潜伏膜蛋白1(Latent membrane protein 1,LMP1)是由γ疱疹病毒亚科的EB病毒基因编码的能够使正常细胞发生恶性转化的跨膜信号蛋白, C-端为LMP1的主要功能区.通过PCR从B95-8细胞和鼻咽癌活检组织中获得lmp1和lmp1 C-端30bp缺失(lmp1 C-terminal deleted,lmp1-ctd)基因;利用体外基因重组技术,将lmp1和lmp1-ctd分别插入AAV质粒载体中;应用 Lipofectamine介导转染HEK-293包装细胞,获得含lmp1和lmp1-ctd的rAAV;再以rAAV感染猴肾上皮细胞.利用RT-PCR检测lmp1和lmp1-ctd在猴肾上皮细胞中的转录;MTT法、流式细胞仪技术检测细胞生长和DNA合成,探讨lmp1和lmp1-ctd对其在细胞中活性的影响.结果显示:lmp1在转化细胞中转录,导致细胞生长速度加快,其中lmp1-ctd转化细胞的生长速度和处于增殖期比例高于lmp1转化细胞.提示lmp1-ctd较lmp1具有更强的促细胞增殖作用.
作者：杜海军；赵健；周玲；王琦；李红霞；曾毅 刊期： 2006年第06期
为了进一步了解新成人腹泻轮状病毒J19株的基因和蛋白特征,利用一种改良的非依赖核酸序列的单引物扩增方法扩增J19株的11个基因,克隆到pMD18-T载体中并进行测序.在此基础上,将主要抗原蛋白VP4、VP6和VP7的蛋白序列与其它轮状病毒的相关蛋白序列进行比较分析并对VP6蛋白序列做遗传进化分析.结果获得J19株11个基因的全长基因序列.基因序列分析表明J19株的第3、6和第9基因分别长2 512bp、1 287bp和820bp,它们分别预测编码抗原蛋白VP4(823aa)、VP6(396aa)和VP7(258aa).组成J19株的VP4、VP6和VP7蛋白序列对B组轮状病毒的CAL株、IDIR株以及ADRV株的相关蛋白序列的一致性分别是27.6%、38.5%和22.3%.对分组抗原蛋白VP6的遗传进化分析表明,J19株在进化树上的位置靠近外群蛋白分支以及A、B和C组轮状病毒分支的根部,而且它比较偏向于B组轮状病毒的分支.J19株的VP4、VP6和VP7蛋白序列与其它轮状病毒的相应蛋白序列存在显著差异.VP6蛋白序列的遗传进化分析表明J19株可能是一个新组轮状病毒的代表性毒株;同时,它也可能是一个与B组轮状病毒的起源和进化密切相关的毒株之一.关于新成人腹泻轮状病毒J19株11个基因的克隆及VP4、VP6和VP7基因的序列分析,这是第一次报道.
作者：蒋盛军；纪绍忠；唐青；杨红彦；崔晓英；毕烨；阚飙；高守一 刊期： 2006年第06期
为探索脊灰病毒型内重组、位点突变等分子特征与神经毒力的关系,对2002年6月四川省攀枝花地区发生的急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis, AFP)聚集病例的分离病毒株进行了转基因小鼠(PVR-Tg21 mice)神经毒力实验和全基因组核苷酸序列测定.结果显示:所测4株分离病毒(均为Ⅱ型脊灰病毒)神经毒力没有明显升高.4株病毒基因全长都是7 439bp,编码区翻译的氨基酸全长2 207aa.4株病毒的VP1区核苷酸序列完全相同.6208和6235c两株病毒是由Ⅱ型和Ⅲ型脊灰病毒在3A区重组而来, 6209和6236两株病毒是由Ⅱ型和Ⅰ型脊灰病毒在2C区重组而来. 4株病毒在5＇非编码区nt481和VP1区的nt2 909两个强减毒位点都发生回复突变,6209和6236两株病毒重组的SabinⅠ的重要减毒位点nt6 203亦发生回复突变.结合神经毒力实验和序列分析结果可以确定脊灰病毒的型别间的重组与神经毒力没有直接关系,同时可以推论SabinⅢ的nt5 832,SabinⅡ的nt1 450和nt2 386这3个位点可能是毒力相关位点.
作者：陈立；张礼璧；赵蓉；张勇；祝双利；王东艳；安洪秋；朱晖；侯晓辉；严冬梅；秦明晖；清水博之；许文波 刊期： 2006年第06期
收集81份HBV DNA阳性血清标本,经PCR扩增和序列测定确定其中有50份属于基因型C,31份属于基因型B;C基因型的基本核心启动子BCP T1762/A1764的突变率(38%)明显高于B基因型(12.9%,P＜0.05);前C区A1896的突变在B、C两基因型间无显著性差异,B基因型为9.7%,C基因型为12%,P＞0.05;HBeAg的表达与否与BCP双突变或前C区A1896突变均无明显相关性.经定量PCR检测证明,HBeAg阳性组中的HBV DNA含量明显高于抗-HBe阳性组,P＜0.05.组内BCP双突变株和野生株及前C1896突变株和野生株的HBV DNA含量无显著性差异.
作者：郭瑜；刘晓燕；陈斯勇；伊瑶；陈向伟；毕胜利 刊期： 2006年第06期
利用改造的昆虫杆状病毒表达系统转移载体,成功地对尼帕病毒(NiV)和亨得拉病毒(HeV)的核蛋白基因进行了分泌表达.重组蛋白表达的时效性分析结果显示,Sf9细胞感染重组病毒72～96h后,蛋白的表达量达到高峰,大规模表达可分别获得2.3～2.4mg/L纯化的目的蛋白.应用Western blot、间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)对两种重组N蛋白与兔抗NiV和HeV阳性血清的反应性进行鉴定,结果表明两种重组N蛋白和阳性血清有很好的反应性,并且在血清学上有交叉反应.该研究为今后开展流行病学调查和诊断试剂的研制打下了基础.
作者：肖昌；徐兴然；查云峰；张玉静；宣华；涂长春 刊期： 2006年第06期
根据pEGFP-C1序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出两端各含一个同向LoxP位点的GFP表达盒,克隆于转移载体pSKLR获得pSKLR-G-LoxP.通过经典同源重组方法,得到表达GFP的TK基因缺失伪狂犬病毒重组毒株S03109.该重组病毒在转染了pOG231(表达Cre重组酶)的293T细胞上连续传代,筛选得到重组病毒株S0419.荧光显微镜观察、Western blot及PCR检测结果表明,S03109感染细胞后持续表达GFP,而S0419不表达GFP.PCR 证实S0419为含单个LoxP位点的TK基因缺失病毒,并且在细胞培养上遗传稳定,测序结果(GenBank登录号AY822465)表明,在Cre重组酶的作用下,两个同向LoxP序列之间的GFP表达盒被正确除去.对BALB/c小鼠的半数致死量(LD50)及免疫保护实验结果表明,S03109和S0419对BALB/c小鼠的LD50值均大于3×105PFU,免疫BALB/c小鼠,攻毒后平均存活率分别为67.5%与70%.以上结果表明,利用Cre/LoxP位点特异性重组系统,成功去除了插入重组伪狂犬病病毒基因组中的GFP报告基因.
作者：苏鑫铭；于春梅；王敏秀；陈勇军；曹瑞兵；周斌；陈溥言 刊期： 2006年第06期
利用5株广谱特异性抗H5亚型血凝素单克隆抗体和酶联免疫渗滤技术成功地建立了一种适于现场检测H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的抗原快速检测试剂H5-HA(Ag) Dot-ELISA.该试剂对41株代表当前亚洲地区流行的各种遗传变异亚系H5N1禽流感病毒检测均为阳性,对多数毒株的分析灵敏度优于0.1 个血凝滴度 (HA titer),其中部分优于0.01 个血凝滴度;比较该试剂与早期开发的同类ELISA试剂,发现前者对后者未能检出的H5N1新变异株检测均为阳性;利用该试剂和商品化Directigen Flu A(BD)试剂检测两株H5N1病毒株,提示前者灵敏度高于后者;该试剂对一株H5N1病毒的检测灵敏度与标准RT-PCR相当;该试剂对24株非H5亚型病毒检测均为阴性,显示出良好特异性.以上结果提示,此研究建立的H5N1病毒抗原快速检测试剂在H5禽流感现场检测上具有较好的应用前景.
作者：葛胜祥；徐飞海；罗海峰；陈毅歆；郭永利；陈自敏；王嘉；罗文新；吴婷；张军；陈鸿霖；管轶；夏宁邵 刊期： 2006年第06期
采用常规的血清学试验和特异性RT-PCR方法对华东地区家养水禽中流感病毒的带毒状况进行4年多的监测,分离鉴定出国内报道的第一株H8亚型禽流感病毒.应用流感病毒通用引物成功地扩增出H8N4亚型禽流感病毒A/duck/Yangzhou/02/2005株(简称Dk/YZ/02/05)的全基因序列.将Dk/YZ/02/05的基因组核苷酸全序列与网上公布的基因序列进行比较分析,结果表明:Dk/YZ/02/05(H8N4)的8个基因片段均含有相应病毒基因的完整开放阅读框;其推导的血凝素(Heamgglutinin,HA)氨基酸剪切位点序列为P-S-V-E-P-R,为典型低致病性禽流感病毒的特征序列;神经氨酸酶(NA)在第48位氨基酸后无20个氨基酸的缺失;非结构蛋白(NS)79～84位也没有氨基酸的缺失.
作者：薛峰；彭宜；张小荣；姚春峰；龙进学；刘秀梵 刊期： 2006年第06期
以质粒pSilencer2.1-U6 Hygro为基础,设计并构建了针对狂犬病病毒(RV)糖蛋白和核蛋白mRNA的共9个siRNA表达载体,转染BHK-21细胞系后,在潮霉素-B的筛选压力下,获得9个稳定转录相关siRNA的BHK-21细胞株.1000TCID50的RV分别感染24孔板内的上述9株细胞,48h后以直接免疫荧光法检测各株细胞上RV的增殖,结果显示,在经不同siRNA表达载体转染的BHK-21细胞中,RV增殖水平有不同程度下降,RV增殖水平低者为对照细胞的1%,即RNA干扰效应高可阻断99%RV的感染.针对其中阻断水平超过90%的靶序列G69和N19,人工合成其双链siRNA,瞬时转染BHK-21细胞后,仍可达到80%以上的感染阻断率.本试验为有效阻断RV早期感染提供了新选择,为通过RNAi研究RV的基因组功能提供了新的依据.
作者：张守峰；李清竹；李忠；刘晔；张菲；卢彦欣；夏咸柱；扈荣良 刊期： 2006年第06期
为了实现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF5和ORF6基因在同一质粒中分别表达各自编码的蛋白,发挥E蛋白的病毒中和优势和M蛋白的细胞免疫优势,将构建成功的pIRES-ORF5/ORF6转移载体用脂质体法转入稳定表达的细胞CHO,经G418加压筛选获得具稳定表达的细胞株.以RT-PCR、SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况.结果表明:RT-PCR检测到两种目的基因的转录;SDS-PAGE和Western blot检测到同时表达的两种目的蛋白;间接免疫荧光检测到目的蛋白得到表达.
作者：李俊；符芳；袁小远；崔尚金；童光志；温建新；王金宝 刊期： 2006年第06期
为研究双剪接型2.2kb乙型肝炎病毒(HBV)基因组剪接变异体特异性新蛋白-yTPds的功能,以酵母双杂交系统的诱饵质粒pGBKT7克隆yTPds基因并转化酵母细胞AH109获得相应重组子,滤纸法及液相分析法测酵母转化子内β-半乳糖苷酶(β-gal)的活性,证实yTPds蛋白可反式激活酵母GAL4反应元件(GAL4 responsive element).在此基础上,为进一步探讨该蛋白反式激活作用的功能区域,以pGBKT7分段克隆yTPds基因,分别编码yTPds蛋白N端47个氨基酸(yTPds-N47)、N端75个氨基酸(yTPds-N75)、中部28个氨基酸(yTPds-M28)、C端92个氨基酸(yTPds-C92)、C端64个氨基酸(yTPds-C64)以及去除中部28个氨基酸的融合蛋白(yTPds-Fusion).各重组载体转化酵母细胞AH109获得相应转化子.滤纸法定性检测酵母转化子内β-gal活性,结果显示yTPds-N75、yTPds-M28、yTPds-C92蛋白可反式激活GAL4反应元件,液相分析法显示酵母转化子内β-gal活性强弱为yTPds-M28＞yTPds-N75＞yTPds-C92＞yTPds,提示yTPds蛋白反式激活作用的功能区域是其中部28个氨基酸,该区域对应于HBV preS1蛋白反式激活功能域.此研究证实双剪接型2.2kb乙型肝炎病毒(HBV)基因组剪接变异体特异性新蛋白具有反式激活作用,提示其可能具有重要的致病意义.
作者：陈婉南；郭丹华；柏世玉；王林；林建银；林旭 刊期： 2006年第06期
E.coli中表达的HEV衣壳蛋白片段P239(aa368～606)形成的类病毒颗粒与戊肝患者恢复期血清及中和单抗具有良好的反应性,较好地模拟了天然HEV病毒颗粒的表面空间结构.利用P239 吸附HepG2细胞的模型来模拟HEV对宿主细胞的吸附,多株中和单抗对吸附的阻断验证了吸附的特异性.P239与多株传代细胞系的吸附结果则表明了这种特异性吸附的细胞选择性.对阻断P239吸附的线性单抗进行定位,初步确定了P239与细胞相互作用的区域:ORF2上的aa423～443很可能和病毒上的细胞膜受体结合部位非常靠近,或可能直接参与构成了病毒与细胞特异性识别的表位.此本研究为进一步研究HEV与宿主细胞的相互作用提供一定的线索.
作者：何水珍；郑子峥；吴婷；谢明辉；苗季；张军；夏宁邵 刊期： 2006年第06期
目前用于免疫人群的流感疫苗多为三价灭活疫苗,包含A型流感病毒H1N1亚型、H3N2亚型和B型流感病毒.多年来的实践表明,三价灭活疫苗是有一定保护效果的.但是,由于流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)经常发生抗原转变和抗原漂移,使其抗原性表现出很大的变异,所以根据流感疫情监测预测的疫苗株也很难产生理想的保护效果.但流感病毒基质蛋白M2的膜外区氨基酸序列高度保守,有可能发展成为具有交叉保护能力的流感疫苗的候选抗原.该文就A型流感病毒基质蛋白M2疫苗的研究作一综述.
作者：郑丽舒；段招军 刊期： 2006年第06期
全球丙型肝炎病毒(HCV)感染者约为一亿七千万人,我国感染阳性率约为3.2%,HCV感染可导致肝炎、肝硬化、肝癌及肝外淋巴增生性疾病(包括巨球血症及B细胞淋巴瘤等).成年HCV感染者超过70%的人发展为慢性持续性感染[1-3].目前常用的抗病毒治疗的有效率不足50%,且费用昂贵[4].由于HCV免疫应答及逃逸机制尚不十分清楚[5],使HCV疫苗的研制也举步维艰,已有的HCV感染给社会造成了严重负担.据预测未来几十年中国因HCV感染而死亡的人数仍将继续增长,因此必须加速研究HCV感染过程及宿主应答的分子机制,发现新的抗病毒治疗的药物靶标,研制有效的HCV疫苗.
作者：谭文杰；阮力 刊期： 2006年第06期
在分子生物学领域,腺病毒载体是将外源基因导入动物细胞内经常使用的载体之一.由于其靶细胞种类多,转导效率高,对增殖期及静止期细胞均有很高的转导效率,不整合到宿主基因组中,不会引起插入突变,理化性质较稳定,易于分离纯化,可容纳较大的目的基因片段等优势,因而被广泛用于基因治疗、体外基因转染及基因疫苗制备等实验及临床研究中,其中Ad5F35型腺病毒载体为近年来研究热点之一,此文就其研究进展作一综述.
作者：莫武宁；唐安洲；周玲 刊期： 2006年第06期
禽呼肠孤病毒的感染在我国鸡群中非常普遍,它除了可引起鸡传染性关节炎外,还可能引起矮小综合症和免疫抑制等.从鸡群中分离到的不同毒株ARV的毒力差别较大,抗原性也不尽相同[1].ARV是一种双股RNA病毒,病毒颗粒中的基因组有10个不同的独立节段组成[2].其中对S1节段研究的比较详细,而对其它节段的研究尚不深入.现已知,ARV的S1节段有3个ORF,分别编码P10、P17和δ3三种蛋白质[3,4 ].其中δ3是一种结构蛋白,并可能与病毒吸附宿主细胞及病毒中和反应相关[5].而P10和P17为非结构蛋白,但其中P10与感染细胞后细胞膜融合相关[6].为此,Bodelon等[4]在大肠杆菌中分别表达S1节段的P10、P17和δ3三个基因,同时比较了这三个基因产物对细菌膜通透性的影响.
作者：孙爱军；庄国庆；崔治中 刊期： 2006年第06期
