邵明；孙刚；安会春；赵吉成；李呼伦；毕郑钢
背景:人羊膜含胶原、糖蛋白、蛋白多糖和整合素等多种成分,它表达多种生长因子mRNA及其相关蛋白,有利于细胞的生长繁殖,能负载猪骨髓间充质干细胞与角朊细胞良好生长.目的:拟验证人羊膜负载骨髓间充质干细胞与角朊细胞对放创性全厚皮肤缺损创面胶原合成的影响.设计、时间及地点:同体对比观察.实验于2007-06/12在解放军第二军医大学顶防医学院全军复合伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成.材料:贵州小香猪8只,3～6月龄;雌雄不限,体质量7～16 kg.方法:贵州小香猪8只,每只背部脊柱两侧均有放创性全层皮肤缺损圆形创面(Φ3.67 cm)各3个,共48个创面.将经处理的人羊膜分别负载自体骨髓骨髓间充质干细胞和角朊细胞,移植到其左侧24个创面作为实验组(人羊膜负载两种细胞移植组);右侧前16个创面用单纯无种植细胞的人羊膜敷盖;后8个创面用单纯油纱布敷盖.单纯人羊膜处理组和油纱布敷盖组作为对照组.主要观察指标:用图像分析法测算7～21 d各组创面活检组织胶原含量.结果:移植15～21 d,3组创面胶原均增加,以人羊膜负载两种细胞移植组创面胶原沉积明显,与单纯人羊膜处理组和油纱布敷盖组创面相比,差异均有显著性意义(P<0.01).结论:人羊膜负载自体骨髓间充质干细胞和角朊细胞植入可明显促进放创性全厚皮肤缺损创面愈合过程中胶原的合成.
作者：侯爱莲；闫国和；粟永萍；方海立 刊期： 2009年第01期
背景:骨髓间充质干细胞存在取材困难、供体有限,可能病毒污染等缺陷,限制了其临床应用,而目前已证实间充质干细胞不仅存在于骨髓,还存在于外周血,尤其是脐血.目的:探讨人脐血间充质干细胞的体外分离、扩增纯化方法及其神经分化潜能.设计、时间及地点:应用研究,体外细胞学观察,于2005-10/2007-10在南方医科大学神经生物学教研室完成.材料:新鲜脐血来自南方医科大学南方医院足月剖宫产新生儿脐带,取脐血前征得新生儿监护人的知情同意.方法:无菌条件下收集脐血,去除红细胞,采用低糖DMEM/F12进行培养:取扩增第3或4代的人脐血间危质干细胞,培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和全反式维甲酸.主要观察指标:用流式细胞仪检测贴壁细胞的表面标志;用免疫组化法检测诱导后细胞神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白表达.结果:人脐血间充质干细胞强表达CD13、CD29、CD44和CD105,弱表达CD106,不表达CD34、CD11a、CD14、CD33和CD45.培养基添加神经营养因了诱导后的细胞呈现典型的神经元样表型,诱导后高表达巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白.结论:人脐血富含间充质干细胞,分离培养后于培养基添加神经营养因子能够分化为神经元样细胞.
作者：李晓文；田映红 刊期： 2009年第01期
背景:体外扩增脐血造血细胞对增加脐血造血细胞数量及植入能力至关重要,合适的细胞因子组合介导的体外扩增不仅能使造血细胞数鼙增加,而且能够上调和归巢有关的黏附分子和趋化因子受体4的表达.目的:实验拟观察白细胞介素3和白细胞介素6在人脐血单个核细胞体外扩增中的作用及对扩增后黏附分子和趋化因子受体4表达的影响.设计、时间及地点:随机区组开放性实验,于2007-03/12在广西壮族自治区人民医院及广州医学院附属广州市第一人民医院血液实验室完成.材料:10份足月顺产健康新生儿脐血标本.方法:将自新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7d,根据不同细胞因子组合实验分组为:对照组(无细胞因了组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子组(A组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素6组(B组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素3(C组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+自细胞介素6组+白细胞介素3(D组).主要观察指标:在0,7 d检测有核细胞数,CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数和集落形成单位数.结果:与对照组相比,A,B,C,D组均可有效的扩增脐血造血细胞(P<0.05),C,D两组扩增效果均优于A,B组,差异显著(P<0.05),但A,B两组之间无明显区别(P>0.05),D组能有效的扩增脐血细胞,并优于C组(P<0.05).A,B,C,D组细胞因子组合均可提高脐血CD34+细胞上CD49d,CD62L和趋化因子受体4的表达, A,B两组之间差异不显著(P>0.05),但均优于C组(P<0.05),D组CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+和CD34+CD49d+的细胞数扩增倍数优于A,B,C组(P<0.05).结论:白细胞介素6组+白细胞介素3可协同扩增脐血细胞,并能促进和归巢有关的CD49d,CD62L及趋化因子受体4表达.
作者：许力；毛平 刊期： 2009年第01期
背景:树突状细胞在过敏性紫癜发病机制中可能具有重要的地位.已有报道黄芪在体内可以纠正过敏性紫癜患儿的Th1/Th2失衡,但目前关于黄芪在树突状细胞水平对过敏性紫癜病免疫功能调节的影响尚不清楚.目的:观察过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞功能变化及黄芪对其的影响.设计、时间及地点:病例对照分析,于2005-10/2007-12在青岛大学医学院附属医院儿科研究所完成.材料:急性期过敏性紫癜患儿外周静脉血28份作为过敏性紫癜组,以门诊体检的健康同龄儿童外周静脉血18份作为正常对照组.黄芪水提剂由四川百利药业有限公司提供.方法:采用密度梯度离心法获取过敏性紫癜患儿及健康儿童外周血单个核细胞,获取的外周血单个核细胞体外经重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4、重组人肿瘤坏死因子α以诱生树突状细胞,并培养8 d,其中过敏性紫癜组又分成2组:对照组和黄芪干预组.主要观察指标:ELISA法检测过敏性紫癜患儿及健康儿童血浆γ-干扰素和白细胞介素4水平及培养上清液中白细胞介素10,12,18水平,流式细胞仪检测树突状细胞表面CD83、CD86(B7-2)和CD80(B7-1)的表达率.结果:过敏性紫癜患儿急性期外周血中Th1型细胞因子γ-干扰素水平减少,Th2型细胞因子白细胞介素4水平增加,γ-干扰素/白细胞介素4比值明显降低.过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞经诱导培养的树突状细胞表面CD86表达率较正常对照组明显升高,且两组CD86表达率与血浆白细胞介素4水平皆呈显著正相关,与γ-干扰素,白细胞介素4比值皆呈显著负相关;CD80表达率明显低于正常对照组,且两组CD80表达率与血浆γ-干扰素水平及γ-干扰素/白细胞介素4比值均呈显著正相关.过敏性紫癜患儿树突状细胞分泌白细胞介素12水平低于正常对照组(P<0.05),而白细胞介素10,18水平均高于正常对照组(P<0.05),两组树突状细胞分泌白细胞介素12水平与血浆γ-干扰素水平皆呈显著正相关(P<0.01),与γ-干扰素/白细胞介素4比值皆呈正相关(P<0.01,P<0.05);白细胞介素10分泌水平与其血浆白细胞介素4水平皆呈显著正相关(P均<0.01),与γ-干扰素/白细胞介素比值皆呈负相关(P<0.01,P<0.05):白细胞介素18分泌水平与其血浆白细胞介素4水平皆呈显著正相关(P均<0.01),与γ-干扰素/白细胞介素4比值皆呈负相关(P<0.01,P<0.05).黄芪干预组树突状细胞表面CD83、CD86和CD80的表达率与对照组差异不显著,树突状细胞分泌白细胞介素12水平高于对照组(P<0.01),白细胞介素10,18水平均低于对照组(P<0.05,P<0.01).结论:①过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞存在明显功能紊乱,表现为CD86表达率升高、CD80降低,白细胞介素12分泌减少、白细胞介素10和白细胞介素18增加,上述变化与Th1/Th2失衡关系密切.②黄芪主要是通过改变过敏性紫癜患儿树突状细胞分泌细胞因子的水平来调节其功能.
作者：陈永兴；张秋业；王娟；卫海燕；董增义；张迎辉 刊期： 2009年第01期
背景:周围微环境能够调节胚胎干细胞在体外的诱导分化情况,可能与多种信号通路及细胞因子作用有关.目的:观察局部微环境对体外培养的小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞定向诱导分化的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-10/2006-04在上海第二医科大学发育生物学研究中心实验室完成.材料:清洁级孕13.5 d的C57BL/6昆明鼠6只,由中科院上海实验动物中心提供.携带LacZ标记基因的小鼠胚胎干细胞株S8由上海市发育生物学研究中心提供.方法:取孕鼠胚胎,采用组织块消化法制备小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理得到滋养层细胞.将携带LacZ标记基因的小鼠胚胎干细胞株S8解冻复苏,加入含白血病抑制因子的高糖DMEM培养基体外扩增培养,将细胞克隆吹打成单细胞悬液,加到滋养层细胞上,在37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养.胚胎干细胞传代后,再加入含全反式维甲酸的高糖DMEM培养基,以单纯加入高糖DMEM培养基作为空白对照,调整细胞浓度为3×108L-1,吹打法悬浮培养48 h,收集悬浮液,反复离心去上清,移入铺有明胶的培养皿中,培养9 d.主要观察指标:诱导前后细胞形态及生长状态变化,RT-PCR检测诱导后细胞向神经前体细胞的分化情况.结果:胚胎干细胞在含有白血病抑制因子的高糖DMEM培养基中能够保持未分化状态,克降生长良好:换用含全反式维甲酸的高糖DMEM培养基悬浮培养后,4.0～5.0 h聚集成团,形成圆球状的类胚体.加入全反式维甲酸的诱导组内胚层细胞呈多边形且数量较多,对照组内胚层细胞呈长梭形且数量少.诱导后细胞表达神经干细胞特异性标志巢蛋白,神经细胞特异性标志微管相关蛋白2呈弱表达,不表达神经胶质细胞特异性标志胶质纤维酸性蛋白.结论:体外培养的小鼠胚胎干细胞可保持末分化状态,具有不断增殖的能力,经白血病抑制因子与全反式维甲酸两步诱导后可分化为神经前体细胞.
作者：杨建华；唐华羽；李长德；王裕 刊期： 2009年第01期
目的:检测人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞移植后,心肌梗死大鼠心肌组织胰岛素样生长因子Ⅰ含量的变化,以及心肌细胞细胞核分裂抑制因子p16INK4a和细胞核增殖抗原蛋白的表达.方法:人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞、未转染的正常鼠骨骼肌成肌细胞均由实验室前期制备.健康雄性SD大鼠90只,取12只作为假手术组,剩余大鼠结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,结扎后24 h存活36只,随机分为对照组和实验组,18只/组.造模后24 h,实验组在动物后肢局部分多点注射总量为0.1 mL的人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞悬液,(2～4)×1010L-1细胞;对照组和假手术组给予等量示转染的正常鼠骨骼肌成肌细胞悬液.应用ELISA法检测血浆和心肌组织胰岛素样生长因子Ⅰ的表达,免疫组化染色检测心肌细胞细胞核分裂抑制因子p16、细胞核增殖抗原蛋白的表达.结果:①细胞移植后1,2,4周,假手术组血浆和心肌组织内鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的表达无明显变化(P>0.05);与假手术组比较,实验组和对照组血浆中鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的质量浓度均显著降低(P<0.01),心肌组织中鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的含量均明显升高,于第2周达峰值(P<0.01),且实验组较对照组升高更为显著(P<0.01).②细胞移植后1,2,4周,假手术组和对照组大鼠血浆和心肌组织内均未检测到人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达;实验组于第1周即表达人胰岛素样生长因子Ⅰ,含量显著高丁其余两组(P<0.01).③细胞移植后1周对照组p16INK4a阳性细胞达峰值,显著高于其余2组(P<0.01),然后迅速降低;第2,4周实验组p16INK4a阳性细胞率与假手术组基本相似(P>0.05).④细胞移植后第1周,实验组细胞核增殖抗原阳性细胞达峰值,显著高于其余2组(P<0.01),随时间延长明显减少;第2周对照组与假手术组细胞核增殖抗原阳性率基本相似(P>0.05),而实验组仍显著高于假手术组,并持续到第4周(P<0.01).结论:人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞植入心肌梗死大鼠体内1周后.能有效合成和分泌胰岛素样生长因子Ⅰ,明显抑制心肌梗死早期心肌细胞p16INK4a表达,同时还可以促进细胞核增殖抗原表达,在局部持续1个月发挥促进细胞增殖的作用.
作者：高焱章；卢永昕；刘晓明；米少华；苏冠华；荣书玲 刊期： 2009年第01期
背景:巨细胞病毒活动性感染,尤其是巨细胞病毒肺炎死亡率极高,并易合并细菌、真菌、原虫等感染,直接影响患者的长期存活.因此,寻找一种早期、敏感的巨细胞病毒检测方法显得特别重要.目的:探讨酶联免疫吸附法、免疫组织化学法及流式细胞仪检测在自体外周血造血干细胞移植后巨细胞病毒感染的早期诊断价值.设计、时间及地点:对比观察,病例来自2002/2005南方医科大学南方医院.对象:选择行自体外周血CD34+细胞移植的系统性红斑狼疮(16例)和天疱疮(3例)患者19例,其中男5例,女14例,年龄11～38岁.所有受试者均无糖尿病、哮喘、荨麻疹、湿疹、炎症性肠病和其他风湿病.方法:分别于移植前、移植后3,6,12,24个月进行外周血采集.主要观察指标:应用酶联免疫吸附法、免疫组织化学法及流式细胞仪检测19例接受自体外周血造血干细胞移植患者移植前、移植后3,6,12,24个月时的抗巨细胞病毒抗体及巨细胞病毒抗原.结果:19例患者均进入结果分析.血清学检测显示,全部标本抗巨细胞病毒IgG全部阳性,阳性率100%.抗巨细胞病毒IgM阳性3例,阳性率3.2%.免疫组织化学法检测巨细胞病毒抗原阳性14例,阳性率14.7%.流式细胞仪检测巨细胞病毒抗原阳性13例,阳性率13.7%.4种检测巨细胞病毒感染方法的阳性率存在显著差异(x2=261.929,P<0.01).结论:自体外周血造血干细胞移植后存在不同程度的巨细胞病毒感染,临床上开展流式细胞仪检测巨细胞病毒感染具有重要意义.
作者：孙乐栋；孙竞；曾抗；孟凡义；周再高；刘启发；贺凤姣；徐丹；彭学标 刊期： 2009年第01期
背景:骨髓基质干细胞移植对损伤脊髓有一定修复作用,较神经干细胞移植更为理想,但疗效并不稳定,可能与其移植微环境有关.目的:拟建立体外神经细胞微环境作用下骨髓基质干细胞的分化模型,观察其分化过程中蛋白表达的差异.设计、时间及地点:蛋白水平的观察对照实验.于2005-07/2007-05在哈尔滨医科大学基础医学院神经生物实验室完成.材料:Wistar成年大鼠及新生胎鼠.方法:取新生Wistar胎鼠脊髓,以培养神经细胞.从成年Wistar大鼠骨髓中分离骨髓基质干细胞进行体外培养和增殖,应用红色荧光蛋白PKH26标记骨髓基质干细胞.骨髓基质干细胞、神经细胞单独培养组分别将骨髓基质干细胞、神经细胞单独培养,共培养组、分层联合培养组分别将标记的骨髓基质干细胞与神经细胞在体外共培养及在双层培养皿中联合培养.主要观察指标:培养7 d后收集细胞分别进行神经特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光检测.应用SELDI-TOF-MS技术筛选骨髓基质干细胞向神经细胞分化过程中变化明显的相关蛋白进行分析.结果:骨髓基质干细胞与神经细胞共培养和双层联合培养7 d后,骨髓基质干细胞呈类似神经细胞形态.免疫荧光检测结果示,共培养组骨髓基质干细胞的神经特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白阳性率明显高于分层联合培养组(P<0.05),分层联合培养组明显高于单独培养对照组(P<0.05).骨髓基质干细胞在向神经细胞转化过程中有5种蛋白表达发生明显变化:在分层联合培养组TIP39_RAT和CALC_RAT表达增加,为原表达量的5.344和2.805倍:INSL6_RAT,PNOC_RAT和PCSK1_RAT表达下降,为原表达量的0.380,0.499和0.437倍.结论:在体外神经细胞微环境作用下,骨髓基质干细胞与神经细胞在共培养和双层联合培养时均能诱导分化成神经细胞,接触培养比非接触培养分化率高.骨髓基质干细胞在向神经细胞转化过程中与5种蛋白TIP39_RAT,CALC_RAT,INSL6_RAT,PNOC_RAT和PCSK1_RAT密切相关.
作者：邵明；孙刚；安会春；赵吉成；李呼伦；毕郑钢 刊期： 2009年第01期
背景:近年来的研究发现,结合组织工程技术利用经诱导转化的骨髓基质干细胞能成功地在动物体内再生出骨组织,并在大型哺乳动物负重骨缺损的修复实验中取得了较好的修复效果.目的:观察富血小板血浆诱导培养人骨髓基质干细胞在体内的成骨特性,探讨采用富血小板血浆诱导培养的人骨髓基质干细胞与珊瑚羟基磷灰石材料体内异位成骨的可行性.设计、时间及地点:配对样本观察,于2007-10/2008-04在中山大学组织工程实验室完成.材料:4周龄BALB/C裸鼠14只,体质量22～24 g,麻醉后将裸鼠两侧股部切开,于股部肌间隙内制成肌袋模型.方法:14只裸鼠左侧肌袋内植入珊瑚羟基磷灰石复合富血小板血诱导培养的人骨髓基质干细胞,作为实验组;右侧背部肌袋内植入单纯珊瑚羟基磷灰石材料为对照组.主要观察指标:分别于植入后4,8,12周对比观察两组裸鼠活动及进食情况;X射线平片观察阻射率;苏木精-伊红染色观察骨形成情况.结果:14只裸鼠均进入结果分析.①植入材料后裸鼠活动及进食均正常,伤口愈合良好.材料随植入时间的延长无明显吸收,而材料周围的肌肉组织等软组织由外向内逐渐长入材料孔隙内有所增多.②随时间延长两组X射线平片阻射影像密度逐步增加.植入材料后4,8,12周实验组与对照组相比,差异有非常显著性意义(P<0.01).③植入材料后4周,实验组可见珊瑚羟基磷灰石表面有细胞生长,孔隙内有结缔组织长入;对照组仪见珊瑚羟基磷灰石表面有细胞生长.8周时珊瑚羟基磷灰石表面有新生骨形成,孔隙内和孔隙边缘可见骨样组织沉积和少量软骨样组织形成;对照组仅见少量纤维结缔组织长入.12周时珊瑚羟基磷灰石材料表面有较多成熟编织骨形成,部分区域可见髓腔样结构形成,并有血管长入;对照组仍未见新骨及骨样组织形成.结论:富血小板血浆诱导培养人骨髓基质干细胞与珊瑚羟基磷灰石材料在裸鼠体内能够良好的成骨,随时间的延长,成骨特性越明显;体内采用肌袋包裹的方法能有效增加血运及促进组织工程骨血管化生成,促进成骨.
作者：张洪涛；刘康；蔡道章；曾毅军；蔡荣辉；陈尔东；何志勇；余新平；安宁；王金军 刊期： 2009年第01期
背景:在众多的骨生长因子中,骨形态发生蛋白2具有著促进骨缺损修复和骨折愈合的效果.骨修复是一个阶段性过程,不需要转染的目的基因长久表达,因此利用腺病毒载体将目的基因导入脂肪间充质干细胞来促进骨愈合比较理想.目的:观察腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后大鼠脂肪间充质干细胞的分化情况.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-01/10在北京大学第三医院中心实验室完成.材料:清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,由北京大学实验动物学部提供.腺病毒载体Ad-BMP2、Ad-GFP由靳小兵博士构建扩增.方法:胶原酶消化法分离培养大鼠脂肪间充质干细胞,传至第3代分为Ad-BMP2转染组、Ad-GFP转染组和未转染组.各转染组分别向培养液中加入对应的腺病毒液,转染复数MOI=100.主要观察指标:转染后脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶活性,von Kossa染色结果,Western blotting法检测骨桥蛋白和骨形态发生蛋白2的表达.结果:与未转染组比较,转染后7,14,21d Ad-GFP转染组细胞碱性磷酸酶活性无明显变化;Ad-BMP2转染组细胞碱性磷酸酶活性明增高(P<0.01),且随时间延长碱性磷酸酶活性增加更为显著.Ad-BMP2转染组von Kossa染色出现黑色钙结节,免疫细胞化学染色结果示胞浆内有大量黄染颗粒,骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2均呈明显强阳性表达.Westernblotting检测结果显示Ad-BMP2转染组脂肪间充质干细胞骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2表达水平增高,Ad-GFP转染组中未检测到骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2的表达.结论:大鼠脂肪间充质干细胞经腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后,可定向分化为成骨细胞.
作者：邓敏；张楠；唐璐；鞠晓东 刊期： 2009年第01期
背景:国外一些研究表明细菌纤维素作为组织工程支架材料在组织工程方面有很大的应用潜力,但国内在这方面的报道非常少.目的:以大鼠脂肪干细胞作为组织工程种子细胞,考察其与细菌纤维素复合培养的效果.设计、时间及地点:观察性实验,于2007-0912008-08在吉林大学约学院生物工程实验中心和吉林大学第一医院耳鼻咽喉-头颈外科研究所完成.材料:细菌纤维素膜由天津科技大学天津市工业微生物重点实验室制备,材料的平均孔径为0.6-2.8μm,孔隙率为90%.方法:取3周龄Wistar大鼠腹股沟部脂肪垫,以Ⅱ型胶原酶消化获得大鼠脂肪干细胞,采用含有体积分数为0.1新生牛血清的DMEM培养液进行培养.将处十对数生长期的细胞,以3.0×108L-1的密度种植于细菌纤维素膜上,采用含有体积分数为0.1新生牛血清的DMEM培养液继续培养,分别于培养的不同时间取细胞-材料复合物,冰冻切片.采用免疫荧光染色方法对生长于细菌纤维素膜上脂肪干细胞的生物学特征进行测定.主要观察指标:①体外培养大鼠脂肪干细胞形态.②苏木精-伊红染色观察脂肪干细胞在细菌纤维素膜上的生长情况.③免疫荧光染色标记蛋白-CD29在复合物上脂肪干细胞中的表达.结果:体外原代培养72 h的脂肪干细胞以长梭形为主,7 d后梭形细胞逐渐增多融合,细胞对数生长期为第3～9天.细胞-支架复合物在培养第10天经苏木精-伊红染色后可见细胞呈单层生长于细菌纤维素膜表面,细胞与细菌纤维素膜接触紧密,未见深入细菌纤维素膜内部生长的细胞.免疫荧光技术分析结果表明,标记蛋白-CD29在细菌纤维素膜上的脂肪干细胞有特异性表达.结论:生长于细菌纤维素膜上的脂肪干细胞不仅能够增殖,而且仍然保持着干细胞的生物学活性.
作者：郑敬彤；石毅；贾原媛；王宗良；陈彦彦；周余来；王苹 刊期： 2009年第01期
背景:目前研究认为在胚胎发育后的多种组织中存在一类干细胞群体,可分化为不同胚层的组织细胞;但又不同于胚胎干细胞,随着妊娠期间胚胎的发育胚胎干细胞会逐渐失去部分分化潜能,会出现一些特殊表型或分子标记,如CD105,称其为胚胎后亚全能干细胞.目的:根据胚胎后亚全能干细胞表达CD105的特性分离胎儿骨髓源性胚胎后亚全能干细胞,经体内外诱导使其分化为肝细胞样细胞并检测其功能.设计、时间及地点:动物随机分组,细胞分子生物学实验,于2003-03/2005-03在天津市第三中心医院卫生部人工细胞工程技术研究中心完成.材料:取22周龄左右胎儿股骨和胫骨骨髓分离出胚胎后亚全能干细胞.以雌性成年SCID鼠作为干细胞移植的受体.CD105免疫磁珠为德国Miltenyi Biotec产品.鼠抗人白蛋白抗体为美国Sigma产品.碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子为英国PEPROTECH产品.方法:利用密度梯度离心结合免疫磁珠方法分离胎儿骨髓CD105(+)胚胎后亚全能干细胞,体外培养,用含30 μg/L肝细胞生长因20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的诱导培养基将其向肝细胞样细胞诱导分化.将24只SCID鼠随机分为干细胞治疗组和对照组,每组12只,均按800 mg/kg的剂量向腹腔内注射D-氨基半乳糖制备肝损伤模型.造模次日,干细胞移植组鼠在肝原位输注106左右CD105(+)细胞,对照组分别输注106左右的CD105(-)细胞或同等体积的培养液.主要观察指标:于干细胞移植后2,7d,1,3个月对肝脏组织行免疫组化检测人源白蛋白表达.结果:免疫磁珠筛选后的细胞免疫细胞化学检测CD105呈弱阳性表达:细胞在对数生长期的倍增时间为30 h左右:约传10代后进入衰退期.SCID鼠移植胚胎后亚全能干细胞3个月后在小鼠肝脏中可见有点状或小灶状的人白蛋白表达,对照组未见表达.结论:来源于胎儿骨髓的胚胎后亚全能干细胞可以在肝脏微环境下转化为肝细胞样细胞.
作者：朱争艳；张金卷；李涛；杜智 刊期： 2009年第01期
背景:自杀基因独有的旁观者效应,可显著提供肿瘤细胞杀伤效果,同时还与放射治疗、免疫摹因治疗联合应用,并克服了基因转导效率低的缺陷.胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)即可产生强大的旁观者效应.目的:观察脂质体介导真核表达载体CD基因转染鼠骨髓间充质干细胞的效果及其基因表达.设计、时间及地点:细胞学基因水平实验,于2007-05/12在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成.材料:SPF级C57BL纯系小鼠6只,由大连医科大学实验动物中心提供.连接产物转化感受态大肠杆菌DH5 α由大连理工大学干细胞与组织工程研发中心提供.LipofectamineTM 2000脂质体为Invitrogen产品.方法:取连接产物转化感受态大肠杆菌DH5 α,提取质粒DNA,对质粒pIRES2-AcGFP1-CD进行Xhol和BamHI双酶切,用于转染.取小鼠双侧下肢股骨和胫骨,贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代制成单细胞恳液,加入荧光标记的CD44,CD45,CD90,CD105抗体后,采用Lipofectamine 2000介导法转染第3代骨髓间充质干细胞.主要观察指标:重组质粒的鉴定,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记表达,细胞转染后CD基因的表达.结果:质粒pIRES2-AcGFP1-CD酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,于1.0～1.5 kb处有一条带出现,符合CD基因长度.细胞表面标记CD45呈阴性,CD44,CD90,CD105呈阳性.pIRES2-AcGFP1-CD基因转染36 h后,荧光倒置相差显微镜下可见小鼠骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白的表达,48 h后细胞仍有荧光表达,且强度明显增强.结论:脂质体介导的CD基因在鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,于转染48 h后达峰值.
作者：吴陈欢；王鸿飞；宋飞 刊期： 2009年第01期
背景:目前对人脐带间充质干细胞的研究主要集中干细胞生物学特性与组织分化等领域的研究,对细胞代谢途径调控的报道还很少.目的:考察了不同起始浓度的葡萄糖对人脐带间充质干细胞生长和代谢特征的影响.设计、时间及地点:对比观察实验,于2008-02/06在北京工业大学生命科学与生物工程学院病毒与药理研究室完成.材料:采集产妇遗弃健康足月分娩胎儿脐带4份.方法:①从人脐带组织Wharton's Jelly中成功分离出人脐带间充质干细胞,采用流式细胞仪对分离培养的第3代人脐带间充质干细胞免疫分型进行分析.②将细胞以2.5×107L-1.接种于24孔板中,在含有不同起始葡萄糖浓度(0.31,2.78,6.12,21.58 mmol/L)、体积分数为0.10 FBS的DMEM培养基中培养,每隔24 h取样计数.③将细胞以2.5×108L-1的密度接种于25 cm2方瓶中培养96 h后,收集不同葡萄糖浓度作用后的细胞,采用流式细胞仪进行细胞周期分析.④将细胞以2.5×108L-1密度接种于含有不同起始葡萄糖浓度DMEM培养基75 cm2方瓶中,培养96 h后,离心收集上清和细胞,分别用干细胞代谢物检测与酶活性分析.主要观察指标:①人脐带间充质干细胞细胞形态和表面抗原表达.②细胞生长情况.③细胞周期检测.④细胞胞内外营养物、代谢副产物及酶活性的测定分析.结果:①采用流式细胞仪对人脐带间充质干细胞进检测,阳性表达的有CD13,CD29,CD44,CD105,CD147,CD90,CD71,表达率均高于90%,而造血干细胞特有标记CD34,CD45及白细胞抗原HLA-DR、CD38呈阴性表达.②葡萄糖能促进人脐带间充质干细胞的生长,但当培养基中缺失葡萄糖时,细胞也可维持生长,在120 h细胞达到高密度11.6×107L-1.⑨细胞群体在G0/G1期的分布比例显著高于S期和G2/M期,随着葡萄糖浓度的增加,细胞群体处于G0/G1期的比例逐渐降低,S期相应增加.④当葡萄糖浓度为21.58 mmol/L时,己糖激酶与丙刚酸激酶活性分别比缺失葡萄糖时增加了39.7%和64.3%,而谷氨酰胺、丝氨酸、亮氨酸等氨基酸的比消耗速率却随着葡萄糖浓度的增加而显著降低.结论:当培养基中缺失葡萄糖时,细胞可利用氨基酸等营养物维持生长;随着葡萄糖浓度的增加,细胞周期分布和葡萄糖代谢途径关键酶活发生改变,从而影响了人脐带间充质干细胞的生长与代谢特征.
作者：张芳；盛望；王小利；李泽琳 刊期： 2009年第01期
背景:目前常用的嗅鞘细胞培养方法有差速贴壁法、化学抑制法、抗体亲和吸附法、补体法等,各自均存在优缺点,单一使用某种方法时细胞纯化率较低.目的:拟采用改良Nash差速贴壁+阿糖胞苷法体外分离纯化大鼠嗅球及嗅黏膜来源的嗅鞘细胞.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察.于2007-11/2008-05在武汉大学人民医院骨科实验室和消化内科实验室完成.材料:10周龄Sprague-Dauley大鼠10只,由武汉大学人民医院实验动物中心提供,阿糖胞苷由武汉大学人民医院制备.方法:完整取大鼠双侧嗅球及剪取鼻中隔后1/3嗅黏膜,剪碎后胰酶消化,制成单细胞悬液,按1×109L-1密度接种于末包被的25 cm2玻璃培养瓶中,18～20 h后将细胞悬液转移至另一未包被的25 cm2玻璃培养瓶中(第1次差速贴壁),24 h后再将细胞悬液转移至经多聚右旋赖氨酸包被的25 cm2塑料培养瓶或经多聚右旋赖氨酸包被的6孔培养板中(第2次差速贴壁),接种培养48 h后半量换液以去除杂细胞.在差速贴壁培养后二三天,加入3.0～5.0 pmol/L阿糖胞苷去除残余成纤维细胞.主要观察指标:嗅鞘细胞的形态观察、分裂增殖情况、免疫荧光染色鉴定结果及纯度测定.结果:体外培养24 h嗅球源性嗅鞘细胞即可贴壁,而嗅黏膜源性嗅鞘细胞多在培养四五天后贴壁,两种来源的嗅鞘细胞形态相似,以双极或梭形细胞为主,少量为3极及多突起形多级细胞,同时夹杂扁平、煎鸡蛋形细胞.纯化培养10 d的嗅鞘细胞,胶质纤维酸性蛋白、神经生长因子受体p75免疫荧光染色及神经生长因子受体p75+hoechs免疫荧光双染后大部分双极或多极细胞膜、胞体、突起呈阳性,细胞纯度可达90%以上.结论:改良Nash差速贴壁+阿糖胞苷法可在体外成功分离培养出高纯度的嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞,嗅球源性嗅鞘细胞贴壁时间及分裂增殖程度优于嗅黏膜源性嗅鞘细胞.
作者：彭昊；万昌涛；尹东；明江华 刊期： 2009年第01期
背景:PDX1是决定胰岛β细胞功能的关键因子,应用穿膜蛋白TAT将PDX1蛋白导入细胞内,若能发挥诱导分化作用将使干细胞治疗糖尿病向临床应用更进一步.目的:观察TAT-PDX1融合蛋白诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛B细胞分化的能力.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-05/2008-03在郧阳医学院附属太和医院湖北省胚胎干细胞研究重点实验室完成.材料:流产胎儿来源于肝功能正常、HBsAg(-)的健康产妇,TAT-PDX1融合蛋白由美国佛罗里达大学医学院唐东启博上惠赠.方法:采用贴壁法体外分离培养人胎肝间充质干细胞,传至第3代加入20 mol/L TAT-PDX1融合蛋白诱导,分别于第4,6,8,10天向诱导细胞中加入含葡萄糖的DMEM/F12培养基.主要观察指标:诱导后细胞形态变化及双硫腙染色结果,RT-PCR检测胰岛β细胞特异基因的表达,放射免疫法测定胰岛素累积分泌量.结果:人胎肝间充质干细胞易于体外分离和扩增,加入TAT-PDX1融合蛋白诱导后细胞由梭形逐渐变圆,并形成胰岛样细胞团,双硫腙染色呈棕红色.诱导第4,6,8,10天细胞序贯表达胰岛β细胞特异基因,NeuroD基因先出现,随后消失,Nkx2.2,Pax4,Nkx6.1,ISL-1基因随后依次出现.诱导后胰岛素累积分泌量逐渐增加,葡萄糖刺激后2～4周细胞胰岛素基础分泌量和刺激后胰岛素分泌量均显著增加,且可以维持在较高水平.结论:TAT-PDX1融合蛋白能诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β细胞分化.
作者：姜铧；张洹；李东升；梁清乐 刊期： 2009年第01期
背景:研究发现,脐血间质干细胞对辐射损伤有一定的防护作用.目的:实验拟观察脐血间质干细胞静脉输注对照射小鼠脾脏细胞生物学效应的影响,验证其防辐射损伤作用.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-04/10在广东医学院实验动物中心完成.材料:将体质量(20.0±1.5)g的雌性昆明种小鼠随机分为正常对照组、单纯照射对照组、60Coγ射线照射前静脉注射脐血间质干细胞组,每组30只.新鲜脐带血来源十本院妇产科健康产妇.方法:以无菌塑料采血袋按密闭式方法采集足月新生儿脐带血80～140 mL,无菌条件下将脐带血液采集到含有ACD-B保养液的无菌采血袋内,并按照卫生部检测血液的标准检测每一份脐带血液,采集、分离间质干细胞.60Co γ射线照射小鼠,通过尾静脉将分离获得的人脐血间质干细胞输注入小鼠体内,细胞数≥1×108份,照射后当天再次输注人脐血间质干细胞.主要观察指标:应用流式细胞仪检测脾脏细胞的凋亡指数和免疫参数.结果:与单纯照射组相比,60Co γ射线照射前静脉注射脐血间质干细胞组的G0/G1期细胞比例F降,而S、G2M期细胞比例均有不同程度的升高.经照射后,小鼠脾细胞的凋亡率明显增加,脐血间质干细胞对细胞的凋亡有一定保护作用,同时能够提高细胞的增殖率.单纯照射组的NK细胞、CD4+和CD8+标记率明显低于正常对照组,而脐血间质干细胞能显著地提高它们的活性.结论:脐血间质干细胞静脉输注对辐射造成的脾细胞损伤有一定保护作用,可促进脾脏细胞的分裂增殖,加速脾脏细胞的修复.其作用机制可能与提高NK细胞活性和CD4+、CD8+数量有关.
作者：罗利民；布林 刊期： 2009年第01期
背景:间充质干细胞的免疫抑制作用近年来逐渐得到证实并开始应用丁临床,但相关研究成果主要来源于体外细胞实验.目的:观察同种异基因大鼠骨髓间充质干细胞从静脉输入后对体内CD4+CD25+调节性干细胞的影响.-设计、时间及地点:以动物为对象的对照观察实验,于2008-03/09在南方医科大学珠江医院移植免疫研究所完成.材料:Wistar大鼠6只用于制备骨髓间充质干细胞,SD大鼠20只作为输注骨髓间充质干细胞的受体鼠.方法:从Wistar大鼠骨髓分离培养间充质干细胞,取第3～5代细胞进行实验.①体外淋巴细胞增殖实验:首先将间充质干细胞悬液从尾静脉注入SD大鼠体内10 d后脱臼处死,取大鼠脾脏制备脾淋巴细胞.实验分5组:分别为脾淋巴细胞/骨髓间充质干细胞为1:10,1:50,1:100+ConA 5 μg组,脾淋巴细胞+ConA 5μg组(增殖组),单纯淋巴细胞组(空白组),检测共培养体系中CD4+CD25+/CD4+T淋巴细胞比率.②体内注射骨髓间充质干细胞实验:将5×109L-1,5×108 L-1,5×107L-1间充质干细胞及PBS静脉输入SD大鼠体内,10 d后取受体鼠胸腺、脾脏、外周血检测CD4+CD25+/CD4+T淋巴细胞比率.主要观察指标:①淋巴细胞增殖体系中CD4+CD25+CD4+比率的变化.②SD大鼠胸腺、脾脏、外周血CD4+CD25+/CD4+比率的变化.结果:①体外淋巴细胞共培养体系中,1:10组T细胞亚群CD4+CD25+/CD4+细胞百分率较增殖组显著升高(P<0.01).②体内输注间充质干细胞达5×109L-1的受体鼠外周血和脾脏CD4+CD25+/CD4+T细胞比率上升,与输注PBS组相比有显著差异(P<0.05),而在胸腺中各组比率无明显差异.结论:岛浓度同种异基因大鼠间充质干细胞不仪可以在体外实验中增加CD4+CD25+/CD4+T细胞比率,静脉输入后仍具有相同作用.
作者：余劲明；蔡德鸿；张桦；袁小澎；陈宏 刊期： 2009年第01期
背景:如何为脱髓鞘疾病的细胞替代治疗提供丰富的少突胶质细胞来源是急需解决的问题.目的:实验拟采用表皮生长因子及碱性成纤维细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞方向分化,撤退细胞因子后,用甲状腺激素诱导神经干细胞向少突胶质细胞分化.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-08/12在泸州医学院神经生物学研究室完成.材料:普通级SD大鼠5只用于骨髓间充质干细胞的培养.方法:采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞,传至第4代,用含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、N2辅助因子、甲状腺激素T3的DMEM/F12诱导液诱导向神经干细胞分化.诱导后4 d,更换成含胎牛血清、甲状腺激素T3的DMEM/F12分化液,诱导向少突胶质细胞分化.主要观察指标:骨髓间充质干细胞生长情况和形态变化,采用SABC法进行免疫细胞化学检测神经细胞特异性标志的表达.结果:原代细胞接种3 d后多数贴壁,传代后细胞贴壁速度加快,增殖能力更强.诱导液处理第4天,圆形细胞聚集成簇.换成分化液后,细胞伸出树枝状细长突起,交织成网,形成少突胶质细胞样细胞.骨髓源性细胞簇表达巢蛋白阳性,示神经干细胞;从细胞簇分化的细胞,多数细胞表达半乳糖脑苷脂,部分细胞表达髓鞘碱性蛋白,示少突胶质细胞,少数细胞表达微管相关蛋白2阳性,示神经元.结论:甲状腺激素在体外可诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化.
作者：杜杰；高小青；吴岩；邓莉；杨朝鲜 刊期： 2009年第01期
背景:对周围神经损伤的治疗,目前希望能提高损伤局部的脑源性神经营养因子浓度来促进神经的修复再生.目的:观察坐骨神经损伤大鼠体内植入脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞后神经纤维的再通及运动功能的恢复情况.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-05/2008-05在福建省神经病学研究所完成.材料:无菌条件下取2月龄F344雄性大鼠股骨、胫骨制备骨髓间充质干细胞.利用构建好的慢病毒载体PNL-BDNF-IRES2-EGFP制备脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间质干细胞.方法:将60只成年SD大鼠经钳夹制作成右坐骨神经损伤模型,随机分为磷酸盐缓冲液组,骨髓间质干细胞组,脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞组.在损伤处分别注射磷酸盐缓冲液2 μ L,骨髓间质干细胞混悬液2 μ L和脑源性神绛营养因子基因修饰骨髓间质干细胞混悬液2 μL.主要观察指标:在术后2,4周,通过辣根过氧化物酶示踪观察损伤侧L4,5脊髓前角存活的神经细胞数目,通过测量坐骨神经功能指数值观察大鼠损伤侧肢体运动功能恢复情况,同时应用荧光激发及免疫组化技术检测骨髓间质干细胞存活和脑源性神经营养因子表达情况.结果:脑源性神终营养因子基因修饰骨髓间质干细胞组损伤侧L4,5脊髓前角细胞的存活数目多于磷酸盐缓冲液组和骨髓间质干细胞组,并且神经功能恢复也比其他两组好.骨髓间质干细胞组和脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞组可观察到神经损伤处有较多的骨髓间质干细胞存活,并且脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞组脑源性神经营养因子表达明显比骨髓间质干细胞组多.结论:脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞对周围神经损伤后神经纤维的再通及功能恢复有促进作用.
作者：郑明辉；张志坚；黄东煜；陈东平 刊期： 2009年第01期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
