本研究旨在利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,检测与手足口病密切相关的多种肠道病毒类型,探明济南市手足口病病原谱的构成.选取济南市2009～2012年6月手足口病病例标本274例,经多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,研究与手足口病密切相关的15种肠道病毒:肠道病毒71型(Human enterovirus 71,EV71)、柯萨奇病毒A组(Coxsackievirus A,CVA) 16、4、5、6、9、10型和柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus B,CVB)1、3、5型,以及埃可病毒(Echovirus,Echo)6、7、11、13、19.结果显示:2009～2012年济南市手足口病274例标本中,检出EV71 69例(25.18％),CVA16 44例(16.06％),CVA10 39例(14.23％),CVA6 20例(7.30％),CVB1 3例(1.09％),Echo6 2例(0.73％),CVA9 1例(0.36％),CVB3 1例(0.36％);两种以上病原体混合感染14例(5.11％).CVA10和CVA6是引起济南市手足口病的两大病原体,仅次于EV71和CVA 16;流行季节为4～8月,发病高峰分别在4月和6月.利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,首次明确了济南市手足口病的肠道病毒主要类型,为济南市手足口病疫情的防控及临床治疗提供了科学依据.
作者：关恒云；杨梦婕；刘岚铮；王佶；杨国樑；张雯；马学军；王春荣 刊期： 2014年第05期
罗氏沼虾白尾病(White tail disease,WTD)是流行于罗氏沼虾苗种阶段的重要疾病,该病病原被确定为罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rosenbergii Nodavirus,MrNV),为了建立罗氏沼虾野田村病毒中国分离株(MrNV-chin)的便捷、灵敏、特异的分子诊断方法,本研究根据罗氏沼虾野田村病毒RNA2基因保守序列的6个区域设计了4条特异性引物和1条检测探针,将环介导等温扩增技术与侧向流层析试纸(Lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立了MrNV的RT-LAMP-LFD检测方法.结果表明,该方法的灵敏度是常规琼脂糖凝胶电泳的10倍;从核酸提取到检测结果判定仅需45min;反应特异性强,对其他虾类病毒WSSV、IHHNV、IMNV、TSV和YHV扩增结果均为阴性;操作简单,不需要复杂的仪器,在61℃水浴反应即可;利用LFD试纸显示结果,肉眼可直接观察判定.作为一种快速灵敏实用的分子诊断技术,该方法有利于罗氏沼虾白尾病的诊断与预防.
作者：林锋；刘莉；郝贵杰；曹铮；盛鹏程；吴颖蕾；沈锦玉 刊期： 2014年第05期
2013年在中国台湾地区发现了第一例人感染H6N1禽流感,研究该地区H6N1病毒血凝素基因(HA)的适应性进化特征和种群动力学,将为人感染H6N1病毒的来源、进化及致病机制的理解提供更多信息,为进一步的研究和防治提供一定帮助.本研究从Flu和GISAID两大数据库中获得中国台湾地区所有已释放的H6N1病毒的HA序列,构建系统发育树和进化动力曲线,并推测其进化速率,分析其适应性进化特征.结果表明中国台湾地区H6N1病毒的HA有五种类型,其中人感染H6N1病毒的HA所属类型为目前当地优势类型;该病毒种群于1971年底第一次扩张,2008年迅速减少,而后又略有增加.同时在长期的进化过程中,3个位点受到正选择作用的影响,增加了病毒的适应能力;89个位点受负选择作用的影响,它们在病毒的复制、流行中可能具有重要的功能;其中剪切位点附近的329位所受负选择作用强烈(PsLAC0.001、PFEL0.000、BFREL 137),此位点可能与病毒毒力有关.中国台湾地区H6N1病毒的HA已发生了明显的适应性进化,具有发生疫情的可能性,人们应高度重视,并能及时给与监测和防治.
作者：杨建课；朱晓蕾；汪萍；高继光 刊期： 2014年第05期
为了解人肠道病毒A71型(Enterovirus A71,EV-A71)的基因重组和遗传进化特征,探索其毒力相关位点.本研究通过对郴州市3株EV-A71分离株进行全基因组序列测定和分析,应用RDP软件(版本4.1.6)将其与231条EV-A71全基因组序列进行比较分析,检测可能的重组事件及重组位点;采用SimPlot软件(版本号3.5.1)对重组序列、2条亲本序列和其他A组肠道病毒(EV-A)代表株序列进行相似性分析;采用MEGA软件(版本5.2)构建系统发生树;结果发现郴州市3株EV-A71毒株均检测到重组信号,其共同的亲本主序列为广东省2009年毒株,亲本亚序列为中国台湾地区2008年毒株;我国C4b进化分支EV-A71代表株(分离于1998年的SHZH98株)和C4a进化分支EV-A71代表株(分离于2008年的安徽阜阳株)均与CVA4、CVA14及CVA16原型株在3D区域检测到型间重组信号.采用SPSS软件(版本19.0)对不同病例类型的变异位点作卡方检验以筛选出可能的毒力相关位点.发现死亡病例组与重症病例组间未找到具有统计学意义的突变位点;而死亡与重症病例合并组与一般病例组进行比较,共发现18个突变位点具有统计学意义,这些突变位点仅分布于P2区和P3区,而P1区未见.我国大陆的EV-A71流行株与EV-A其他毒株的型间重组早在1998年前即已经发生,并且在2008～2012年的手足口病暴发疫情中,EV-A71的型内重组频繁发生.此外,EV-A71毒力的改变可能与非衣壳蛋白区的变异相关,因此应该关注非衣壳蛋白基因改变对病毒毒力的影响.
作者：刘爱平；谭徽；谢群；陈柏塘；刘晓峰；张勇 刊期： 2014年第05期
为研究有效的通用流感疫苗,解决流感疫苗株定期更换的难题.本课题利用乙肝病毒核心抗原(Hepatitis Bcore atigen,HBcAg)蛋白可以形成病毒样颗粒(Virus like larticle,VLP)的特点,将高致病性人禽流感A/Hubei/1/2010(H5N1) HA2的76～130氨基酸(Amino acid,AA)线性保守区(Linear conserved rgion,LCR)与HBcAg融合表达,并对其进行免疫学评价.其结果显示,优化后的LCR-HBc片段能够在pET30a大肠杆菌原核表达系统中大量表达.将纯化后的融合蛋白免疫小鼠,发现LCR-HBc疫苗组H5N1血凝素(Hemoglutination,HA)特异性IgG抗体滴度可达到1∶12 800以上.对免疫后小鼠的A/PR/8/34 (PR8)致死剂量攻毒实验结果显示,LCR-HBc疫苗组肺病毒载量显著低于对照组(P＜0.01),对小鼠的保护率为50％.本研究的开展为流感通用型疫苗的研制提供科学线索.
作者：辛丽；杨星钰；于在江；薄红；周剑芳；秦堃；舒跃龙 刊期： 2014年第05期
为了探究绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)内蒙古流行株与国际各代表株间的亲缘关系,本研究以内蒙古地区绵羊肺腺瘤病自然病例的肺组织总DNA为模板,克隆gag、pro与pol基因,并应用双酶切的方法将其与本实验室先期制备并保存的LTR、env基因连接起来,得到了含有JSRV内蒙古分离株前病毒全基因组重组质粒pMD-JSRV.序列分析结果表明,JSRV内蒙古分离株前病毒全基因组全长7 690 bp,具外源性JSRV典型的分子特征:①在gag基因中含Sca Ⅰ酶切位点;②核衣壳蛋白区有2个保守的可形成锌指结构的“CCHC”基序;③env基因编码的TM区胞浆尾部包含保守的特异性“YXXM”基序.将其进行同源性分析,结果表明该株病毒属JSRV-Ⅱ型,与分离自美国的代表株AF105220间亲缘关系较近,同源性达95％.本研究为进一步探讨JSRV内蒙古分离株基因组结构特点与其致病机制间的关系奠定了基础.
作者：刘畅；李磊；于立新；么宏强；周建华；马学恩 刊期： 2014年第05期
本研究探讨宿主因子莫罗尼白血病病毒10(Moloney leukemia virus 10 MOV 10)蛋白对异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(Xenotropic murine leukemia virus-related virusis,XMRV)复制的抑制作用,以及MOV 10抑制XMRV复制的初步机制和关键结构域.通过转染、感染、免疫印迹(Western blotting)及实时定量PCR(Real-time PCR)方法检测MOV10对XMRV的抑制作用及机制,结果显示MOV 10可明显抑制XMRV,并且这种抑制作用具有特异性.经进一步证实,MOV 10包裹进XMRV病毒中,随之在病毒感染细胞时发挥抑制作用;MOV 10可以抑制XM-RV的DNA产生;MOV 10发挥抑制作用的关键结构域是MOV 10本身RNA解旋酶的7个保守结构域.以上的研究结果表明MOV 10对XMRV具有明显的抑制作用,初步阐明了MOV 10抑制XMRV复制的机制,明确了MOV 10发挥抑制作用的关键结构域.本研究进一步证实了MOV 10具有广谱的抗逆转录病毒的活性,在宿主对抗逆转录病毒感染时发挥重要作用.
作者：张悦；胡斯奇；庞晓静；李健；郭斐 刊期： 2014年第05期
为了探索大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV) SC7外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列与病毒致病性作用及其与美国株系的对应关系,本研究通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),克隆了我国SMV SC7株系的CP基因,并测定了其全序列.结果表明:CP基因长度为795bp,编码的CP蛋白为265个氨基酸.在致病性反应上,SC7的毒力比美国的毒株更强些.在分子水平上,CP基因核苷酸序列差异为4％～5％,编码的氨基酸序列差异为1％～2％.美国株系N端都存在与蚜传有关的保守基序DAG (Asp-Ala-Gl),但在SC7为DAD(Asp-Ala-Asp).将序列信息与SMV株系在鉴别寄主上的症状反应进行综合分析发现,CP基因的同源性与SMV在鉴别寄主上的致病性反应没有明显关系.
作者：蔡春梅；姜骁；赵春梅；马渐新 刊期： 2014年第05期
3型人副肠孤病毒(Human parechovirus 3,HPeV3)是2004年发现的与儿童脓毒症密切相关的一种病原体.HPeV基因组是不分节段的单股正链线性RNA.测定其全基因组序列有助于了解北京儿科患者中流行的HPeV3的遗传背景和进化地位.方法采用将一名脑脊液和血清中HPeV3核酸检测均为阳性的脓毒症患儿(编号:BJ-C3174)的血清标本接种到细胞后从培养上清中检测到HPeV3核酸,随后分段扩增HPeV3 BJ-C3174株的全基因组序列,并进行序列测定、拼接及分析.结果表明BJ-C3174株基因组全长(未包括3'末端的PolyA尾)7 329个核苷酸(nt),其中5 '和3'编码区(UTR)分别长707 nt和91 nt,编码区长6 531 nt,可编码一个长为2 177个氨基酸的多聚蛋白.BJ-C3174病毒株与已发表的HPeV3型病毒株位于同一进化分枝,而与HPeV8、HPeV6和HPeV1等型别进化距离较远.BJ-C3174株与德国HPeV3 BONN-2株亲缘关系为密切,两者核苷酸相似性达到99.3％,氨基酸相似性达到99.8％,均高于其与HPeV3原型株A308/99的相似性(89.6％和98.6％).各基因片段中,BJ-C3174株均与BONN-2株相似性高,核苷酸和氨基酸相似性分别达到98.3％和99.3％以上.未发现BJ-C3174株存在基因重组现象.
作者：朱汝南；罗雷；钱渊；赵林清；邓洁；王芳；孙宇；宋秦伟；丁雅馨 刊期： 2014年第05期
沼泽绿牛蛙病毒(Rana grylio virus,RGV)属于虹彩病毒科(Iridoviridae),蛙病毒属(Ranavirus),其基因组中含编码尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶(dUTPase)的基因67R.通过构建缺失67R的重组病毒△67R-RGV,探讨67R在RGV复制和感染过程中的功能.首先构建携带有作为标记的绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)基因的质粒(pGL3-67RL-p50-EGFP-67RR),然后将该质粒与RGV基因组在67R位点进行同源重组(homologous recombination),并接种到培养的鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid,EPC)单层细胞中.利用荧光显微观察,判断并筛选有感染性的重组病毒(△67R-RGV).经过十轮挑斑分离,直至在普通显微镜下观察到的细胞病变空斑与荧光显微镜观察到的绿色荧光空斑完全吻合,获得一株新的、纯化的重组蛙病毒△67R-RGV.再以野生型蛙病毒(wt-RGV)为对照,分别扩增并提取wt-RGV和△67R-RGV的基因组DNA,进行PCR检测.结果显示,在wt-RGV基因组中可检测到67R;但在△67R-RGV基因组中仅检测到EGFP,却检测不到67R,证实在构建重组病毒时,EGFP的确按预期插入67R位点.进一步分别测定了wt-RGV与△67R-RGV的一步生长曲线,结果无显著差别,表明67R及其编码产物dUTPase的缺失并不影响RGV的正常复制,67R为病毒非必需基因.
作者：黄星；裴超；何利波；张奇亚 刊期： 2014年第05期
为探讨山东省环境污水监测中埃可病毒11型(Echovirus 11,Echo11)的动态变化及分子流行病学特征,本研究对山东省2011～2012年环境污水监测分离到的Echo11毒株进行了VP1区核酸扩增和序列测定,并与1994～2010年山东省急性弛缓性麻痹(Acute flaccid paralysis,AFP)监测系统中Echo11分离株以及国外同型毒株进行同源性分析和系统发生学分析.结果显示:2011～2012年山东省济南市和临沂市共分离到Echo11 94株,其时间分布具有季节性特征,夏秋季高峰明显.分离毒株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为89.5％～100.O％和95.4％～100.O％;与原型株(Gregory)之间核苷酸和氨基酸同源性分别为76.6％～79.7％和90.4％～92.5％.山东环境分离株全部属于A基因型,毒株之间核苷酸变异较大,提示山东地区存在多个传播链共循环.本研究描述了山东省环境污水中Echo11分离株的动态变化和遗传特征,结果证明环境污水监测是探索人类肠道病毒动态流行和遗传变异的重要手段.
作者：李文凤；陶泽新；杨静；林小娟；刘尧；纪峰；王海岩；王素婷；宋立志 刊期： 2014年第05期
比较不同佐剂配伍的效果,探讨常规剂量(5μg)钙调磷酸酶B亚单位(Calcineurin subunit B,CnB)佐剂对含PreS1+S融合抗原的乙型肝炎病毒新型疫苗(HBSS1)免疫效果的影响.采用Al(OH)3、常规剂量(5μg)CnB及CnB+Al(OH)3等佐剂与HBV颗粒疫苗配伍初次免疫,重组腺病毒载体疫苗加强免疫的策略,在C57BL/6小鼠模型上研究不同佐剂对HBV颗粒疫苗肌肉注射后免疫应答的影响,主要包括抗体滴度、抗体亚型分类及特异性细胞免疫(γ-IFN ELISpot检测).研究结果显示Al(OH)3佐剂存在明显免疫增强作用,而单独加入5μg CnB佐剂或CnB与Al(OH)3佐剂联合应用对Anti-PreS1抗体无明显的增强作用,但可显著降低anti-HBs抗体水平;各免疫组在重组腺病毒载体疫苗加强后,其抗体亚类包括IgG1、IgG2a和IgG2b;并可诱导高水平的细胞免疫应答反应.因而常规剂量(5μg)CnB单独或联合Al(OH)3佐剂对新型HBV疫苗无明显的免疫增强作用.
作者：揣侠；陈红；王文；邓瑶；阮力；谭文杰 刊期： 2014年第05期
为分离并鉴定中国大陆输入性B3基因型麻疹病毒.使用淋巴信号激活因子转染的非洲绿猴肾细胞(Vero/Slam细胞)对该麻疹病例的咽拭子标本进行病毒分离,经逆转录聚合酶链反应(Reverse transcript polymerase chain reaction,RT-PCR)方法扩增出核蛋白(Nucleoprotein,N)羧基(COOH)端核苷酸片段,并进行序列测定和分析.结果表明这两株B3基因型麻疹病毒分离株和世界卫生组织(World Health Organization,WHO)B3基因型参考株MVi/Ibadan.NGA/97在基因亲缘性关系树上同属一个分支,核苷酸同源性均为98％;与麻疹核苷酸序列数据管理系统(Measles nucleotide surveillance,MeaNS)中的病毒序列进行比对,结果表明本研究分离的两株麻疹病毒与2013年同期在澳大利亚、日本、韩国,中国香港地区,菲律宾、伊朗等国家流行的B3基因型麻疹病毒亲缘性关系为100％.在中国上海分离到的麻疹毒株为B3基因型.是中国自1993年开展病毒学监测以来首次分离到B3基因型病毒,为国外输入性的麻疹病毒.本研究中分离到的B3基因型麻疹病毒对于积累中国麻疹分子流行病学基线数据具有很重要的意义,也有助于全国及全球麻疹病毒的传播及溯源.
作者：王淑蕾；李崇山；王慧玲；唐伟；宋金华；杨玉颖；王世文；张燕；许文波 刊期： 2014年第05期
鉴于国内尚无明确的西尼罗病毒(West nile virus,WNV)感染病例报道,通过建立入境人员血清样品盘来评价自行研制西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA检测试剂盒.选择来自WNV感染区的入境人员血清286份,通过美国食品药物管理局(Food and drug administration,FDA)认证的FOCUS公司的West Nile Virus IgG Dxselect试剂盒以及Panbio公司的Dengue IgG Capture ELISA试剂盒筛选出评价用血清样品盘,平行比较评估自行研制的WNV IgG检测试剂盒结果,进一步对试剂盒的特异性,重复性和稳定性进行评价研究.结果显示,自行研制的试剂盒阳性检出率为35.6％,FOCUS West Nile Virus IgG Dxselect检测试剂盒则为32.5％,两者之间无统计学差异(x2 =3.05,P=0.078＞0.05),并具有良好的一致性(Kappa=0.837 2);其中两者的阳性检出符合率为91.18％,阴性符合率为95.34％,总符合率为92.66％.研制的间接ELISA方法诊断试剂盒具有良好的特异性,稳定性和敏感性,检测效果与境外权威认证的商品化试剂盒基本一致,为我国防控西尼罗病毒等外来传染病人境提供技术储备,也为尚未传人的传染病免疫试剂盒评价方法提供了参考依据.
作者：王玉春；邵强；张丽萍；甄维；吴学敏；马雪征；赵勇；胡孔新 刊期： 2014年第05期
丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)是一种危害人类健康的病原体,感染人体后极易导致慢性肝炎,并能引起肝纤维化或脂肪肝,可能进一步发展成为肝硬化、肝癌等终末期肝病.尽管已被发现20多年,丙肝病毒的来源以及进化途径一直没有确定.与此同时,缺乏合适的动物模型严重阻碍HCV致病机理的研究.从2011年起,随着新型测序技术的应用,多种丙肝非灵长类同源病毒相继被发现,这些研究成果将在研究丙肝病毒来源、进化途径以及相关动物模型建立中起重要作用.
作者：殷佩齐；张磊亮 刊期： 2014年第05期
研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法主要有酵母双杂交、噬菌体展示、免疫共沉淀、谷光苷肽巯基转移酶沉淀、细胞内共定位、亲和印迹、病毒铺覆蛋白结合技术、表面等离子共振、荧光共振能量转移等技术.检测蛋白质-核酸相互作用的方法主要包括酵母单杂交、染色质免疫沉淀、电泳迁移率实验、DNA-蛋白质印迹、报告基因、免疫共沉淀、谷光苷肽巯基转移酶沉淀、噬菌体展示等技术.在我们实验室对人肠道病毒A71型(EV-A71)的研究中经常会用到这些方法,但在该研究领域尚未有中文综述发表,因此本文对EV-A71研究中这些方法的应用进行了综述,该综述对蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸在其他病毒研究中的应用同样具有重要启示.
作者：张志晓；郑颖；胡挺松；李琦涵；范泉水 刊期： 2014年第05期
小RNA病毒科病毒包括数目众多的小RNA病毒,其中很多小RNA病毒是人畜重要的病原体.不同种属的小RNA病毒的3C蛋白酶具有典型的G-X-C-G基序和Cys-His-Asp/Glu催化中心;小RNA病毒3Cpro完成P1区VP2～VP3、VP3～VP1;P2区的2A～2B、2B～2C以及整个P3区成熟剪切;小RNA病毒多聚前体蛋白3Cpro成熟剪切分析显示,3Cpro作用底物具有明显的Q-G/S/A/V/H/R和E-S/G/R/M喜好性及种属特异性;固有免疫应答重要配体分子TRIF、MAVS、IRF3、IRF7和NEMO的3Cpro酶切位点预测显示,不同配体分子具有数目各异的可能酶切位点,其中TRIF和NEMO的3Cpro可能作用位点具有多样性.上述问题的探究,为基于小RNA病毒3Cpro的广谱抗病毒药物研制和小RNA病毒免疫逃逸机制提供资料.
作者：王宏；谢广成；段招军 刊期： 2014年第05期
