应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension,SOE),经3次PCR将传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)多聚蛋白(VP2/4/3)基因和鸡白细胞介素2(Chicken IL-2, ChIL-2)基因进行融合,定向插入真核表达载体pCI的CMV启动子下游,获得重组质粒pCI-VP2/4/3-IL-2和pCI-IL-2-VP2/4/3.将其制备成DNA疫苗,肌肉注射14日龄非免疫鸡,2周后加强免疫,定期测定鸡抗IBDV血清ELISA抗体效价及病毒中和抗体效价.加强免疫后3周用IBDV标准强毒株攻击,连续观察3天后全部扑杀,计算保护率及囊体比,并进行组织病理学检查.结果表明:1)融合基因重组质粒pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3免疫后能明显增强IBDV DNA疫苗对强毒的攻击保护(保护率分别为83.3%、91.6%),显著高于pCI-VP2/4/3单独免疫对照组(58.3%);2)诱导产生的抗IBDV血清ELISA抗体效价明显增高(P＜0.05),同时能提高DNA疫苗诱导产生的中和抗体效价(P＜0.05);3)能显著促进鸡外周血液T淋巴细胞增殖反应.上述结果提示:IBDV VP2/4/3与ChIL-2基因融合后发挥了相互协同作用,ChIL-2产生了分子免疫佐剂效应;融合基因DNA疫苗能增强IBDV DNA疫苗的免疫原性,促进了机体特异性免疫应答.
作者：万旺军；谢荣辉；李龙；许健；郑江涛；于涟 刊期： 2006年第02期
为了对致病性强、危害性大的H5、H7、H9亚型禽流感病毒进行同时集成化快速检测,通过对GenBank已报道的禽流感病毒的HA基因进行序列分析比较,设计了H5、H7、H9 3个亚型的特异性引物和分别用3个荧光基团标记的Taqman MGB核酸探针.将各个亚型引物与探针优化组合,筛选出能够同时检测禽流感病毒 H5、H7、H9 3个亚型、且对Ct值和扩增效率影响不大的3组引物和探针,建立了三重实时荧光RT-PCR方法.该方法特异性好,在我们检测的样品中,没有发现假阳性和假阴性现象.同时敏感性高,检测禽流感病毒 H5、H7、H9亚型的敏感性分别达到1 000、1 000、500个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对禽流感H5、H7、H9 3个亚型的不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测3个病毒亚型.所建立的方法对保存的89个禽流感病毒样品进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定、HA、HI)的符合率达100%.用上述建立的方法与鸡胚分离法同时对新鲜采集的4 000多份临床样品进行检测,两种方法的检测结果符合率为100%.
作者：秦智锋；吕建强；肖性龙；钟安清；林镜中；黄运生；林庆燕；陈书琨；金显忠；林苗；刘胜利 刊期： 2006年第02期
应用病毒核酸载量法NASBA和HIV-1 RNA的巢式逆转录PCR(nested RT-PCR)法与HIV抗体蛋白印迹(WB)方法,对经过初筛的44例HIV-1抗体阳性标本进行了对照检测研究.发现了2例(gp160、p24)和1例(gp160、gp120、p66、p24)的特殊阳性样本,经NASBA法和该RT-PCR法核酸检测为阴性;WB确认的4例gp160阳性带、1例p24、p17阳性带和13例p24阳性带,经NASBA法和该RT-PCR法核酸检测也为阴性;而WB确认的其余全部带型的抗体阳性标本经过NASBA法和该RT-PCR法检测均为阳性.该研究表明对只有gp160、p24和gp160、gp120、p66、p24的特殊阳性标本和以p24为主的抗体不确定标本需要用RT-PCR或NASBA方法进行核酸检测,以进一步确认.
作者：杨成勇；刘翌 刊期： 2006年第02期
利用三重融合PCR法,即将3个DNA片段放在同一个反应里进行长片段PCR扩增法,融合得到了包含辛德毕斯病毒 XJ-160株结构基因E3、E2、6K、3′UTR和辛德毕斯病毒YN87448株结构基因E1的融合DNA片段E3E26KE13′UTR.通过此融合片段两端引入的Xba I和Xho I酶切位点将其连接到XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆骨架上,成功构建了辛德毕斯病毒株XJ-160与YN87448外膜糖蛋白基因E1相互替换的嵌合病毒cDNA克隆,命名为pBR-XJ160YE1.该克隆线性化后经体外转录,RNA转录体脂质体法转染BHK-21细胞,36h后细胞发生病变.间接免疫荧光检测到病毒蛋白的表达.提取5次传代后细胞上清中病毒RNA,RT-PCR法检测证明病毒来源于嵌合病毒cDNA克隆.此感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆可以作为研究辛德毕斯病毒E1糖蛋白基因相关功能及XJ-160病毒和YN87448病毒存在单方向血清学反应的分子机理的分子生物学工具.
作者：王力华；付士红；唐青；杨益良；梁国栋 刊期： 2006年第02期
检测广州地区艾滋病患者中人类疱疹病毒8(HHV-8)的感染状况并完成部分序列的测序,从而了解HHV-8感染相关的Kaposi's肉瘤在本地区艾滋患者中可能的罹患风险,并初步探讨HHV-8在本地区是否存在基因序列的变异.使用n-PCR法检测患者唾液中的HHV-8 DNA,PCR产物经ABI3100系统直接测序. 结果显示在广州地区艾滋病患者中唾液HHV-8 DNA阳性率为20.0%,而在作为对照的健康组的阳性率为0.0%,艾滋病患者组与健康对照组间具非常显著性差异;检测的部分碱基序列未发现变异.提示在广州地区的艾滋病患者中存在较高的HHV-8感染.
作者：张立伐；兰绍阳；王伟红；罗政；郑自华 刊期： 2006年第02期
ACE2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)是SARS冠状病毒(severe acute respiratory syndrome associated coronavirus, SARS-CoV)的主要受体.此研究旨在鉴定ACE2的SARS-CoV受体功能区,为进一步阐明SARS-CoV与细胞间的相互作用机制及研制抗病毒药物等提供理论依据.利用RT-PCR从Vero-E6细胞的mRNA中分两段扩增ACE2基因,其中N端片段ACE2A1-367(102～1 210nt)不包括ACE2的酶活性位点(1 223～1 237nt, 或374～378aa),而C端片段ACE2B335-805(1 101～2 524nt)包括ACE2的酶活性位点.扩增片段克隆入pMD-18T,并进行测序鉴定.进一步构建与GST基因融合表达的原核表达质粒pGEX-ACE2A与pGEX-ACE2B,IPTG诱导表达.表达的融合蛋白分子量为65kD和77kD,主要以包涵体形式存在.Western blot证实表达产物具有免疫学活性.将纯化的包涵体蛋白质复性后进行Western blot分析,证实pGEX-ACE2A表达的蛋白(～65kD)能与SARS-CoV S1蛋白特异结合,而pGEX- ACE2B表达的蛋白(～77kD)不能与S1蛋白结合.结果表明,ACE2的受体活性与酶活性位点无关,受体功能区在ACE2 N端367个氨基酸内.
作者：杨国良；费小战；陈焕春；郭爱珍 刊期： 2006年第02期
了解博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)在我国儿童急性呼吸道疾病中的感染情况.采用PCR扩增的方法对2005年10月～2006年1月收集的72例急性呼吸道感染的住院儿童鼻咽抽吸物(nasopharyngeal aspirates,NPA)进行了HBoV 基因检测.将PCR阳性产物进行TA克隆,测序,并将所测序列与GenBank中HBoV序列进行比较分析.72份标本中共检测到6份HBoV 阳性扩增产物,阳性率为8.3% (6/72),该6例HBoV阳性患儿临床均有肺炎或支气管肺炎症状.由此可以初步看出HBoV可能也是儿童急性呼吸道感染中较为重要的一个病原,且可能与儿童急性下呼吸道感染存在相关性.
作者：瞿小旺；漆正宇；段招军；刘劲松；刘巧突；刘文培；黄灿平；谢志萍；彭夫望；高寒春；郑丽舒；侯云德 刊期： 2006年第02期
探讨研制能同时检测HBV、HCV、HIV、HAV、GBV-C/HGV和B19的微阵列监控芯片.根据病毒公开发表序列,序列比对,得出保守区域,设计病毒的特异性检测探针,同时设置阴性、阳性参照探针,制备监控微阵列.利用随机引物PCR方法标记样品中的病毒靶序列,标记产物与微阵列上的探针杂交,清洗、扫描后进行结果分析.通过对质粒或模式分子的检测以及经HBV、HCV、HIV临床标本的验证,发现该微阵列监控芯片具有良好的特异性.其对质粒的检测灵敏度可达102病毒拷贝数,对临床标本的检测灵敏度可达103病毒拷贝数.此外,该微阵列监控芯片可检测出病毒混合感染血清.为微阵列监控芯片应用于此六种血液病毒的检测打下一定的基础.
作者：周蕊；马学军；孙梅生；李启明；匡治州；王征；侯云德 刊期： 2006年第02期
利用反向遗传技术将含有A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)株禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的6个内部基因与H5N1亚型AIV的2个表面基因HA和NA共转染COS-1细胞,产生了6+2全禽源的重配AIV.将H5N1亚型AIV的HA基因经基因突变致弱,然后将A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)AIV的6个内部基因的cDNA和以上致弱的禽源HA基因及NA基因的cDNA分别克隆到转录/表达载体pHW2000中,构建成8个转录/表达质粒.将8个质粒共转染COS-1细胞,24h后收获细胞及上清接种SPF鸡胚,72～90h后鸡胚死亡,收取鸡胚尿囊液进行血凝、血凝抑制试验、序列分析、病毒致病性试验和动物免疫保护试验,终证实产生了致弱的全禽源AIV疫苗候选株.
作者：石火英；张小荣；陈素娟；吴艳涛；刘秀梵 刊期： 2006年第02期
本文报道在内质网和细胞浆内稳定表达抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体,研究抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体抗病毒作用及其抗病毒作用机理.在获得稳定表达抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体的细胞系的基础上,用MTT法检测细胞内表达抗汉坦病毒单链抗体对细胞增殖的影响,证实细胞内抗体的表达不会影响到细胞的生长.不同时间收集病毒感染毒后细胞培养培养上清和细胞裂解物,用ELISA方法检测细胞内外病毒结构蛋白含量的变化,结果表明定位于细胞内质肉和细胞浆内的抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体均能不同程度降低感染细胞上清中的核蛋白含量,但是不能或轻微抑制细胞内汉坦病毒核蛋白的合成.利用病毒微量滴定免疫荧光方法,对细胞内抗体与病毒的增殖关系进行了研究,证实无论在内质网还是在胞质,抗核蛋白细胞内抗体都能够抑制病毒的增殖,具有抗病毒活性.抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体不能抑制病毒结构蛋白的合成,其抗病毒效果是通过抑制病毒的包装而实现.
作者：王涛；李建东；张全福；李川；刘琴芝；梁米芳；李德新 刊期： 2006年第02期
为研究重组腺病毒载体作为HPV16预防性疫苗的可行性,构建了含密码子优化型HPV 16 L1基因的重组腺病毒,并对优化基因在哺乳动物细胞中的表达进行研究.首先按照哺乳动物密码子偏好对野生型HPV16 L1基因进行改造并合成优化基因,命名为mod.HPV16L1.将mod.HPV16L1基因克隆到穿梭质粒PDC316上,与骨架质粒共转染293细胞,在细胞内包装重组腺病毒rAd-mod.HPV16L1.用免疫印迹法检测病毒感染的293T细胞中HPV16L1蛋白的表达.通过Optiprep密度梯度超速离心法纯化HPV16 L1病毒样颗粒(VLPs).用磷钨酸负染,在电子显微镜下观察HPV16 L1蛋白自我装配形成的VLPs.结果显示,重组腺病毒载体可介导mod.HPV16 L1基因在哺乳动物细胞内的高效表达,L1蛋白可自我装配形成VLPs.
作者：周玉柏；周玲；吴小兵；曾毅 刊期： 2006年第02期
该研究对仙台病毒BB1分离株的cDNA全序列进行测序,通过RT-PCR法获得的4个相互重叠的质粒克隆覆盖了全长基因组,并将BB1全长序列与其它已知的仙台病毒序列进行比较.BB1株病毒的基因组为15 384个碱基构成,与其它已知仙台病毒基因组的基因排列与组成规律是一致的,未发现插入或缺失突变.与现已公布5个仙台病毒代表株全基因组序列比较发现,BB1株与其它仙台病毒株同源性均有较大差异.遗传进化分析结果显示,BB1株与Z株和Hamamatsu株的同源性仅为87%和91%,不属于这两株代表的进化分支而归属于第三个基因型.
作者：杨宇；任鲁风；张辉；侯云德；吴小兵 刊期： 2006年第02期
自从中国香港报道H5N1亚型高致病性禽流感病毒可以感染人以及在中国暴发的SARS确认是由一种冠状病毒引起的以来[1,2],人们开始高度关注病毒在自然界中的变异.
作者：崔治中 刊期： 2006年第02期
获得性免疫缺陷综合征,简称艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS),是由免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染所引起的一种严重的传染性疾病.HIV/AIDS的流行已成为人类、社会和经济发展的灾难,全球活着的HIV感染者已超过4 300万人,每天约有14 000人感染HIV,其中1/2以上为24岁以下的青少年.自1985年我国发现首例AIDS病人以来,呈加速流行的趋势,疫情正在从高危人群向一般人群传播.截止到2005年底,我国估测存活的HIV感染者有65万;预计到2010年,如控制不力可能达到1000万,疫情非常严.由于目前尚无有效的预防疫苗和根治艾滋病的药物,当前防治的主要手段仍是预防为主.
作者：马晶；郭秀婵；曾毅 刊期： 2006年第02期
人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是性传播疾病的主要病原之一，高危型人乳头瘤病毒感染和宫颈癌的关系已被肯定[1],在约50%～90%的宫颈癌组织中可检出HPV16 DNA.
作者：徐茜；田训；吴莺；黄磊；赵赟；陈刚；王世宣；马丁 刊期： 2006年第02期
猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一种急性、高度接触性传染病,以呕吐、水样腹泻、脱水和对2周龄以内仔猪高度致死率为特征[1].
作者：孙东波；冯力；刘杰；时洪艳；佟有恩；刘胜旺；童光志 刊期： 2006年第02期
