李春莉；王建伟；姜蓉；王亚平；柯大智
背景:颅神经嵴干细胞可以作为颌面部各种组织和器官分化研究的重要细胞来源,如何使其获得永生化具有重要意义.人类细胞自发永生化的频率非常低,而一些永生化的基因可以显著增加这种频率.目的:观察人端粒酶催化亚基基因在大鼠颅神经嵴干细胞永生化过程中的作用.设计、时间及地点:观察性实验,于2007-09/2008-06在解放军第四军医大学完成.材料:选择清洁级孕8.5 d SD大鼠3只,6周,体质量180 g:先天性细胞免疫缺陷动物雄性Balb/c裸小鼠,体质量18～21 g,均由解放军第四军医大学实验动物中心提供.质粒PCIneo-hTERT由解放军第四军医大学口腔医院牙体牙髓科提供.方法:原代培养大鼠颅神经嵴干细胞后,将含有人端粒酶催化亚基基因的质粒PCIneo-hTERT转入大鼠颅神经嵴干细胞.经G418筛选后扩增,并连续培养.采用免疫细胞化学法观察转染细胞内人端粒酶催化亚基基因和颅神经嵴干细胞的特异标志物P75的表达,检测细胞的端粒酶活性,绘制细胞生长曲线观察其增殖能力,并通过裸鼠移植实验了解转染细胞的特性.主要观察指标:细胞克隆、特异性蛋白P75表达、端粒酶活性、增殖能力及致瘤性实验结果.结果:①质粒PCIneo-hTERT转染细胞后24 h,有少量细胞死亡.加G418后48 h,细胞逐步开始大量死亡.12 d后出现抗性细胞克隆,共有3个细胞克隆生长良好.分别命名为克隆1、2、3.克隆1和克隆2经过20～25代的传代后,细胞发生衰老、死亡;而克隆3在体外长期培养条件下生长状态良好,稳定表达人端粒酶催化亚基和P75.经转染后颅神经嵴干细胞的端粒酶活性明显升高,且能持续表达.②人端粒酶催化亚基基因转染后,3个细胞克隆在初期的增殖能力较强,随后克隆1、2的增殖速度逐渐变慢,出现死亡,克隆3越过衰老期,且无致瘤性.结论:人端粒酶催化亚基基因转染大鼠颅神经嵴干细胞后,细胞得以永生化,其表型稳定,可作为颅颌面部细胞分化和组织工程研究的种子细胞.
作者：吕红兵；王捍国；吴甘茶；闫福华 刊期： 2009年第23期
背景:由于心肌细胞自身增殖能力有限,急性心肌梗死后细胞移植是目前流行的再生心肌方法.骨髓间充质干细胞的存活受心肌微环境的影响,而内皮祖细胞参与血管新生,可为骨髓间充质干细胞提供微环境. 目的:探讨骨髓间充质干细胞联合中药丹酚酸B预处理的内皮祖细胞共移植后,对急性心肌梗死大鼠心功能改善及骨髓间充质干细胞分化早期基因表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-01/2008-03在天津中医药大学完成.材料:清洁级雄性Wistar大鼠45只,由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供.丹酚酸B为天津天士力现代中药资源有限公司产品,批号 20060601.方法:分别取2只和1只大鼠,采用密度梯度离心法+贴壁筛选法分离培养纯化内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞.剩余42只大鼠随机分为4组:假手术组9只、模型组11只、骨髓间充质干细胞组12只、共移植组10只.假手术组只开胸穿线,不结扎左冠状动脉;其余3组结扎左冠状动脉建立心肌梗死模型.结扎冠状动脉15 min后再次开胸,共移植组吸取骨髓间充质干细胞悬液250 μL(浓度1×1010L-1)+8mg/L丹酚酸B预处理的内皮祖细胞悬液250 μL(浓度1×108L-1),于结扎区附近心肌组织分5点注射:骨髓间充质干细胞组同法注射单纯骨髓间充质干细胞悬液500μL,模型组注射等量细胞培养液.主要观察指标:采用超声心动仪测定左室功能,Real-time PCR检测心肌分化基因Nkx2.5,GATA-4的表达.结果:细胞移植4周后与模型组比较,骨髓间充质干细胞组左室结构有改善趋势,但差异无显著性意义(P>0.05);共移植组左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、舒张末期室间隔厚度、收缩末期室间隔厚度均明显改善(P＜0.05),心室收缩功能指标射血分数、心输出量均明显改善(P<0.05).细胞移植4周后与模型组比较,骨髓间充质干细胞组、共移植组Nkx2.5及GATA-4 mRNA表达均明显增加,且共移植组Nkx2.5 mRNA增加幅度明显大于骨髓间充质干细胞组(P<0.05).结论:骨髓间充质干细胞联合丹酚酸B预处理的内皮祖细胞共移植方式,可上调骨髓间充质干细胞向心肌分化过程中Nkx2.5,GATA-4基因的表达,改善急性心肌梗死大鼠心室结构,增强心功能.
作者：李庆雯；南亚昀；谭俊珍；范英昌 刊期： 2009年第23期
背景:三七总皂甙对骨髓基质细胞向神经样细胞分化的效应及相关信号通路目前尚不明确.目的:探讨细胞外信号调节蛋白激酶1/2信号通路对三七总皂甙调节大鼠骨髓基质细胞向神经细胞增殖、分化的作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-05/10在汕头大学医学院分子生物学实验室完成.材料:4～6周龄雄性SD大鼠9只,由汕头大学医学院实验动物中心提供.三七总皂甙为广西梧州制药集团股份有限公司产品,细胞外信号调节蛋白激酶的抑制剂PD98059为Cell Signaling Tech公司产品.方法:全骨髓法体外分离纯化大鼠骨髓基质细胞,取传至第3代细胞进行诱导分化,设立3组:单纯诱导组向培养液中加入10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,预诱导24 h后全量换为正式诱导液(含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2%DMSO、200 μ mol/L丁羟回醚的α-MEM培养基),每24 h半量换诱导液1次;三七总皂甙组向预诱导液和正式诱导液内加入终浓度100 mg/L三七总皂甙:PD98059组在三七总皂甙组培养液基础上加入10 μ mol/L PD98059.主要观察指标:细胞形态学观察,MTT法检测细胞增殖情况,免疫组织化学方法鉴定细胞Nestin的表达.结果:诱导6 h后,少数细胞呈锥形,细胞突起增多伸长,类似神经元,继续诱导培养后细胞突起增多,突起相瓦连接成网状.与单纯诱导组、PD98059组比较,诱导6,12,24 h三七总皂甙组细胞均明显增殖(P＜0.05),且随诱导时间延长呈递增趋势(P＜0.05):单纯诱导组、PD98059组间比较无明显差异(P＞0.05).与单纯诱导组比较,诱导24 h后三七总皂甙组Nestin阳性率明显升高(P＜0.05),PD98059组Nestin阳性率明显降低(P＜0.05).结论:三七总皂甙可以促进骨髓基质细胞的神经分化和分化后增殖,细胞外信号调节蛋白激酶1/2的特异性抑制剂PD98059能够拮抗三七总皂甙促增殖分化作用,提示细胞外信号调节蛋白激酶1/2信号通路是三七总皂甙促进骨髓基质细胞向神经细胞分化和增殖的重要环节.
作者：张震宇；曾艳；李学东；刘东宁 刊期： 2009年第23期
背景:已证实放射性神经干细胞损伤是放射性脑损伤的可能途径之一,而碱性成纤维细胞生长因子对放射性损伤具有保护作用,但其机制尚不清楚.目的:观察外源性碱性成纤维细胞生长因子对放射诱导C17.2神经干细胞凋亡的抑制作用.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2006-11/2008-06在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.材料:C17.2神经干细胞系为小鼠小脑祖细胞永生化后构建的神经干细胞系.方法:以直线加速器进行总量为8 Gy外照射C17.2神经干细胞建立离体放射性损伤模型,以1×107L-1的细胞浓度接种C17.2神经干细胞悬液至96孔板,每孔加细胞悬液200 μL,按0,25,50,100 μg/L(0 μg/L作对照)分别加入碱性成纤维细胞生长因子干预.主要观察指标:四甲基偶氮唑盐法检测细胞活性并拟合生存曲线,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:随碱性成纤维细胞生长因子浓度升高,C17.2神经干细胞增殖比明显增加(P＜0.01),呈现明显剂量-效应关系.碱性成纤维细胞生长因子浓度为100 μg/L时活性强,未显示细胞毒性.流式细胞仪检测结果显示:对照组细胞凋亡率高于25,50 μg/L碱性成纤维细胞生长因子组(P<0.01),25,50,100μg/L碱性成纤维细胞生长因子组组间相比,差异具有显著性意义(P<0.05～0.01).结论:外源性碱性成纤维细胞生长因子对放射诱导的C17.2神经干细胞凋亡具有明显抑制作用.
作者：周海红；刘运林；刘军；肖颂华；邢诒刚；赵斌 刊期： 2009年第23期
背景:目前细胞因子支持的脐血体外扩增是安全性较高、有可能运用于临床的方法之一.目的:比较白血病抑制因子、白细胞介素6及脂多糖对脐血干,祖细胞体外增殖的影响.设计、时间及地点:细胞学体外对照实验,于2003-08/2004-05在广东医学院附属医院中心实验室完成.材料:10例正常脐血标本取自广东医学院附属医院妇产科及湛江市妇幼保健院妇产科,白血病抑制因子为达科为试剂公司产品,白细胞介素6为晶美试剂公司产品,脂多糖由广东医学院附属医院李延平教授自制.方法:密度梯度法体外分离培养脐血单个核细胞,应用磁分选器和单克隆抗体免疫磁珠(阳性)分选法提取脐血CD34+细胞.建立液体培养体系,为含体积分数为40%的胎牛血请、20 g/L牛血清白蛋白、20 μg/L粒巨集落刺激因子、20 μg/L干细胞因子、20 μg/L白细胞介素3的RPMI 1640培养液.取2×108 L-1脐血CD34+细胞,加入配制的液体培养体系50 μL,设立8组:第1组仅加入RPMI 1640作为对照,第2～4组分别单独加入脂多糖、白血病抑制因子、白细胞介素6,第5～7组分别加入脂多糖、白血病抑制因子、白细胞介素6的两两混合液,第8组加入3种刺激因子的混合液,上述各组脂多糖、自血病抑制因子、白细胞介素6的终浓度分别为10 U/mL,10 μg/L,10 mg/L.主要观察指标:MTT法测定不同刺激因子在液体培养体系中对脐血CD34+细胞增殖的影响.结果:培养3d后与对照组比较,单用白血病抑制因子对脐血CD34+细胞具有促增殖作用(F=3.33,P＜0.01),单用脂多糖或白细胞介素6的效果均不显著(F=2.14,1.83.P＞0.05):刺激因子两两联用及3种刺激因子联用时,对脐血CD34+细胞均具有促增殖作用(F=3.54～4.06,P均<0.01),且3种刺激因子联用时的促增殖效果尤为显著.结论:在特定的液体培养体系中,单独使用白血病抑制因子可明显促进脐血干,祖细胞体外增殖,联合情况下白细胞介素6、脂多精与白血病抑制因子具有促增殖协同作用.
作者：张宇明；江黎明；李庆华；熊丹；杨志刚 刊期： 2009年第23期
背景:组织多普勒超声心动图被证明可以用来评价心脏的整体和局部功能,但用于评价骨髓基质细胞移植对阿霉素所致兔心肌病的连续观察研究较少.目的:利用组织多普勒超声心动图评价骨髓基质细胞直接注射治疗阿霉素所致心肌病心肌功能的变化.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2002-09/2003-12在华中科技大学同济医学院附属协和医院超声科实验室完成.材料:雄性成年日本大耳白兔28只,体质量(2.0±0.2)kg,利用阿霉素诱导其中20只制备扩张型心肌病模型.方法:造模成功后,20只白兔分为细胞移植组和PBS组,每组10只.8只生理盐水处理组作为假手术组.细胞移植组于实验开始第8周每只兔分别取其骨髓进行骨髓基质细胞培养.第12周进行细胞荧光标记后,于心外膜直接注射回各自兔的左室侧壁心肌处.PBS组于第12周注射相同剂量的PBS培养液作为对照.另外8只作为假手术组仅开胸,每次给予相同剂量生理盐水.主要观察指标:细胞移植前及移植后4周利用常规和组织多普勒超声心动图评价左室整体和局部功能;组织学和荧光检测观察心肌细胞形态变化.结果:①细胞移植组组织多普勒发现局部注射区组织速度增高,由[4.0±1.1)cm/s到(5.3±1.2)cm/s(P＜0.05),而整体功能未见明显改善.PBS组及假手术组整体和局部心肌功能均未见改善.②细胞移植后4周存活的细胞仍可见DAPI荧光标记.组织学检查发现注射区附近心肌损伤减轻.凋亡较少.结论:骨髓基质细胞治疗扩张型心肌病可以改善局部心肌功能,组织多普勒可以检测出局部心肌功能的改善,为细胞移植提供了一种有效的评价手段.
作者：费洪文；王新房；谢明星；周诚；何亚乐 刊期： 2009年第23期
背景:移植的骨髓间充质干细胞能向损伤病灶部位定向迁移,进而发挥治疗作用,但关于其向病灶定向迁移的具体机制还不十分清楚.目的:观察低氧对人骨髓间充质干细胞趋化因子受体CXCR4和CX3CR1表达的影响.设计、时间和地点:细胞学体外观察,于2008-02/2009-02在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室进行.材料:骨髓标本取自解放军第三军医大学附属新桥医院血液科收治的15～40岁正常或原发病未累及骨髓患者.方法:穿刺采集骨髓,密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化人骨髓间充质干细胞.取生长良好的第3代细胞接种于25 cm2培养瓶中,培养至70%～80%融合后,置于37℃、体积分数分别为3%O2、5%CO2、92%N2的饱和湿度孵育箱内培养48 h,以常氧培养作为对照.主要观察指标:相差显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面标记物,Real time荧光定量PCR法检测CXCR4和CX3CR1 mRNA的表达,免疫细胞化学和Western blot法检测CXCR4和CX3CR1蛋白的表达.结果:体外分离纯化的人骨髓间充质干细胞呈成纤维细胞样,培养12～14 d达90%汇合,呈极性排列,集落呈漩涡状;CD105和CD29阳性率分别为99.38%和99.13%,而CD14,CD45均呈阴性表达.在体积分数为3%的O2培养条件下,人骨髓间充质干细胞CXCR4和CXCR1 mRNA的表达分别是常规培养条件下的2.130倍和2.361倍,CXCR4和CX3CR1蛋白的表达分别是常规培养条件下的1.69倍和1.93倍,CXCR4和CX3CR1主要表达于人骨髓间充质干细胞的胞膜和胞浆.结论:体积分数为3%的O2低氧条件能够促进入骨髓间充质干细胞趋化因子受体CXCR4和CX3CR1mRNA及蛋白的表达,这可能是体内移植的骨髓间充质干细胞向损伤病灶定向迁移的机制之一.
作者：朱洁；周竹娟；龚自力；郑健 刊期： 2009年第23期
背景:为明确细胞移植后症状改善是否由移植所致,既往多采用侵袭性方法,但是这种方法不适用于动态追踪及人体研究.如果能够在合适示踪剂的帮助下,采用无创伤性影像学技术在活体识别、跟踪移植后细胞的存活状态,将显著提高细胞移植疗法的学术价值.目的:初步探讨菲立磁-多聚赖氨酸复合物体外磁性标记兔骨髓基质细胞的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/08在珠江医院神经外科实验室完成.材料:2月龄新西兰大白兔8只,由广州中医药大学实验动物中心提供.菲立磁为Advanced Magnetic公司产品,多聚赖氨酸为sigma公司产品.方法:无菌条件下穿刺抽取兔股骨骨髓,梯度密度离心法分离获取骨髓基质细胞,收集第2代细胞,加入含白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子及胎牛血清的神经干细胞培养摹诱导5 d.将50 mg/L菲立磁和1.5 mg/L多聚赖氨酸混合,振荡30 min后,将复合物加入到细胞培养基中进行标记,孵育细胞24 h.主要观察指标:骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化情况,细胞内铁的鉴定,菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记对细胞增殖或分化的影响.结果:骨髓基质细胞诱导后可见少量细胞的胞体变圆变大,突起缩短,随时间延长,圆形细胞逐渐增多,部分聚集成簇、成球,FITC荧光染色示巢蛋白呈阳性表达.普鲁士蓝染色结果显示99%以上骨髓基质细胞的胞质内出现细小的蓝色铁颗粒.在含菲立磁-多聚赖氨酸复合物的培养基中,骨髓摹质细胞可继续增殖和分化,但增殖分裂后细胞质内铁颗粒数量较增殖前有所减少,经鉴定部分为神经元特异性烯醇化酶阳性细胞.结论:菲立磁-多聚赖氨酸复合物可在体外高效标记骨髓基质细胞,且标记后细胞的活性、增殖和分化能力不受影响.
作者：何骁；李贵涛；唐晓军；金勋杰；罗狄鑫；齐勇 刊期： 2009年第23期
背景:黄芪可促进骨髓间充质干细胞向神经元方向分化,但对于诱导机制的报道较少,目前普遍认为诱导作用可能与其具有抗氧化功能有关.目的:观察黄芪注射液诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化早期进程中细胞内钙调蛋白mRNA转录水平的变化.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-10/12在河北北方学院实验中心完成.材料:清洁级6周龄雄性大鼠1只,购自中国医科院实验动物中心.黄芪注射液为大理药业有限公司产品,批号060105.方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代按4×105L-1密度按种于12孔板,加入含200 g/L黄芪注射液、体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基进行诱导分化,制备的细胞爬片行免疫细胞化学染色.传至第5代细胞平均分配到4个离心管内,1管为对照组,另外3管加入上述诱导培养基分别作用30,60,120 min,消化获取的细胞采用RT-PCR技术检测钙调蛋白mRNA的转录水平.主要观察指标:黄芪对骨髓间充质干细胞的诱导作用,诱导后钙调蛋白mRNA的转录水平.结果:黄芪诱导5 h后,可见少量细胞形态发生改变,胞体变圆,自胞体伸出细长突起,免疫细胞化学染色后可见巢蛋白阳性细胞和神经元特异性烯醇化酶阳性细胞,少量细胞呈微管相关蛋白2阳性,而神经胶质纤维酸性蛋白呈弱阳性.RT-PCR实验显示,在黄芪诱导骨髓间充质干细胞分化的早期,钙调蛋白基因进行了转录,随着诱导时间的延长,钙调蛋白mRNA的相对含量运渐增加,诱导30,60,120 min组与对照组钙调蛋白mRNA的相对含量比较差异有显著性意义(F=153.315,P=0.000).结论:黄芪诱导骨髓间充质干细胞向神经元方向分化初期细胞内钙调蛋白转录水平上调,提示其诱导作用可能与钙调蛋白介导的信号转导途径有关.
作者：王新生；李海峰；赵荧；赵铁军；张晓丽；薄爱华 刊期： 2009年第23期
背景:现有治疗手段不足以补充梗死心肌,研究表明干细胞移植有可能促使心肌和血管再生,改善心功能和预后.目的:观察急性心肌梗死区中心和周边移植胚胎干细胞后心肌组织形态学及血液动力学的变化.设计、时间及地点:随机对照动物观察,于2007-03/2008-10在中南大学湘雅医学院人体解剖学与神经生物学系神经生物学实验室完成.材料:SPF级Wistar大鼠40只,随机分为4组:正常对照组、梗死模型组、中心移植组、周边移植组,10只/组.胚胎干细胞-D3株(embryonic stem cells-D3,ES-D3)、布法罗大鼠肝细胞均由中国科学院上海细胞所提供.方法:ES-D3细胞复苏后,以(2.0～5.0)× 107L-1种植于培养瓶中,加入含布法罗大鼠肝细胞的条件培养基体外培养分化.除正常对照组外,余3组结扎冠状动脉左前降支建立急性心肌梗死模型.造模后1周接受细胞移植,ES-D3细胞于移植前1 d进行BrdU标记,以胚胎干细胞培养基调整密度至1×109L-1.中心移植组在梗死区选3个点,每点注入10 μL细胞悬液(含104个细胞)至心室壁内;周边移植组在梗死区周边选3个点同法注入等量细胞悬液.主要观察指标:免疫组化及血流动力学指标检测结果.结果:布法罗大鼠肝细胞条件培养基体外培养的ES-D3细胞,呈相对规则的巢状集落样生长,分化8d即可见部分拟胚体出现自发的节律性收缩活动,心肌肌钙蛋白T免疫染色呈阳性,电镜下可见肌管、肌纤维等肌性结构,证实已分化为心肌细胞.周边移植组BrdU免疫荧光染色呈阳性,而中心移植组呈阴性,进一步对BrdU免疫荧光染色阳性细胞行双抗染色,可见心肌肌钙蛋白T呈阳性表达.移植后4周与正常对照组比较,梗死模型组左室收缩、dp/dtmax均减小(P＜0.01),左室舒张末期压上升(P＜0.01),左室质量、左室质量指数均升高(P＜0.01).与梗死模型组比较,中心移植组各项血流动力学指标无明显变化(P＞0.05);周边移植组左室收缩压、±dp/dtmax均显著升高(P＜0.01),左室舒张末期压显著减小(P＜0.01),左室质量、左室质量指数,梗死面积均显著减小(P＜0.01).结论:急性心肌梗死后于梗死周边区移植胚胎干细胞可以阻止心室重构、减少瘢痕面积、改善心功能.
作者：蒙艳斌；贺莉萍；钱海燕；王歧本；邝满元；潘爱华 刊期： 2009年第23期
背景:近年来关于骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤修复方面的研究较多,但目前相关机制尚不清楚.目的:观察间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后脑源性神经营养因子表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2003-04/07在中国医科大学神经解剖学实验室完成.材料:选取鼠龄3个月的SD大鼠64只,雌雄不拘,体质量250～300 g,随机抽取4只大鼠用于骨髓间充质干细胞的分离与培养,其余60只用于制备脊髓横断损伤模型.方法:60只大鼠随机抽签法分为3组,细胞移植组(n=24):脊髓损伤后第7天,无菌条件下以微量注射缓慢注入含骨髓间充质干细胞(1×109L-1)的培养液5μL至脊髓损伤区;PBS组(n=24):注入等量(5μL)磷酸盐缓冲液体;空白对照组(n=12):注入生理盐水5μL.主要观察指标:分别于造模后7,14,28 d取材,观察骨髓间充质干细胞的形态变化;免疫组织化学法检测间充质干细胞移植后大鼠脊髓损伤区脑源性神经营养因子的表达.结果:60只SD大鼠均进入结果分析.10代以后细胞增殖能力有所减弱,胞体变得扁平,若加入碱性成纤维细胞生长因子,则可维持其增殖能力和形态.大鼠脑源性神经营养因子在正常大鼠脊髓组织中有一定表达,细胞移植后第7,14,28天,细胞移植组脑源性神经营养因子表达均高于PBS组和空白对照组(P＜0.05);空白对照组与PBS组脑源性神经营养因子表达无明显差异(P＞0.05).结论:骨髓间充质干细胞在移植后通过上调脑源性神经营养因子的表达从而促进轴突的再生,可能是治疗脊髓损伤的重要机制.
作者：陈晓春；牛庆飞；杨爽 刊期： 2009年第23期
背景:一系列研究发现,骨髓基质干细胞可在体外经人工诱导分化为神经元样细胞,有望用以移植治疗神经退行性疾病,但是其分化的分子机制尚不明了.目的:观察骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化前后基因表达谱的变化.设计、时间及地点:观察性实验,于2006-12/2007-12在苏州大学附属第二医院神经外科脑肿瘤研究室完成.材料;健康成年近交系Wistar大鼠,体质量约300 g.方法:体外培养和纯化大鼠骨髓基质干细胞,用碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对其进行诱导,分别于诱导前和诱导后第7天抽提RNA后利用Affymetrix基因芯片检测分析诱导前后差异基因表达谱,并有选择地对其中的一些重要基因进行实时定量PCR验证.主要观察指标:①骨髓基质干细胞的培养及诱导分化.②诱导分化后神经细胞的鉴定.③诱导分化前后基因芯片的检测.④基因芯片结果的分析.⑤实时定量PCR的验证.结果:骨髓基质干细胞经诱导后形态上呈神经元样细胞改变,免疫荧光证实β-TubulinIII染色后阳性率为(69.04±5.63)%.基因芯片共发现差异基因215条,其中上调基因125条,下调基因90条.明确与神经元发育密切相关的基因有13条,其中上调7条,下调6条.挑选重要的4条基因Bmp4、Robo2、Numb、Enc1进行实时定量PCR验证,其结果与基因芯片结果相符.结论:骨髓基质干细胞在体外诱导分化为神经元样细胞的相关基因表达谱中,有一些明确与神经元分化密切相关的基因存在差异表达,深入研究这些基因可能为基因工程改造骨髓基质干细胞奠定基础.
作者：张荣俊；贡志刚；闫西刚；兰青；黄强 刊期： 2009年第23期
背景:目前仍没有合适的标记方法追踪观察兔骨髓间充质干细胞组织修复及基因治疗的效果.目的:观察重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达,及转染后干细胞活性的变化,以寻找稳定标记兔骨髓间充质干细胞的方法. 设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/05在南京市第一医院骨科干细胞实验室完成. 材料:健康2月龄纯种新西兰大白兔4只,由南京医科大学实验动物基地提供.重组腺病毒Ad5/F35-EGFP为北京本元正阳基因有限公司产品. 方法:用密度梯度离心法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,贴肇法纯化扩增.取传至第4代细胞,流式细胞仪检测细胞标志的表达,消化离心重悬后进行计数,平均分成5组,每组细胞数5.0×105个,接种于25 m2培养瓶,空白组加入50 μL的PBS液,剩余4组加入重组腺病毒Ad5/F35-EGFP进行转染,感染复数(MOI)分别为10,20,50,100,继续传代培养.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的生长状态及表面标志鉴定,转染后骨髓间充质干细胞增强型绿色荧光蛋白的表达及活性变化.结果:原代培养48 h后见细胞贴壁,8 d时细胞铺满瓶底80%以上,绝大多数呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,三四天即可传代,第4代细胞CD29和CD44呈阳性表达,CD34与CD45呈阴性表达.转染后24 h可见绿色荧光,7 d时荧光强,细胞转染率与感染复数值的呈线性增长关系,至49 d时仍可见绿色荧光.转染后0,7,14,28,49 d,感染复数=50组的骨髓间充质干细胞数量均与空白组基本相似(P均>0.05),即转染后细胞增殖能力无明显变化. 结论:重组腺病毒载体能高效标记骨髓间充质干细胞,感染复数为50时较为理想,增强型绿色荧光蛋白基因可持续表达49 d,且标记后不影响骨髓间充质干细胞的增殖活性.
作者：张全彬；王黎明；徐燕 刊期： 2009年第23期
背景:目前人胚胎干细胞建系的技术路线主要有囊胚法、核移植法和胚胎单卵裂球法,但由于破坏胚胎,涉及诸多伦理问题.目的:探讨利用冷冻胚胎建立人类胚胎干细胞系的可行性.设计、时间及地点:细胞学体内外实验,于2005-01/2006-08在沈阳市妇婴医院生殖中心完成.材料:妊娠13.5 d的ICR鼠20只用于制备小鼠胚胎成纤维细胞饲养层,10周龄SICD鼠2只用于人胚胎干细胞体内分化实验.行IVF/ICSI助孕患者自愿捐献的冷冻胚胎,由沈阳市妇婴医院生殖中心提供.方法:复苏冷冻的胚胎,采用序贯培养法进行囊胚培养,用免疫外科方法去除滋养细胞,将得到的胚胎内细胞团接种于丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞上培养并传代.主要观察指标:取不同代次的培养细胞,分别进行生长特性、碱性磷酸酶染色、转录因子OCT-4、阶段特异性胚胎抗原SSEA-4、SSEA-1、肿瘤排斥抗原TRA-1-60、TAR-1-81、核型及体内分化全能性鉴定.结果:20个解冻卵裂期胚胎,获得9个囊胚,分离完整的内细胞团共7个,从7个内细胞团培养出2个人胚胎干细胞系,其中一个细胞系连续培养76代(20个月).所培养的细胞具有人胚胎干细胞的共同生物学特性,即细胞呈扁平或圆形,可见1～3个核仁;碱性磷酸酶以及SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-81,TRA-1-60,OCT-4均呈阳性表达,而SSEA-1呈阴性;核型正常,为46,XX核型;将细胞注射入SCID鼠皮下形成肿瘤,病理切片显示为成熟畸胎瘤;短串联重复分型结果显示所形成的畸胎瘤与人胚胎干细胞为相同的遗传背景.结论:实施体外受精-胚胎移植的夫妇怀孕后,多余的冷冻保存胚胎所分离培养的细胞具备人胚胎干细胞的所有特性,是建立人胚胎干细胞系很好的材料来源.
作者：谭季春；李扬；曲文玉；孙开来；刘丽英；蒋丽；郭帅帅 刊期： 2009年第23期
背景:针对帕金森病进行细胞移植治疗的研究进程中,除寻求合适的细胞系外,如何将各种有分化潜能的细胞诱导为含量丰富、有功能的多巴胺能神经元尤为关键.目的:观察不同浓度抗坏血酸对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-01/12在广西医科大学科学实验中心完成.材料:清洁级新生24 h内SD大鼠30只,由广西医科大学实验动物中心提供.抗坏血酸为Sigma产品.方法:取新生鼠脑组织,组织块胰蛋白酶消化法体外分离培养神经干细胞,传至第2代以5×108L-1密度接种.设立4组:空白对照组不给予抗坏血酸,仅加入含体积分数为10%的胎牛血清、2%B27的DMEM/F12培养基;剩余3组在此基础上分别加入50,100,200 μmol/L抗坏血酸进行诱导,10 d后终止诱导.主要观察指标:RT-PCR检测诱导后细胞酪氨酸羟化酶基因mRNA的表达,免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞,检测神经干细胞向多巴胺能神经元分化率.结果:各浓度抗坏血酸诱导组均得到795 bp的扩增片断,即均表达酪氨酸羟化酶mRNA.神经球具有自我更新和表达巢蛋白的能力,诱导分化后的细胞能表达神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞特异性抗原.与空白对照组比较,50,100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组酪氨酸羟化酶阳性细胞率均明显升高(P<0.05);且100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组升高幅度明显高于50 μ mol/L(P<0.05),100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组间比较无明显差异(P>0.05).结论:从新生鼠脑组织分离出的神经干细胞在体外具有自我更新、多向分化潜能及表达巢蛋白的能力.50～200 μ mol/L抗坏血酸均能促进神经干细胞向多巴胺能神经元分化,抗坏血酸浓度从100 μmol/L增加至200 μmol/L时酪氨酸羟化酶阳性细胞率无明显变化.
作者：沈岳飞；陈梅玲；罗彦妮；范瑞芳；莫雪安 刊期： 2009年第23期
背景:P21CIp/WAF1、P27Kip1是两种重要的细胞周期的负调控因子,增殖细胞核抗原是反映干细胞增殖的指标.目的:观察体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中P21Cip/WAF1,P27KIp1及增殖细胞核抗原的表达变化.设计、时间及地点:细胞学基因水平观察,于2006-12/2007-06在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心实验室完成.材料:骨髓来源于中山大学附属第二医院行骨髓穿刺的健康供者.方法:全骨髓贴壁筛选法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第5代后,加入含20 μg/L肝细胞生长因子、10 μg/L成纤维细胞生长因子4的opti-MEM I低血清培养基向肝细胞诱导分化.主要观察指标:诱导后RT-PCR检测细胞内P21Cip/WAF1,P27 KIp1及增殖细胞核抗原基因mRNA的表达.结果:骨髓间充质干细胞向肝细胞定向诱导后0,1,3,5,7 d,细胞内P21CIp/WAF1 mRNA表达的相对量逐渐升高(P＜0.01),P27Kip1 mRNA表达的相对量无明显差异(P＞0.05),增殖细胞核抗原mRNA表达的相对量除诱导后0,1 d无明显差异(P＞0.05)外,其余各时间点均逐渐降低(P＜0.01).结论:P21 CIp/WAF1高表达抑制了骨髓间充质干细胞增殖,同时在其向肝细胞分化过程中起一定调控作用,P27KIp1可能并不起作用,增殖细胞核抗原的表达则与P21Cip/WAF1相反,呈逐步减少趋势.
作者：汤志华；闵军；陈积圣；叶林；余杰雄 刊期： 2009年第23期
背景:已证实骨形态蛋白9是骨形态蛋白家族具潜力的促骨分化生长的因子之一,目前国内在成骨方面对骨形态蛋白9的报道非常少.目的:探讨腺病毒介导的人骨形态蛋白9基因转染兔脂肪干细胞的可行性,及其转染后的成骨作用.设计、时间及地点:细胞摹因学体外观察,于2007-08/2008-08在重庆医科大学附属儿童医院儿研所外科研究室完成.材料:新西兰大白兔5只,由重庆医科大学实验动物中心提供.携带人全长骨形态蛋白9基因的腺病毒载体由重庆医科大学附属儿童医院罗庆研究员构建并惠赠.方法:取兔颁后部脂肪组织,体外分离纯化脂肪干细胞.取生长良好的第3代细胞,以1×108 L-1密度接种于6孔板,转染组经感染复数为100的载有人骨形态蛋白9基因的腺病毒转染脂肪于细胞,并设立未转染对照组.主要观察指标:细胞形态及生长曲线变化,荧光显微镜及RT-PCR检测转染后人骨形态蛋白9基因mRNA的表达,碱性磷酸酶及钙茜索红染色测定转染后成骨活性.结果:转染1周后细胞汇合呈铺路石状,2周后形成钙化结节:未转染对照组细胞形态较前无明显变化,无明显的钙化结节形成.与未转染对照组比较,转染组细胞停滞期延长,数量轻度下降,倍增时间延长.脂肪干细胞转染骨形态蛋白9基因后12 h后即有荧光表达,转染3,6,9,12 d后人骨形态蛋白9 mRNA均呈阳性表达且逐渐增强,未转染对照组呈阴性.转染组碱性磷酸酶活性随转染时间的延长呈升高趋势,钙茜素红染色可见钙化结节;未转染对照组碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色均呈弱阳性表达.结论:携带人全长骨形态蛋白9基因的腺病毒可成功转染兔脂肪干细胞,转染后脂肪干细胞高表达骨形态蛋白9,且具有明显的成骨作用.
作者：张强；傅跃先；康权；甘立强；罗庆；刘燕 刊期： 2009年第23期
背景:目前研究认为表皮干细胞数量及增殖分化潜能的差异,可能是创面愈合能力随年龄增大而逐渐降低的重要原因之一.目的:探讨不同发育阶段人皮肤表皮干细胞β1整合素、角蛋白19、p63转录因子和端粒酶反转录酶的表达特征.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2005-09/2007-04在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成.材料:流产胎儿皮肤标本由南昌大学第一附属医院产科提供,4～12周岁少儿、25～45岁成人烧伤整形植皮手术剩余皮片标本由南昌大学第一附属医院烧伤科提供.方法:标本取材后立即用中性甲醛固定,常规石蜡包埋,4℃保存.所有标本经系列切片后,分别采用鼠抗人角蛋白19、β1整合素、p63转录因子、端粒酶反转录酶单克隆抗体作为一抗,以免疫组织化学EnVision法检测皮肤组织中表皮干细胞标志物的表达.主要观察指标:200倍光镜下观察免疫组化染色结果,测定表皮干细胞标志物阳性表达率.结果:胎儿皮肤、少儿皮肤和成人皮肤表皮的基底部、毛囊周围细胞β1整合素、角蛋白19、p63和端粒酶反转录酶均呈棕黄色阳性表达.胎儿表皮基底层细胞β1整合素、角蛋白19和p63均呈强阳性表达:少儿表皮基底层细胞中大部分表达β1整合素、角蛋白19和p63,阳性细胞均匀分布;成人表皮基底层细胞β1整合素、角蛋白19和p63呈弱阳性表达,阳性细胞散在分布;胎儿表皮基底层端粒酶反转录酶阳性细胞表达强度>少儿表皮>成人表皮.随年龄的增加,β1整合素、角蛋白19、p63和端粒酶反转录酶在胎儿、少儿、成人皮肤组织中的阳性表达率呈下降趋势(F=5.06,P＜0.01).结论:胎儿皮肤、少儿皮肤和成人皮肤表皮干细胞主要位于表皮基底层,端粒酶表达阳性区域及信号强度与表皮干细胞的定位分布及阳性表达强度相一致.提示表皮干细胞的数量、端粒酶活性表达的强弱可能与不同发育阶段皮肤组织的修复能力差异密切相关.
作者：黄培信；刘德伍；王肖蓉；毛远桂；陈剑平；蓝蔚 刊期： 2009年第23期
背景:目前对于移植后的骨髓间充质干细胞在肝组织中的分化途径以及能够在多大程度上修复损伤的肝细胞等问题,尚未达成统一共识.目的:观察经尾静脉移植的骨髓间充质干细胞在急性肝损伤大鼠肝组织中的定植分化情况.设计、时间及地点:细胞学体内对照观察,于2007-12/2008-06在兰州大学中心实验室地点完成.材料:清洁级6～8周龄雄性SD大鼠47只,取5只用于制各骨髓间充质干细胞,剩余42只随机分为3组:肝正常细胞移植组15只、肝损伤细胞移植组14只、肝损伤盐水对照组13只.方法:肝损伤细胞移植组、肝损伤盐水对照组大鼠通过腹腔注射D-氨基半乳糖建立急性肝损伤模型.造模后24 h,肝损伤细胞移植组、肝正常细胞移植组经尾静脉注入BrdU标记的第3代大鼠骨髓间充质干细胞悬液1 mL,含(1.5～2.0)×106个细胞:肝损伤盐水对照组大鼠同法注入等量生理盐水.主要观察指标:移植后肝功能恢复情况,肝脏免疫组织化学检测结果.结果:与造模后24 h比较,移植后2,3周肝正常细胞移植组、肝损伤盐水对照组血清谷丙转氨酶活性无明显变化(P>0.05);肝损伤细胞移植组血清谷丙转氨酶活性明显降低(P＜0.05),肝功能恢复较好.与肝正常细胞移植组比较,肝损伤细胞移植组Brdu+细胞数明显增多(P＜0.01),多分布在汇管区及中央静脉周围,但随着时间延长BrdU+细胞数逐渐减少.结论:经尾静脉移植的骨髓间充质干细胞可促进急性肝损伤大鼠的肝功能恢复,并能够在受损肝脏及正常肝脏中定植分化,且定植与分化的程度可能与肝脏损伤程度有关.
作者：何琼；朱陇东；陈红 刊期： 2009年第23期
冠状动脉粥样硬化性心脏病可引起心肌细胞的不可逆性改变,干细胞移植治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病能改善心脏功能,但其机制尚不完全清楚,可能与心肌再生、血管新生、心脏结构重建和干细胞旁分泌等作用相关联.文章针对干细胞移植技术、生物学特点、移植途径等进行综述,并具体分析了干细胞移植成功的判断,干细胞改善心脏功能的机制以及干细胞移植的安全性等问题.
作者：谢杰睿 刊期： 2009年第23期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
