壳蛋白的氨基酸序列的显著的遗传变异特征是H111D、S117A、V142L、P171A和E401D;嗜肾IBV-X和N株核衣壳蛋白的氨基酸序列的显著的遗传变异特征是A46S、A48P、L189R、N190S、E220D、I223A、V236Y、S237K、K240Q、Q286R、T299K、R301E、E334D、V335E、V336P和T351S.
作者：周继勇；张德勇；丁红梅；程丽琴；陈吉刚 刊期： 2003年第01期
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)基因序列,设计两对特异性引物,用PCR方法从接种疑似PMWS仔猪病料的细胞中分段扩增2个分离毒株全基因组.将扩增片段克隆入pGEM-T easy载体,筛选获得含有相应片段的阳性重组质粒.对质粒中的插入片段进行测序拼接,获得2株均为1 768bp的全基因组序列.应用DNA star序列分析软件,对所测PCV-2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行同源性比较,并绘制系统发生树,结果发现:所测两毒株之间的核苷酸序列同源性极高,可达99.8%,亲缘关系密切;与PCV-2参考毒株的同源性介于95.3%～99.7%之间,其中与美国的一株PCV-2同源性高,分别为99.5%和99.7%,亲缘关系很近;与国内两分离株同源性分别为96.4%和98.8%～98.9%;与PCV-1参考毒株同源性仅为77.1%～77.5%.
作者：芦银华；华修国；陈德胜；黄伟坚；戴亚斌；谈国蕾；陈溥言 刊期： 2003年第01期
利用重组质粒pNeo-CK与pNeo-CKLacZ和表达乙型肝炎(乙肝)病毒S抗原的重组痘苗病毒RVJ123[1],构建了非复制型重组痘苗病毒RVJ123ΔCK.Southern blot证实,非复制型重组病毒RVJ123ΔCK基因组C和K片段间与宿主范围和毒力相关的基因稳定缺失,同时,J片段中插入的乙肝S抗原基因稳定存在.重组病毒RVJ123ΔCK在鸡胚成纤维母细胞中可良好繁殖,而在人源细胞系中不繁殖或仅低度繁殖,但都能表达HBsAg,并且在病毒一个复制周期内,复制型和非复制型病毒HBsAg表达水平无明显差别.
作者：陆柔剑；郭斐；娄元梅；孙朝晖；阮力 刊期： 2003年第01期
为了构建更为安全有效的抗低致病性H9亚型禽流行性感冒(流感)的基因工程疫苗,将包含有H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因、鸡Ⅱ型干扰素(IFN-Ⅱ)全长cDNA序列及调控其转录的鸡痘病毒早晚期启动子(PE/L)的基因片段,定向插入鸡痘病毒转移载体1175的痘苗病毒启动子P7.5的下游,得到HA和IFN-Ⅱ基因分别处于P7.5及PE/L转录调控下的重组转移载体1175HAIFN.以脂质体转染法将1175HAIFN转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中.1175HAIFN与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-HA-IFN-Ⅱ.通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV-HA-IFN-Ⅱ.以间接免疫荧光法和细胞病变抑制试验证实,纯化的rFPV-HA-IFN-Ⅱ感染的CEF能以非融合的方式同时表达HA和具有抗VSV活性的鸡IFN-Ⅱ.动物试验表明,rFPV-HA-IFN-Ⅱ能显著抑制静脉攻毒后1日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡从泄殖腔排毒,且能减轻单表达HA的重组鸡痘病毒(rFPV-HA)抑制1日龄SPF雏鸡增重的副作用.
作者：程坚；刘秀梵；彭大新；刘红旗；吴艳涛；张如宽 刊期： 2003年第01期
以墨西哥酸浆子叶作为外植体,与农杆菌EHA105(含质粒p1301HBs)共培养3天,通过延迟筛选的方法用潮霉素加压直接诱导成芽,抗性芽经诱导生根获得转化植株.经PCR、Southern点杂交等分子检测,证实目的基因已整合到墨西哥酸浆基因组中.ELISA检测证实了在墨西哥酸浆中表达的HBsAg具有较好的活性.初步比较了目的基因在转化植株、不同器官的表达水平差异.取注射初免1次但抗体水平明显下降的Babl/c小鼠,口服饲喂加强免疫,有明显的特异性抗体回升反应.表明转基因墨西哥酸浆疫苗作为口服加强免疫具有重要的理论和实用价值.
作者：高毅；马英；李梅；程通；李少伟；张军；夏宁邵 刊期： 2003年第01期
为了证实人乳头瘤病毒16型(HPV16)感染与食管鳞状细胞癌发生的关系,构建了包含HPV16E6E7基因的重组腺伴随病毒载体并包装重组病毒,重组病毒感染人胎食管粘膜组织,注射SCID小鼠皮下,在TPA协同下12周左右诱发肿瘤.PCR及打点杂交检测到瘤组织中HPV16E6E7基因的存在,HE染色表明为恶性鳞状上皮癌,培养形态及透射电镜观察证实了瘤组织的上皮来源.以上结果对于阐明食管癌发生的病毒病因、食管癌发生的分子机制以及为食管癌防治提供了理论和实践依据.
作者：张拥军；沈忠英；郭秀婵；赵健；曾毅 刊期： 2003年第01期
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)极易形成慢性感染,主要机制在于感染者不能产生强有力的细胞免疫应答以清除病毒[1].慢性HBV感染者体内虽然存在HBV抗原特异性T淋巴细胞,但对HBV抗原的反应性较低.研究发现,增强这类T淋巴细胞的反应性,可以促进HBV的清除[2].
作者：赵平；高军；王宏卫；曹洁；戚中田 刊期： 2003年第01期
鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)引起的鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)是鸡的一种急性、高度接触性传染性疾病,以呼吸道症状、肾炎和蛋产量和蛋品质下降为主要特征.由于病毒的高度变异性,产生了众多的血清型,不同血清型间缺乏有效的交叉保护作用,给免疫预防带来了很大的困难.近年来,该病的流行呈上升趋势,已成为继新城疫、传染性法氏囊病和马立克氏病后的又一大传染病,给世界养禽业造成了巨大的经济损失.
作者：戴亚斌；陈德胜；丁铲；潘杰彦；刘兴友；芦银华；刘梅；陈溥言；蔡宝祥 刊期： 2003年第01期
建立并评估分别检测戊型肝炎(戊肝)病毒IgM与IgG抗体的捕获法及间接法ELISA.以原核表达的多聚化重组HEV蛋白为抗原,建立戊肝捕获法IgM ELISA(E2-IgM)和间接法IgG ELISA(E2-IgG).利用29只实验感染猴系列血清及多份临床急性肝炎血清、正常人血清以及单克隆抗体评估所建立的方法的敏感性与特异性,并与商品化试剂(Genelabs公司抗-HEV IgG和IgM试剂,GL-IgG/GL-IgM)进行比较.29只恒河猴E2-IgM和E2-IgG的阳转率均为100%,其中75%在感染后4周内阳转,均早于ALT异常时间.E2-IgM持续2～14周,平均6周;E2-IgG在70周时仍无一阴转.GL-IgG阳转率为79.3%(23/29),多数晚于ALT异常时间,平均持续约18周,但长为1只在感染后70周时仍为阳性.用E2-IgM试剂盒检测928份正常人血清,仅2份OD值略高于0.2.检测510份临床急性肝炎血清,可明显将其区分为2个部分,一个部分OD值小于0.2,其OD值分布与正常人相似;另一个部分OD值大于0.4,共131份,其中109份大于1.0.可能分别对应于急性肝炎中的非戊肝患者和戊肝患者.119份非甲～丙急性肝炎中,E2-IgM阳性57份,GL-IgM阳性29份(E2-IgM均阳性).5 060份普通人群血清的E2-IgG OD值在0.2以下,形成一个近似对数正态峰,均值为0.022,在OD值0.4以上则分布均匀.用E2-IgG试剂检测200份临床急性肝炎血清,结果OD值0.2以下也形成一个与普通人群类似的近似对数正态峰,但OD值在大于1.0～4.0间形成另一个尖峰(峰值在OD2.5处),其中多数E2-IgM阳性.抗-HEV单抗可明显阻断E2-IgM及E2-IgG,单抗Fab段的阻断效果与完整抗体类似,提示这种阻断是表位特异的.建立的戊肝IgM试剂和IgG试剂具有良好的敏感性与特异性.IgM试剂适用于临床戊肝诊断,IgG试剂适用于既往戊肝感染诊断.
作者：葛胜祥；张军；彭耿；黄果勇；何志强；顾颖；朱子恒；吴文翰；夏宁邵 刊期： 2003年第01期
为了探讨杆状病毒诱导细胞凋亡的机制,用含AcNPV-ie-1基因的重组质粒pGAM-ie-1转染斜纹夜蛾细胞SL-1和粉纹夜蛾细胞Tn-5B1.转染后24h通过光镜观察、DAPI荧光染料染色、DNA琼脂糖凝胶电泳等发现,SL-1发生了典型的凋亡,而同样的现象并没有在Tn-5B1细胞中出现.利用放线菌酮(cycloheximide,CHX)、莫能菌素(Monensin)及蚜栖菌素(aphidicolin)处理AcNPV感染的SL-1细胞,发现细胞凋亡被莫能菌素及蚜栖菌素抑制,被放线菌酮推迟.此结果为进一步研究杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡的机制等奠定了基础.
作者：杜昌升；彭建新；洪华珠 刊期： 2003年第01期
颗粒体病毒的增强蛋白(enhancin)是一种能显著提高核型多角体病毒(NPV)对昆虫感染力的病毒蛋白.构建了一种不形成多角体但表达粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白的重组病毒AcBBH-TnEn,将它与野生型AcMNPV共同感染SF21细胞,经SDS-PAGE、免疫印迹分析、荧光免疫等方法检测证实,增强蛋白与多角体可在同一细胞中同时表达,而且发现所形成的病毒多角体带有增强蛋白.这表明,可以通过混合感染的方式生产带有增强蛋白的病毒多角体.
作者：王立娟；钟江 刊期： 2003年第01期
