随着现代分子生物学研究方法与计算机分子信息及模型处理技术的迅速发展,研究病毒基因结构与功能、三维构像与结构模型、病毒的遗传变异与系统进化,已成为现代分子病毒学研究领域的热点课题.其实质在于揭示病毒的复制与组装机制,探明病毒与宿主间的互相关系及遗传变异规律等,为终从理论上阐明病毒致病的分子机理,以及从实践上解决病毒病的诊断与防治技术提供有效的实验依据.20世纪50年代呼肠孤病毒的发现,首次证实了双链RNA病毒可作为稳定生命形式存在于自然界.特别是呼肠孤病毒特有的分段RNA基因组结构与全保留复制特征,为研究病毒的毒力、转录调控机制、病毒与宿主细胞间的相互作用提供了良好的研究模型.正呼肠孤病毒(亦简称呼肠孤病毒)T1L、T2J和T3D为呼肠孤病毒三种血清型原型分离株,目前已研究得十分深入.本文就近年来呼肠孤病毒结构与功能研究进展综述如下.
作者：方勤；朱作言 刊期： 2003年第04期
1 冠状病毒概述 冠状病毒属于冠状病毒科,是病毒中的一个大家族,因电镜下病毒颗粒形似王冠而得名.形态为圆形、椭圆形或轻度多形性,直径为100nm～120nm.人冠状病毒有两个血清型,即HcoV-229E和HcoV-OC43,是人呼吸道感染的重要病原,人类20%的普通感冒由冠状病毒引起[1].儿童的冠状病毒感染并不常见,但是5～9岁儿童有50%可检出中和抗体,成人中70%中和抗体阳性.冠状病毒也是成人慢性气管炎患者急性加重的重要病因之一.由于冠状病毒易于变异,同一株病毒可重复感染人体.冠状病毒具有严格的宿主特异性,只感染自然宿主或亲缘关系密切的宿主.冠状病毒感染广泛分布于全世界各地,主要发生在冬春季节.
作者：郭丽；王健伟；洪涛 刊期： 2003年第04期
根据JEV病毒减毒株SA14-14-2基因组序列,设计覆盖全长的4对重叠引物,以提取的活疫苗病毒RNA为模板,RT-PCR扩增出4 个片段,并克隆到质粒载体中,进一步构建两个半端分子克隆,然后将全长cDNA序列克隆到一个新改造的低拷贝质粒载体pBR-kpn中,构建我国流行性乙型脑炎病毒(JEV)基因组全长cDNA克隆.经过体外转录后得到的转录子转染B H K-21细胞,重新获得JEV的恢复病毒,通过生物学特性、分子生物学水平、蛋白水平等几个方面对恢复病毒进行鉴定.结果获得了稳定的全长cDNA克隆,转录子转染B HK-21细胞后,第4天开始出现细胞病变(CPE),第6～7天时CP E为?P,经过Vero细胞进一步放大培养后,间接免疫荧光实验和RT -PCR实验均为阳性.证实了构建的JEV的全长cDNA克隆有感染性,为进一步的研究奠定了基础.
作者：黄莺；贾丽丽；孙志伟；王志伟；俞炜源；俞永新 刊期： 2003年第04期
从外表健康的法国进口鸽中分离到一株鸽Ⅰ型副粘病毒(FP株),电镜观察病毒形态不规则,以圆形为主,平均直径100mm～120mm,表面有许多突起.其鸡胚平均死亡时间(MDT)为59.2h,鸡脑内接种指数(ICPI)为1.88.接种1月龄鸽能使其发病,出现明显症状和病变并有80%试验鸽死亡,接种2月龄SPF鸡全部死亡.经多重RT-PCR鉴定,属速发型新城疫病毒.应用RT-PCR技术对F基因重要功能区片段扩增后进行序列测定、分析表明,F蛋白裂解位点处的序列(112R-R-Q-K-R-117F)与新城疫强毒在这一区域的序列相符.与国内强毒F48E9株、疫苗毒Lasota株的核苷酸同源性分别为84.1%、82%,氨基酸同源性为84.5%、80.6%.与多株已报道的NDV参考株相应片段进行序列比较,经遗传基因进化树分析,鉴定为基因Ⅶ型,由此首次报道了鸽源基因Ⅶ型NDV株的存在.
作者：单松华；邵朝纲；邹键；李春阳；胡永强；王忠宽；龚祖埙 刊期： 2003年第04期
分别将牛泡沫病毒BFV3026接种于胎牛肺细胞(FBL)、牛肺细胞系(BL12)、新生牛肾细胞(NBK)、兔肺细胞(RL)、人乳腺癌上皮细胞(MCF)、293T、HeLa、CV-1、CHO等9种细胞,通过对它们及其传代细胞的病变观察与RT-PCR检测,确立BFV3026 对这9种细胞的感染.并以BFV3026原病毒DNA为模板,通过PCR 构建以pcDNA3.1(-)为载体的gag-pol、env真核表达质粒共转染BL12细胞,经G418持续筛选,获得8个NeoR细胞克隆. RT-PCR及包装实验证实:其中7个细胞克隆能有效行使包装辅助功能.
作者：余荭；孔晓红；李汀；马永钢；陈启民；耿运琪 刊期： 2003年第04期
应用DNA改组(DNA shuffling)技术重组了12种人α型干扰素基因,并结合噬菌体表面呈现(phage display)技术构建了噬菌体干扰素改组文库,采用简便的、功能性的定向竞争筛选方法, 获得了比活达1.0×109IU/mg的新型α型基因工程复合干扰素,是目前国际上已投产的α2型干扰素的5倍,具有生产应用前景,上述策略也为其它细胞因子或酶的改造提供了借鉴方法.
作者：段招军；王红艳；李武平；吕宏亮；赵军；魏开坤；马学军；侯云德 刊期： 2003年第04期
基于90种乳头瘤病毒的L1基因和E2基因的DNA全序列,应用似然比检验和贝叶斯推论重建病毒的系统发育树,并在此基础上讨论病毒分子系统学研究的一般原则和方法.同时比较研究贝叶斯推论和过去常用的小进化、大简约、大似然三种建树算法的优劣.结果表明:乳头瘤病毒可分为4超群,不同超群的乳头瘤病毒宿主和组织特异性不同.引起人宫颈癌的高危和低危乳头瘤病毒在进化上分别具有相近的亲缘关系,高危类群起源于共同祖先.算法的比较研究表明,贝叶斯推论作为进化生物学的新进展,在计算速度和可靠性上明显优于其它算法.
作者：郑楠；张原；敖滨；郑光宇 刊期： 2003年第04期
在华南地区进行鹅病病因的调查过程中,从患病鹅群中分离到一株对鹅和鸡都有致病力的病毒,初步判定该病毒属于Ⅰ型禽副粘病毒,命名为GPMV/QY97-1株.以GPMV/QY97-1毒株的基因组RNA为模板,通过RT-PCR方法,扩增出血凝素-神经氨酸酶(HN)基因3′端和5′端的cDNA片段,分别将其克隆至pGEM-T Easy载体中,对其进行序列测定.序列分析表明,HN基因的cDNA全长为2 024nt,编码571个氨基酸.序列中含有13个半胱氨酸残基和6个潜在的糖基化位点,其HN基因及编码蛋白结构与新城疫病毒株相符.将GPMV/QY97-1株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫病毒株的HN基因相应序列做比较后发现,它们的核苷酸序列同源性分别在89.6%～83.6%,氨基酸序列同源性在93.3%～87.9%.在同源性比较的基础上,进一步绘制了Ⅰ型禽副粘病毒株HN基因的系统发育树.这对于Ⅰ型禽副粘病毒毒力基因的功能分析和该病的分子流行病学调查有着重要意义.
作者：陈金顶；廖明；辛朝安 刊期： 2003年第04期
正常细胞的朊蛋白(PrPC)代谢和构象的改变是引发动物和人类可传播性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathies,TSEs)的根本原因.将羊瘙痒病( scrapie)仓鼠适应株263K颅内接种仓鼠, 在接种后的第20、40、50、60、70、80天, 通过Western blot 动态检测仓鼠脑中PrP存在的形式.结果在接种后第40天, 在感染动物脑组织中即检测到 PrPSc分子,比临床症状出现的时间早(平均潜伏期为66.7±1.1天),且无糖基化形式的PrP分子所占百分比在接种后期增加明显.除了标准分子量大小(30kD～35kD)的 PrP分子外,在感染动物脑中存在着高分子量和低分子量形式的PrP分子 .定量分析显示,随着接种潜伏期的延长,不同形式PrP分子的含量也在增加,其中低分子量形式的PrP分子与临床症状的出现密切相关.蛋白去糖基化实验表明,在感染动物脑组织中,除了标准分子量大小的PrP蛋白外,还存在一条更小分子量的PrP条带,而正常动物脑组织仅存在标准大小的Pr P分子.低分子量形式的PrP分子具有与全长PrP分子相类似的糖基化模式.结果提示,scrapie 263K感染的仓鼠脑组织中存在不同分子形式的PrPSc,其PrP分子的代谢可能不同于正常动物.
作者：高建梅；高晨；周晓勃；张瑾；韩俊；张宝云；董小平 刊期： 2003年第04期
将灭活的SARS冠状病毒抗原每隔两周多点注射免疫兔,共免疫3次 ,以观察SARS灭活病毒免疫兔后兔血清中IgG特异性抗体的应答变化.免疫前及第一次免疫后第8、14、21、28、35天耳静脉取血,分离血清.间接ELISA法测得血清中特异性IgG抗体持续升高,并表现出一定的剂量依赖性.第35天G1、G2、G3组血清IgG抗体滴度分别为1:51 200、1:49 600、1:25 600;中和试验测得G1组第28 天血清样品中和抗体效价为1:2 560;蛋白芯片测得M、N、3CL、S1、S2、S3、S4等病毒蛋白抗原都可特异性结合抗血清中的IgG抗体 ,但是不同蛋白抗原结合能力有差别.因此可认为SARS灭活病毒经皮下注射免疫兔后,可诱导全身性IgG抗体应答,产生SARS冠状病毒特异性抗体.
作者：刘新建；王一飞；熊盛；张美英；张传海；刘石生；李久香；李贵生；陆家海；万卓越；鄢心革；郑焕英；顾为望；孟民杰 刊期： 2003年第04期
依据GenBank上公布的新城疫病毒(NDV)的基因序列,自行设计了9对引物,运用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获取覆盖ND V鹅源毒株ZJ1株全基因组的部分重叠片段.病毒RNA的5′及3′端的序列由cDNA末端快速扩增技术(RACE)获取.整个病毒基因组序列由 15 192个碱基组成,比GenBank上公布的其它4个NDV毒株Be audette C、B1、Lasota及Clone-30的全基因组序列长6个核苷酸.这6个核苷酸位于核衣壳蛋白(NP)基因内,相对于ND V毒株Lasota株全基因序列的1 647nt～1 648nt位.其它1 0个NDV毒株中的9个毒株也被验证具有此特征,且它们分属于3个不同的基因型.
作者：黄勇；万洪全；刘红旗；吴艳涛；刘秀梵 刊期： 2003年第04期
用HindⅢ将HIV-1 Tat101蛋白编码基因从pEV质粒中切出,BamHI、NotⅠ将绿色荧光蛋白(GFP)编码基因从表达质粒pcDNA3.1 + /GFP中切出,分别插入到质粒LZRSpBM N-Z中,构建成重组反转录病毒表达质粒LZRS-Tat101和LZRS- GFP.采用磷酸钙转染法将两重组质粒转染到含反转录病毒env、gal 和pol编码基因的包装细胞Phoenix(ΦNX)中,嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系.分别收集稳定细胞系分泌的病毒上清,并感染体外培养的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)BCBL-1细胞.收集LZRS-GFP重组病毒感染的BCBL-1细胞进行流式细胞计数,检测GFP表达水平.收集L ZRS-Tat101重组病毒感染的BCBL-1细胞,提取蛋白作Wes tern blot,检测Tat蛋白表达状况;取细胞总RNA作Nort hern blot和定量PCR,检查HHV-8次要衣壳蛋白ORF26 mRNA转录水平.重组LZRS-Tat101病毒进一步感染HL3T1 细胞(HeLa细胞包含HIV-1-LTR/CAT报告基因),收集感染细胞提取蛋白,检测CAT活性,评价Tat生物学功能.PCR扩增H HV-8复制和转录激活蛋白Rta启动子区上游序列,并克隆至pGL-3 载体中,构建Rta启动子+虫荧光素酶(Luciferase)报告基因重组质粒.此重组质粒进一步电转染预先感染了LZRS-Tat101病毒的BC-3细胞,TPA刺激后收集细胞,检测Luciferase活性 .结果显示:①重组反转录病毒感染BCBL-1细胞,一次感染效率达56 %;②重组LZRS-Tat101病毒能够在其感染的BCBL-1细胞中表达Tat蛋白,且表达蛋白具有转录激活功能;③Tat蛋白不能有效上调 HHV-8 Rta启动子活性;④细胞内HIV-1 Tat蛋白诱导HH V-8可溶性周期复制的能力较弱.提示,单纯HIV-1 Tat蛋白并不能激活潜伏感染的HHV-8.
作者：卢春；黄丽；贾雪梅；曾怡 刊期： 2003年第04期
分别以马传染性贫血(马传贫)驴强毒(D-A EIAV)RNA和马传贫驴白细胞弱毒疫苗(DLA EIAV)RNA为模板,利用RT-PC R的方法,克隆到马传贫强、弱毒株基因组外显子-2及其下游的核苷酸序列 .然后将报告基因CAT插入到EIAV内含子2 env阅读框架中,构成 CAT拼接报告系统.同时在强毒株重组表达质粒的基础上,将其外显子-3 上游拼接受体位点的核苷酸序列CAG突变为弱毒株相应位置的核苷酸序列T AG,得到强毒单核苷酸突变株重组表达质粒.用构建的3个重组表达质粒D NA转染驴血白细胞,ELISA检测转染细胞CAT浓度.结果表明:EI AV强毒株重组表达质粒中CAT蛋白表达量高,EIAV强毒株重组表达质粒次之,EIAV强毒突变株重组表达质粒低.由于CAT基因被插入于各重组质粒中的EIAV内含子-2里,EIAV外显子-2、3之间的拼接可导致该基因的删除,因而其拼接效率低于EIAV mRNA外显子-2、 3之间的拼接效率.实验数据表明,EIAV SA2拼接信号序列单碱基变异提高了SD2-SA2拼接效率;D-A EIAV SA2-SD2拼接效率比DLA EIAV相应位点拼接效率高.
作者：刘相冬；张宝山；王滨有；杨威；孙成群；周家喜；王凯波；孔宪刚 刊期： 2003年第04期
为了研究重组鸡传染性支气管炎病毒核蛋白能否作为群特异性诊断抗原加以应用,将鸡传染性支气管炎病毒国内分离株IBV-LX4核蛋白基因亚克隆于大肠杆菌原核表达载体pPROEXTMHT中,构建拟表达重组鸡传染性支气管炎病毒核蛋白的重组质粒pPROEXTMHT-N.经核苷酸序列测定后,阳性质粒转化大肠杆菌DH5α,并进行诱导表达.表达产物经SD S-PAGE、Western blot鉴定,表明核蛋白在大肠杆菌中获得了表达,表达产物是分子量分别为约56kD和45kD的蛋白,其中分子量为56kD的蛋白表达量约为菌体总蛋白的13%.包涵体被6mol盐酸胍裂解后,通过镍离子亲和树脂进行了纯化,并用纯化的分子量为56kD的重组蛋白免疫新西兰白兔,所获得的兔抗鸡传染性支气管炎病毒核蛋白多克隆抗体,分别与不同致病型的鸡传染性支气管炎病毒进行琼脂扩散反应,结果表明 ,该多克隆抗体可与各不同致病型毒株发生反应.这初步表明重组鸡传染性支气管炎病毒核蛋白,可作为群特异性诊断抗原用于该病毒的诊断中.
作者：杜恩岐；刘胜旺；孔宪刚；童光志；杨增岐 刊期： 2003年第04期
树突状细胞(dendritic cell,DC)是目前发现的功能强的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)，能捕获、加工和提呈抗原,参与淋巴细胞的生长分化,并产生原发性CTL反应的细胞,在激活T细胞介导的免疫反应中起关键性作用[1].
作者：胡贵方；康禹；俞守义；彭建强；马鑫；吴小兵 刊期： 2003年第04期
Tm-22基因在烟草上的转化和表达表明,Tm-22基因在同科不同属植物体上的功能没有改变.在两种类型的纯合转化体上,Tm-22基因编码蛋白能够抗Tobamovirus属5种不同的毒株,并能被ToMV-2a毒株感染而失去抗病性.这个结果表明:移动蛋白上的氨基酸变异能够影响R蛋白对ToMV的应答反应.Tm-22基因转化体在不同启动子的调控下,对ToMV-2a毒株感染所表现的症状不同,说明启动子在Tm-22基因的抗病反应中具有非常重要的作用.
作者：姜国勇；杨仁崔 刊期： 2003年第04期
