为了确定特异的SARS抗体检测抗原,比较了SARS冠状病毒(SARS-CoV)主要结构蛋白与SARS患者血清的反应性.从SARS死亡患者的肺组织提取的总RNA为模板,用RT-PCR技术分别扩增S、N、M和E 4种结构蛋白基因,对3种S截短突变体和N、M、E的重组蛋白在大肠杆菌中进行表达.以表达的蛋白为抗原,应用Westernblot跟踪检测11例SARS患者血清54份.结果显示:SARS-CoV的重组N蛋白和S蛋白有很强的抗原性,S蛋白的3个区段的抗原性强弱存在差异,S3抗原性强于S1和S2;在患病第1周、2周、3周及3周以上,N蛋白和S3蛋白抗体检出率分别为40%、65.2%、100%、100%和40%、61%、76.2%、100%;提示SARS-CoV重组N蛋白和S3蛋白在SARS的血清学诊断中有一定的应用价值.
作者：王彦斌；常昭瑞；魏海燕；晁彦公；曲成毅；王健伟；洪涛 刊期： 2005年第04期
滚环复制是噬菌体繁殖所采取的一种基因复制方式,这种方式可使单链的环形分子在聚合酶和引物的作用下进行体外自我扩增.本文中用可特异性连接环化的寡核苷酸链作为探针,分别进行了1份细胞培养的禽流感病毒H5N1亚型样品、1份细胞培养的SARS病毒样品和4份丙型肝炎病毒阳性血清样品的检测.检测原理是探针与靶序列杂交后便可在T4DNA连接酶的作用下形成滚环复制中的环化单链分子,该分子在同温下可被特异性引物滚动复制和支链扩增.本文还利用按禽流感病毒NA1基因区序列合成的模拟DNA分子对该检测方法的灵敏度进行了测试.结果显示:利用固相RCA技术成功检测到三种RNA病毒的基因,该方法的灵敏度可达到能检测103拷贝模式DNA分子的水平.与传统的PCR方法敏感性的比较尚待进一步研究.
作者：李启明；马学军；侯云德 刊期： 2005年第04期
为了解融合蛋白F1分子的胞外非保守区在融合蛋白(F)与血凝素-神经氨酸酶(HN)的特异性膜融合中的作用,采用基因定点突变方法,在新城疫病毒(NDV)F1与人副流感病毒(hPIV)F1基因的胞外非保守区进行定点突变,创造酶切位点,得到分别含3个相同酶切位点的突变株NDV-M和hPIV-M.经检测,突变体的细胞融合功能与野毒株相同.然后用3个限制性内切酶分别从NDV-M与hPIV-M中切出两个片段NDV F-1、F-2及hPIV F-1、F-2.NDV-M和hPIV-M相互交换对应的F-1片段后进行基因重组,得到2个嵌合体(Chimera),即NDV-C1和hPIV-C1;同样方法交换F-2片段后又得到2个嵌合体NDV-C2和hPIV-C2.将各种嵌合体DNA与同源及异源HN基因共转染BHK21细胞后,在真核细胞中表达.Giemsa染色和指示基因法检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测F蛋白的表达效率.结果表明,突变体NDV-M和hPIV-M的细胞融合功能与野毒株相同,可用于构建嵌合体.NDV-C1和NDV-C2分别与NDV HN共表达后,融合功能达到野毒株的76.34%和96.2%,与hPIVHN共表达后均无细胞融合发生;hPIV-C1和hPIV-C2分别与hPIV HN共表达后,融合功能达到野毒株的65.82%和93.78%,与NDV HN共表达后无细胞融合发生.FACS分析表明,突变体及所有嵌合体蛋白F的表达效率与野毒株相比均没有明显变化.实验结果说明在F1蛋白的胞外非保守区中,NDV F-1和hPIV F-1这两个片段对于NDV和hPIV的特异性膜融合具有重要作用;而NDV F-2和hPIV F-2这两个片段对于NDV和hPIV的膜融合来讲,则特异性较低.
作者：任桂杰；王志玉；王桂亭；宋艳艳；许洪芝；温红玲 刊期： 2005年第04期
用RT-PCR方法分段扩增了乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株5'、3'NCR,利用融合PCR技术在5'、3'NCR之间引入BamHⅠ酶切位点,将5'NCR置于T7启动子控制之下,构建乙脑病毒微复制子表达载体pMR.分别将绿色荧光蛋白(GFP)和汉滩病毒核蛋白编码区基因插入到pMR中,构建两种表达外源基因的乙脑病毒微复制子表达载体:pMR-GFP和pMR-84FliS.经荧光显微镜直接观察、Western blot、ELISA等方法检测,证实外源基因能够在辅助病毒SA14-14-2感染的BHK-21细胞中表达.
作者：于建石；孟祥芝；胡孔新；刘琴芝；张全福；李川；李德新 刊期： 2005年第04期
以肠道病毒71型及其宿主细胞为研究主体,建立了一种二维液相色谱分离和分析比较病毒感染前后细胞蛋白表达谱的方法.该方法以高效液相色谱(HPLC)为技术平台,对细胞裂解物先后进行一维色谱聚焦分离和二维反相色谱分离.利用ProteoVue软件将二维色谱数据转换成模拟胶图,再利用DeltaVue软件对感染前后的宿主蛋白表达谱进行比较和分析,找出差异蛋白.二维液相色谱分离法能够根据蛋白的等电点和疏水性建立精确的细胞蛋白表达图谱,每0.2个pH为一个收集区段,在pH8.5～3.9的范围内可见蛋白条带约1 200条.该方法良好的重现性、自动化以及结果分析的简易化,使之在细胞表达谱差异显示中的应用潜力巨大,并且为研究病毒与宿主相互作用提供了新的方法和思路.
作者：朱俊萍；孙立连；卫灿东；李琳琳；金奇 刊期： 2005年第04期
将禽白血病病毒(ALV)的p27基因克隆入表达性载体pET28a,在大肠杆菌以His Tag融合蛋白的形式获得了高效表达.以表达产物免疫家兔,制备了抗ALV p27的多克隆抗体,经亲和纯化后,用此抗体建立了对ALV抗原的双抗体夹心法ELISA,并对疑似病料进行了实验室诊断.检测结果与IDEXX的禽白血病抗原检测试剂盒符合率达到98.6%,证明表达产物保留了天然p27蛋白的相关抗原性.交叉试验和群特异性试验证明,此方法具有良好的特异性,并且可以检测出A、B、J亚群的禽白血病病毒p27抗原.用此ALV抗体和所建立的ELISA方法成功地进行了禽白血病病毒抗原的实验室诊断.
作者：韩静；陈晨；曹红；陈福勇 刊期： 2005年第04期
为了构建更为安全有效能同时抵抗高致病性H5亚型和低致病性H9亚型禽流行性感冒(禽流感)病毒的基因工程疫苗,将H5和H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因,分别由鸡痘病毒早晚期启动子PS和PE/L调控其转录,定向插入鸡痘病毒转移载体p11S中,获得H5A和H9A基因分别处于PS及PE/L启动子转录调控下的重组转移载体p11SH5H9.以FuGeneTM6转染法将p11SH5H9转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中.p11SH5H9与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-11SH5H9.通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV- 11SH5H9.以间接免疫荧光法试验证实,纯化的rFPV-11SH5H9感染的CEF能同时表达H5A和H9A.初步的动物试验表明,用105PFU的rF-PV-11SH5H9免疫无特定病原体(SPF)鸡,免疫后血凝抑制(HI)抗体监测阳性率均为100%(8/8);该重组病毒能显著抑制H9亚型AIV滴鼻、点眼后7日龄SPF鸡从气管和泄殖腔排毒,同时也能抵抗H5亚型AIV肌肉注射后对7日龄SPF鸡致死性攻击,保护率均为100%,显示出一定的应用前景.
作者：陈素娟；石火英；孙蕾；刘秀梵 刊期： 2005年第04期
本文探讨了江西省和广东省宫颈癌患者人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染及其型别分布,分析了高危型HPV对各种宫颈病变的感染情况,为宫颈癌的早期发现和临床诊治提供科学依据.首先采用细胞学、HPV DNA检测(第二代杂交捕获法,HC2)、电子阴道镜和宫颈化学着色方法筛查宫颈癌患者,经病理镜检确诊,然后用GP PCR-SBT法对宫颈癌患者进行HPV基因分型.江西省溪口镇、古市镇及修水县城宫颈癌癌前病变发生率为5.7‰.HC2方法发现宫颈癌患者13种高危型HPV DNA阳性率为89.9%,宫颈上皮内瘤样病变的为84.8%,对照组为24.5%.采用GP PCR-SBT方法进行基因分型发现,江西省宫颈癌患者存在HPV16、58、31、33、18、66、6、11、56和81十种型别,其中HPV81型在国内外鲜有报道.据此提出生殖道高危型HPV感染是妇女宫颈癌发病的重要因素,并发现江西省宫颈癌高发区妇女高危型HPV感染率为24.5%.建立了HPV基因分型的方法,对HPV致宫颈病变的分子机制进行了分析.
作者：吴玉萍；陈裕隆；李隆玉；梁增文；张雁玲 刊期： 2005年第04期
PrP细胞外构象转化系统已经被一些实验室用于朊病毒的研究,但在反应体系中往往需要使用放射性同位素.为了建立一种安全方便的PrP无细胞构象转化系统用于TSE发病机制的研究,通过PCR方法获得仓鼠PrP(HaPrP)全长基因,克隆至原核表达载体pQE30,在大肠杆菌中表达并纯化出分子量为27kD HaPrP蛋白,Westernblot证实可与PrP特异性单克隆抗体反应.将纯化蛋白在体外标记生物素(Biotin-7-NHS),与纯化的scrapie 263K毒株仓鼠感染脑组织prpsc蛋白共同孵育4天后,经蛋白酶K消化,Western blot检测,证明存在一条抵抗蛋白酶K消化的、被亲和素特异性识别的条带,其分子量约为20kD.这表明HaPrpsen可以被转化为HaPrPres.实验表明,可以利用原核系统取代真核系统表达PrP,并用生物素标记取代35S标记纯化蛋白,建立一个更加安全方便的无细胞构象转化系统,用于朊病毒的研究.
作者：张瑾；王小凡；高建梅；李锋；韩俊；陈岚；张宝云；周伟；刘勇；董小平 刊期： 2005年第04期
对野生型烟草花叶病毒(TMV-U1)的外壳蛋白羧端序列进行系列缺失突变,观察到TMV-U1株系的外壳蛋白羧端序列缺失6个氨基酸(保留152个氨基酸),仍能较强系统侵染烟草并高水平表达外壳蛋白,且能在新生叶里复制大量完整的病毒粒子.该研究结果表明:外壳蛋白羧端6个氨基酸序列并非烟草花叶病毒感染和复制所必需,并对利用外壳蛋白羧端缺失型病毒载体表达外源多肽具有一定的启示性.
作者：马铮；李巧丽；宋任涛；许政暟 刊期： 2005年第04期
根据J亚群白血病病毒(ALV-J)原型株HPRS-103的序列设计了一对针对外源性ALV-J引物H5和H7,从发生ML病死鸡的肿瘤、骨髓、肝脏、脾脏和输卵管组织中提取DNA作为模板,经PCR扩增得到长度为545bp的片段,对其序列进行测定后,与ALV-J原型株HPRS-103的序列进行了比较,发现其核苷酸同源性为97.4%,所编码氨基酸的同源性为96.1%.该片段含有ALV-J gp85编码基因的部分序列和ALV-J pol基因的部分序列,从分子水平上证实了蛋鸡发生J亚群禽白血病,进一步证明了此前根据病理学观察、免疫组化及免疫荧光诊断的结果.这是首次从分子水平上证明蛋用型鸡发生J亚群禽白血病.
作者：徐镔蕊；董卫星；余春明；Lucy F.Lee；Maoxiang Li 刊期： 2005年第04期
病毒虽然需要依赖寄主细胞才能存活,但却有许多亚病毒分子为其寄生物,这些亚病毒分子需要辅助病毒来帮助其复制与包被.卫星病毒(satellite virus)、卫星RNA(satellite RNA)和类病毒(viroid)是目前所知分子小的生物实体(biological entity).多数卫星病毒与植物病毒相关,少数与噬菌体或动物病毒相关,如腺病毒的卫星病毒.卫星病毒可分为两大类,一类可编码自身的衣壳蛋白(capsid protein),另一类为卫星病毒RNA分子(曾被称为virusoid),需利用辅助病毒的衣壳蛋白.卫星病毒基因组为长度约0.5～2kb的单链RNA,与辅助病毒基因组无同源性,复制时常干扰辅助病毒的增殖.
作者：范树国；林纳生 刊期： 2005年第04期
RNA干扰(RNA Interfering,RNAi),又称RNA干涉,是一种由双链RNA介导的、转录后mRNA水平关闭相应基因表达的序列特异性基因沉默机制,它也是体内基因组抵御外在感染和内部转座的一种保护机制,广泛存在于各种生物,如植物、真菌、昆虫、后生动物和哺乳动物,包括人类.
作者：高永珍；金奇 刊期： 2005年第04期
嘧肽霉素是新报道的由土壤中分离筛选出来的不吸水链霉菌辽宁变种(Streptomyces achygroscopicus var.liaoningensis)产生的,其有效成分是胞嘧啶核苷肽类化合物,已获得农药临时登记,该药剂对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)等多种病毒病害具有很好的防治效果[1,2].定量竞争PCR(Quantitative competitive PCR,QCPCR)是一种定量检测细胞因子较为精确的方法[3],其实质是待测核酸(DNA或RNA)与内参模板一起竞争参与PCR反应,并通过电泳将扩增产物在凝胶上明显的分开,从而进一步进行定性或定量分析[4].该技术广泛应用于医学及食品研究领域[3-6],但在植物病毒学领域的应用鲜有报道.本研究采用定量竞争PCR方法和间接ELISA方法系统地测定了嘧肽霉素对烟草花叶病毒的抑制作用,并初步探讨了该药剂的抗病毒作用机理.
作者：吴元华；朱春玉；杜春梅；王艳红；赵秀香 刊期： 2005年第04期
近来,对白细胞介素18受体(IL-18R)及其转导机制的研究取得了较大进展.已经发现的与IL-18R有关的蛋白质有三种:第一种是IL-1受体相关蛋白(IL-1Rrp),即IL-18Rα,是IL-18R功的能性组分[1];第二种被称为辅助蛋白(AcPL),也即IL-18Rβ[2];第三种是IL-18结合蛋白(IL-18BP),其氨基酸序列与已知的细胞因子受体氨基酸序列均不同,可以在体外消除IL-18诱导的IFN-γ和IL-8的生成及对NFκB的激活[3].尽管IL-18BP与IL-18Rα没有同源性,结构也不相同,但是小鼠和人的IL-18BP均能抑制IL-18与其受体的结合.这表明,IL-18BP具有拮抗IL-18生物学活性的作用,是IL-18的拮抗剂.
作者：刘文强；杨少华；栾婧婧；高运东；仲跻峰；赵宏坤 刊期： 2005年第04期
导致严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)的元凶是一种新型的冠状病毒(SARS coronavirus,SARS-CoV).SARS-CoV感染入侵宿主细胞关键的一环是病毒自身的棘突蛋白(spike protein,S protein)与细胞受体的相互作用,故而S蛋白已成为SARS研究的主要热点.本文通过构建杆状病毒载体,利用昆虫细胞表达体系,在真核细胞中得到了全长S蛋白,并用恢复期SARS患者的血清对其进行了初步鉴定.这为进一步深入研究SARS-CoV S蛋白与宿主细胞的作用机制、研发SARS疫苗等提供了实验材料.
作者：李志杰；要国华；刘靖华；赵善超；邓鹏；徐军；姜勇 刊期： 2005年第04期
近年来对一些单组分菜豆金色花叶病毒属病毒(begomoviruses)的研究发现,这类单组分begomoviruses伴随着一种新型卫星分子-DNAβ[1,2].对我国云南省发生的双生病毒的研究表明,云南begomoviruses普遍伴随DNAβ分子,DNAβ分子与致病性紧密相关,且begomoviruses与其伴随的卫星DNA的是共进化的[3-5].为了弄清卫星DNAβ是否存在类似于卫星RNA的高度变异,将烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)及其伴随卫星DNAβ的侵染性克隆共同接种本氏烟(Nicotiana benthamiana)和心叶烟(N.glutinosa),对TbCSV卫星DNAβ在不同寄主中的分子变异进行了比较.
作者：青玲；周雪平 刊期： 2005年第04期
