朱宏丽；卢学春；范辉；辛宏；庄晓萌；姚善谦
目的:从能感染HCV的人肝癌细胞HepG2中克隆出人LDLR基因,构建其真核表达质粒,并在小鼠肝癌细胞Hepa1-6中进行表达.方法:从HepG2中提取总RNA,采取逆转录PCR(RT-PCR)方法得到人LDLR的cDNA.将获得的人LDLR基因克隆到真核表达载体pcDNA3中,进行酶切和序列鉴定.将重组质粒pcDNA3-hLDLR和空载体转入Hepa1-6,G418筛选,并用RT-PCR和FACS检测人LDLR基因转录和蛋白的表达.结果:人LDLR的cDNA已插入载体pcDNA3构建成真核表达质粒pcDNA3-hLDLR,双酶切和测序表明,克隆的人LDLR与已登录GenBank的序列存在核苷酸多态性,但编码的氨基酸序列完全一致,该序列的GenBank登录号为gi|21629647|gb|AY114155.1,并且真核表达质粒的构建正确.用脂质体介导的方法转入Hepa1-6后,用RT-PCR和FACS检测表明,细胞可表达人LDLR.结论:成功地构建了真核表达质粒pcDNA3-hLDLR,为进一步研究HCV和人LDLR的相互作用,以及建立可能的HCV细胞感染模型奠定了基础.
作者：吕丽萍；贾帅争；王海平；詹林盛；王全立 刊期： 2004年第03期
目的:研究不同浓度丙泊酚(异丙酚)对内毒素刺激小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α,IL-6,IL-8 mRNA表达的影响.方法:分离巯基乙酸盐诱导的小鼠腹腔巨噬细胞,随机分为7组.A组:阴性对照组;B组:阳性对照组,脂多糖(LPS)10 ng/ml孵育细胞;C组:单用丙泊酚组,500 μg/ml孵育细胞;D,E,F,G组:丙泊酚+LPS组,不同浓度丙泊酚(0.5,5,50,500 μg/ml)孵育2 h后加入LPS 10 ng/ml继续孵育1～4 h.用RT-PCR法检测巨噬细胞TNF-α,IL-6,IL-8 mRNA的水平.结果:在内毒素诱导下,腹腔巨噬细胞TNF-α,IL-6,IL-8 mRNA的水平均显著增高;丙泊酚对LPS刺激后TNF-α,IL-6 mRNA表达水平的增高有抑制作用,并呈浓度依赖性;但对LPS刺激下IL-8 mRNA表达水平增高的影响无统计学意义.结论:丙泊酚能在转录水平抑制内毒素刺激下小鼠腹腔巨噬细胞促炎性细胞因子的产生.
作者：武百山；刘占坡；王刚 刊期： 2004年第03期
目的:构建携带肝细胞生长因子(HGF)的逆转录病毒载体,并建立高效、稳定生产HGF的包装细胞株.方法:以pcDNA3.0-HGF质粒为模板进行PCR反应扩增出HGF基因全长序列,亚克隆至逆转录病毒载体pMSCVneo构建重组逆转录病毒质粒,以脂质体介导转染包装细胞PT67,经G418筛选,进而挑选抗性集落扩大培养后,用靶细胞NIH3T3测定病毒滴度,筛选出高效产毒细胞株.扩大培养后进行RT-PCR鉴定HGF mRNA的表达.扩大培养NIH3T3细胞抗性集落(NIH3T3/HGF),并用细胞培养上清进行人肝癌细胞系HepG2的扩散试验.结果:PCR反应扩增出2 200 bp的HGF基因,构建了重组逆转录病毒表达载体pMSCV-HGF,测序鉴定正确.经脂质体介导转染包装细胞、G418筛选和NIH3T3测定病毒滴度,筛选出具有高病毒滴度(8.8×107 cfu /ml)的细胞集落,扩大培养后建立高效表达HGF的包装细胞株PT/HGF,RT-PCR证实HGF基因在PT/HGF中有转录.NIH3T3/HGF培养上清可使HepG2细胞扩散,形态改变.结论:成功构建了携带HGF的逆转录病毒载体pMSCV-HGF,并建立了稳定、高效生产有活性的HGF的产毒细胞株PT/HGF.
作者：王韫芳；南雪；岳文；李艳华；闫舫；裴雪涛 刊期： 2004年第03期
基于基因组的疫苗研发途径被称为逆向疫苗学,它不仅省时、经济,而且可为传统方法难于或根本无法开展的疫苗研究提供新的解决方法.逆向疫苗学的研究过程始于硅片,用计算机预测疫苗的所有抗原,不依赖于抗原是否丰富,也不需要微生物是否能够体外培养.本文介绍逆向疫苗学的概况,特别是近年来在研制某些病原菌新疫苗方面的进展.
作者：张兆山 刊期： 2004年第03期
目的:研究SARS合并糖尿病死亡原因.方法:以我院2003年4～6月收治的SARS合并糖尿病的46例患者为研究对象,分为死亡组(A组)及治愈组(B组).比较两组的生化指标、血氧饱和度(SpO2)、胸片、多器官功能衰竭(MODS)、二重感染、激素用量、血常规以及CD3+,CD4+,CD8+T淋巴细胞计数等.结果:①A组丙氨酸转氨酶(ALT),尿素氮(BUN),血清肌酸激酶(CK),乳酸脱氢酶(LDH)显著高于B组(P＜0.01).②A组SpO2＜95%,合并MODS,二重感染及糖皮质激素日均用量≥160 mg/d的例数均明显多于B组(P＜0.05).③A组血小板,淋巴细胞,CD3+,CD4+,CD8+T淋巴细胞计数显著低于B组(P分别＜0.01,0.05,0.001).结论:SARS合并糖尿病患者的死亡原因与肺损害、低氧血症、MODS、二重感染及激素用量密切相关.
作者：马雅辉；王力 刊期： 2004年第03期
目的:表达具有中和活性的抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体.方法:用RT-PCR法克隆具有中和活性的抗基孔肯亚病毒鼠源单克隆抗体CHIK-IF1的轻重链可变区基因,克隆人IgG1恒定区基因组基因,构建了轻重链嵌合基因和表达质粒pCdhfr1L,pcDNA3.1H,共转染二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞,用ELISA检测培养上清中嵌合抗体的表达,MTX加压筛选表达量高的克隆,扩大培养收集上清并纯化,纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE、Western 印迹检测和抗原结合活性的检测.结果与结论:在CHO细胞中成功表达了抗基孔肯亚病毒的嵌合抗体,为制备抗基孔肯亚病的被动免疫制剂奠定了良好的基础.
作者：李建民；陈薇；安小平；樊英茹；郝晓萌；李冰；陈万荣；刘树玲；童贻刚 刊期： 2004年第03期
目的:构建新型高效真核表达载体,实现人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低分子量尿激酶(Iin-UK)在CHO细胞中的高表达.方法:利用常规分子生物学方法,通过对neo基因的表达进行不同程度的弱化,构建了一系列新型真核表达载体,以Iin-UK融合基因为目的基因,比较这些真核表达载体实现外源基因高表达的能力,然后挑选高表达的克隆,通过MTX加压扩增,以提高Iin-UK融合基因的拷贝数及表达水平.结果与讨论:构建了5种新型真核表达载体,并筛选出优化的真核表达载体,通过MTX加压扩增,实现了Iin-UK融合基因在CHO细胞中的高表达,表达量达到10 μg/(106细胞·24h ).
作者：刘志刚；林建波；张国强；安怀杰；徐桂清；俞炜源 刊期： 2004年第03期
尽管2003年上半年全球爆发的严重急性呼吸综合征(SARS)经世界卫生组织证实为一种SARS-冠状病毒(SARS-CorV)引起,但临床的一些证据表明还不能排除有其他微生物的作用.2003年3月,我们从北京第一例SARS患者A及其母亲的痰漱液和咽拭子标本中分别分离出BYD1和BLD1两株呼肠病毒(reovirus, ReoV)[1],随后又从患者A的父亲(死于SARS)的尸检脾组织样本中同时分离出SARS-CorV和ReoV.更有意义的是,在电镜下于同一个细胞中观察到这两种病毒,即ReoV和SARS-CorV,表明SARS-CorV和ReoV存在着共感染的可能[1] .由于ReoV与肺部感染密切相关,动物模型实验表明可引起动物病毒性肺炎和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)[2,3],我们也初步建立了ReoV BYD1株感染食蟹猴的实验动物模型[4].为观察从SARS患者标本中分离的ReoV 对豚鼠的致病性以及与SARS的关系,本研究分别以ReoV BYD1株、SARS-CorV BJF株单独感染豚鼠,以及两种病毒混合感染豚鼠,观察豚鼠的临床体征和相关器官组织的病理学变化,期望揭示新分离的ReoV致病机制及其在SARS中所起的作用.
作者：朱虹；何君；何诚；甘永华；黄如统；端青 刊期： 2004年第03期
目的:分析不同类型原代白血病细胞IL-6R基因及IL-6R蛋白的表达情况.方法:采用RT-PCR方法对取自29例白血病患者的原代白血病细胞和8例健康人外周血单个核细胞的IL-6R基因表达情况进行了分析,并应用原位杂交技术和免疫组织化学方法对细胞表面的IL-6受体蛋白进行了检测.结果:20例急性髓细胞白血病均明显表达IL-6R mRNA;9例急性淋巴细胞白血病中有2例为阳性,其余7例为阴性;8例正常人PBMC中6例阴性,2例有弱表达.免疫组化和原位杂交结果与RT-PCR实验结果相一致.结论:IL-6R可作为急性髓系白血病免疫治疗的候选靶位点.
作者：朱宏丽；卢学春；范辉；辛宏；庄晓萌；姚善谦 刊期： 2004年第03期
目的:分析多层螺旋CT(multislice spiral CT,MSCT) 对肺动脉栓塞的肺血管分布及肺内改变的诊断价值.方法:回顾分析12例肺动脉栓塞患者的增强MSCT图像.将受累肺动脉分为中央型、周围型、混合型;肺叶水平动脉内充盈缺损分为完全型、部分充缺,并观察对比相应区域肺内改变.结果:肺动脉栓塞周围型2例,混合型10例;受累肺叶动脉25支,9支完全充盈缺损,16支部分充缺.随就诊检查时间的延长,部分充缺的比例有所增大.12例中肺内出现实变3例,出现频率为25%,其中1例诊断为肺炎,胸腔积液4例.结论:MSCT可以明确诊断肺动脉栓塞,多平面重建有助于其确诊.肺动脉栓塞的肺内改变发生率不高且无特异性,要以观察到栓塞的肺血管分布区一致为依据,肺内阴影的定性应结合临床及追随观察.
作者：方捷；杨立；张爱莲；李功杰；任栓群 刊期： 2004年第03期
目的:选择并建立异种聚合血红蛋白抗原性检测方法,为评价异种聚合血红蛋白对人有无抗原性提供参考.方法:从速发型超敏反应、体液免疫反应、细胞免疫反应和抗原交叉反应检测聚合牛血红蛋白对异种动物的抗原性.结果:家兔及豚鼠未发生速发型超敏反应.多次免疫后,家兔血清中总IgG无明显变化,但特异性IgG水平显著升高.B淋巴细胞转化检测表明,B淋巴细胞增殖活性增强,但与对照组相比无显著差异(P＞0.05).聚合牛血红蛋白、人血红蛋白、兔血红蛋白抗原交叉反应结果显示,聚合牛血红蛋白与人血红蛋白存在抗原交叉反应,提示聚合牛血红蛋白与人血红蛋白在抗原结构上有同源性.结论:该聚合牛血红蛋白与人血红蛋白在抗原结构上有同源性,除用其免疫的实验组动物血清特异性抗体水平显著升高外,其他检测指标无显著变化.根据免疫学理论,无论某异物刺激机体产生何种免疫应答反应,都应视为该异物存在抗原性,因此提示该聚合血红蛋白存在抗原性.
作者：陈琳；张亚东；卜凤荣；章金刚 刊期： 2004年第03期
目的:建立一种适合较大量微生物代谢物抑制K562细胞生长的体外筛选方法,筛选对K562细胞具有抑制作用,而对正常细胞Vero无明显抑制作用的土壤放线菌提取物.方法:放线菌培养液加入乙醇后,置于96孔板中,经过减压除去溶剂后,用MTT法检测各样品对K562及Vero细胞的抑制作用.结果与结论:从446种土壤放线菌提取物中筛选获得5种提取物对K562细胞具有明显的抑制作用,而对Vero细胞生长抑制作用较弱.
作者：胡艳红；张庆林；曹菊荣；龚萍；肖凤君；毕建进；王晓娜；王正平；吴祖泽 刊期： 2004年第03期
RNA干扰是内源性或外源性双链RNA诱发的mRNA水平上的基因沉默机制,具有高度特异性.21 nt干扰性小RNA在哺乳动物细胞中可以诱导强有力的特异性RNAi作用,这一突破性研究进展开创了人类疾病治疗的新天地,RNAi技术用于人类疾病治疗已受到极大关注,尤其在AIDS、乙型肝炎和丙型肝炎等病毒感染性疾病和肿瘤治疗中的应用研究为活跃,并取得了令人鼓舞的成果.本文对siRNA的设计和制备的基本思路,及其在病毒性疾病和肿瘤治疗中的研究进展作一综述.
作者：李月敏；姜明红；钱其军；宋三泰 刊期： 2004年第03期
目的:构建表达肠毒素大肠杆菌(ETEC)定居因子CS6的重组质粒,并在大肠杆菌DH5α中高效表达.方法:利用基因工程的方法,将含有CS6基因的质粒pMG233用限制性内切酶ClaⅠ酶切,得到长约3.1 kb的CS6片段(含有CS6结构基因及调控基因的DNA片段);并与用限制性内切酶ClaⅠ酶切的表达载体质粒pBV321连接,得到含有CS6片段的重组质粒pMG235,转化至大肠杆菌DH5α.结果:SDS-PAGE、Western印迹及免疫荧光观察的结果表明,重组菌DH5α/pMG235可高效表达相对分子质量为14 600的CS6抗原蛋白,并在重组菌表面表达,表达产物可被抗CS6多克隆抗体识别.结论:重组菌可稳定表达肠毒素大肠杆菌定居因子抗原CS6.
作者：罗刚；杨晓；李淑琴；张兆山 刊期： 2004年第03期
目的:探索含有BRCT结构域的P53分子结合蛋白53BP1调控P53转录活性的机制.方法:通过PCR的方法获得缺失不同结构域的53BP1基因突变体53BP1Δ1,53BP1Δ2,53BP1Δ3与53BP1Δ4,并采用双荧光素酶报告基因系统分析了它们对P53蛋白转录活性的影响.结果与结论:野生型53BP1蛋白可以明显提高P53的转录活性,其C端的BRCT结构域与核定位信号的存在为必不可少,而N端与P202蛋白相互结合结构域的存在也可以促进P53的转录活性,提示53BP1蛋白不同功能结构域之间的协同作用是保证其行使正常生理功能的前提条件.
作者：单冉东；梅柱中；宋宜；董燕；孙国敬；刘斌；田宝磊；张应玖；孙志贤 刊期： 2004年第03期
目的:对工程菌DH5α(pMG604)的批次补料培养和连续补料培养工艺进行研究.方法:通过摇瓶试验筛选适合重组人干细胞因子工程菌DH5α(pMG604)生长和产物表达的基础培养基,在此基础上进行了分批补料批培养和连续补料批培养的研究.结果:30 L发酵罐分批补料批培养,菌密度为11.9(D600),rhSCF表达水平为42%.5 L发酵罐连续补料批培养,终菌密度为148(D600),rhSCF表达水平为31%.
作者：吴军；巩新；唱韶红；赵志虎；马清钧 刊期： 2004年第03期
自从1994年Zhang首次克隆出肥胖基因(obese gene,ob基因)之后,有关ob基因的研究已有很多报道.本文着重对ob基因的结构与生理功能,缺氧时ob基因的诱导性表达调控,低氧与肥胖的关系作一综述.
作者：杨应忠；范文红；范明；格日力 刊期： 2004年第03期
目的:建立简便、灵敏的测定血浆儿茶酚胺的方法.方法:利用离子对萃取法提取血浆中的儿茶酚胺,用高效液相色谱-电化学检测法(HPLC-ECD)进行检测,测定其回收率、线性范围、精密度及低检测限,并测定和比较了大鼠和小鼠血浆中儿茶酚胺浓度.结果:肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)的加样回收率分别为(103.2±4.9)%,(106.1±6.3)%和(101.1±9.0)%.日内和日间精密度分别小于14.4%和11.6%.该方法测定E和NE在0.5～16 ng范围内,DA在0.25～8 ng范围内含量与峰高比之间呈良好的线性关系,相关系数为0.9980～0.9999,低检测限分别为:E 0.25 ng,NE 0.30 ng,DA 0.20 ng.大鼠血浆中E浓度明显高于小鼠,NE和DA浓度无明显差异.结论:本法用于检测血浆中儿茶酚胺水平具有简便、灵敏、快速、准确的特点,适合于小动物血浆中儿茶酚胺浓度的测定.
作者：陆春苓；周文霞；程军平；张永祥 刊期： 2004年第03期
目的:筛选无毒棉籽水提物有效部位(CTN)中抗抑郁活性成分.方法:提取大脑皮质突触膜,以CTN或其中5个黄酮类单体成分(分别为CTN-4,CTN-7,CTN-8,CTN-9和CTN-10)与突触膜共孵,放射免疫法测定腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)活性.结果:与阳性药丁螺环酮(5-HT1A受体部分激动剂)类似,CTN及CTN-4,7,8,9,10均可剂量依赖性激活突触膜AC,其中CTN-8在5个黄酮类单体中活性强.结论:黄酮类化合物槲皮素-3-O-芹菜糖基芦丁糖苷(即CTN-8)可能是CTN中强的抗抑郁活性成分之一,并且可能是5-HT1A受体激动剂.
作者：李云峰；刘艳芹；杨明；王恒林；赵毅民；罗质璞 刊期： 2004年第03期
目的:制备一种高效T载体,并检测其克隆PCR产物的效率.方法:构建质粒pGH-T,它包含2个Xcm Ⅰ酶切位点,并在两位点间插入一段约600 bp的DNA序列.用Xcm Ⅰ彻底消化质粒pGH-T后,回收线性化大片段,即得T载体.利用此T载体克隆人端锚聚合酶(tankyrase)HPS结构域的PCR产物,并用限制酶切鉴定克隆的结果.结果:自制T载体可高效克隆PCR产物,其效率可达80%～100%.结论:自制T载体对PCR产物的克隆效率与商品完全相同,但使用方便且价格低廉.
作者：杨明；付汉江；江红；朱捷；罗瑛；郑晓飞 刊期： 2004年第03期
军事医学杂志
主管:军事医学科学院
主办：军事医学科学院
