龚锐
目的 探讨载多烯紫杉醇(docetaxel,DTX)的靶向脂质超声微泡(DR5-DLLM)联合超声靶向微泡破裂技术(ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD)对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响.方法 采用机械振荡法、生物素-亲和素连结法分别制备包载DTX的脂质超声微泡(DLLM)和DR5-DLLM.MTT法检测DTX对人肝癌HepG2细胞增殖的影响,计算半数抑制浓度(IC50).将体外培养人肝癌HepG2细胞分为空白对照组、DTX组、DTX+UTMD组、DLLM+ UTMD组及DR5-DLLM+ UTMD组,按IC50的药物浓度进行给药,UTMD以0.5 W/cm2的超声声强辐照45 s.CCK-8法检测细胞毒性作用,TUNEL法检测细胞凋亡情况,流式细胞术检测细胞周期.结果 DTX可有效抑制人肝癌HepG2细胞增殖,且呈时间-剂量效应关系.与其他组比较,DRS-DLLM+ UTMD组细胞毒性明显增强(P＜0.00l);细胞凋亡率明显升高(P＜0.001);G2/M期细胞明显增多、S期细胞明显减少(P＜0.001).结论 DR5-DLLM联合UTMD可增强对人肝癌HepG2细胞增殖抑制、细胞周期阻滞和凋亡诱导作用,该方法有望成为肝癌分子靶向治疗的一种新途径.
作者：杨健；曾妍；康娟；吴小翎；王志刚 刊期： 2016年第04期
目的 筛选适宜Vero细胞培养的无血清培养基,并优化其培养流感病毒H5N1的条件.方法 取VP-SFM培养的Vero细胞(SFM-Vero),以增殖速率为指标,筛选无血清培养基[VP-SFM、EX-CELLTMVERO、VirusProTM VERO、自制无血清培养基1(SFM-1)和2(SFM-2)];采用中心组合实验(Box-Behnken)优化SFM-Vero培养流感病毒H5N1的pH、TPCK-Trypsin浓度和病毒接种MOI.结果 Vero细胞在VP-SFM和自制SFM-1培养基中生长情况好于其他无血清培养基;H5N1病毒株能够感染无血清适应的Vero细胞;SFM-Vero培养流感病毒H5N1较优条件为:pH 7.64,TPCK-Trypsin浓度0.68 μg/ml,MOI 0.01.在该条件下培养的流感病毒HA滴度可达768 HAU/50 μl,为正常培养基培养的Vero细胞的2.33倍.结论 筛选出适宜Vero细胞生长的无血清培养基,优化了流感病毒H5N1Vero细胞适应株无血清培养的条件.
作者：李在晗；苏杨起；常亚军；杨家方；王婷婷；杨耀云；刘圆圆；杨建波；唐聪 刊期： 2016年第04期
目的 制备肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)多克隆抗体F(ab’)2片段,并评价其体外中和效果.方法 采用硫酸铵分级沉淀法从EV71感染的兔血清中提取IgG,用胃蛋白酶进行酶解,正交试验确定佳酶解条件;使用阴离子交换层析(Q Sepharose Fast Flow)纯化得到F(ab’)2片段,采用体外中和试验检测其对EV71的中和效果.结果 硫酸铵分级沉淀法得到电泳纯的IgG;佳酶解条件为:胃蛋白酶与IgG按1:10的质量比混合,47℃反应4h,在此条件下,F(ab’)2的产率大值为79.51％,且方差分析表明,酶切比例对F(ab’)2产率的影响大,温度次之,时间对F(ab’)2产率的影响不明显;经阴离子交换层析纯化,可有效去除Fc片段,得到电泳纯的F(ab’)2;F(ab’)2具有与IgG、正常血清同等的中和效果.结论 成功制备了EV71兔多克隆抗体F(ab’)2片段,初步确定该F(ab’)2片段具有良好的体外中和效果.
作者：岳磊；朱凡丽；李华；杨婷；谢天宏；龙润乡；杨蓉；罗芳宇；谢忠平 刊期： 2016年第04期
目的 对一株鸡源乳酸菌FCL67进行鉴定,并检测其生物学特性.方法 通过形态观察、对酸及胆盐的耐受性、生长特性及DNA的检测,对鸡源乳酸菌FCL67进行鉴定.采用单因素试验设计,将180只健康肉雏鸡随机分为试验组Ⅰ(饲喂基础日粮)、试验组Ⅱ(基础日粮+0.01％黄霉素)及试验组Ⅲ(基础日粮+0.2％ FCL67菌制剂),饲喂28 d,于第2周和第4周计算各组肉雏鸡的平均日增重(average daily gain,ADG)及料重比(food conversion rate,FCR),并取盲肠内容物,进行10倍稀释后,经平板涂布法测定盲肠内乳酸菌和大肠埃希菌数量.结果 乳酸菌FCL67为球菌,耐酸耐胆盐消化,生长迅速、产酸能力强、为Enterococcus faecium(粪肠球菌).日粮中添加FCL67菌制剂可明显提高肉雏鸡的ADG(P＜0.05),显著降低FCR(P＜0.05),可显著增加肉雏鸡盲肠中乳酸菌数量(P＜0.05),且对盲肠中大肠埃希菌数量有明显抑制作用(P＜0.05).结论 鸡源乳酸菌制剂对肉雏鸡的生长具有促进作用,且有同于抗生素的抑菌作用,但乳酸菌制剂更具有安全优势,可替代抗生素作为鸡用微生态制剂应用.
作者：崔一喆；王秋菊；苏景；张宇辰；李悦；周亚强 刊期： 2016年第04期
肺孢子菌(Pneumocystis carinii /jiroveci,PC为大鼠源,PJ为人源,目前国内外文献通称为PC)是重要的机会性致病菌,其感染可引起卡氏肺孢子菌肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia,PCP),常见于免疫缺陷患者.在PCP发病过程中,白介素-10(interleukin-10,IL-10)、干扰素γ(interferon γ,IFNγ)、IL-8、IL-23和IL-33均发挥重要作用,且各细胞因子间可相互作用,协同或拮抗,影响机体炎症的发生及组织损伤.本文对PCP相关细胞因子的研究进展作一综述.
作者：龚锐 刊期： 2016年第04期
麻疹是由麻疹病毒引起的一种急性呼吸道传染病,其并发症是导致患儿死亡的高危因素,至今仍是危害儿童生命健康的严重传染病之一.云南省玉溪市自使用麻疹类减毒活疫苗,特别是1983年开展计划免疫以来,麻疹类减毒活疫苗接种率分别于1988、1990、1995年实现了85％的儿童免疫目标.随着麻疹类减毒活疫苗接种率水平和接种质量的不断提高,麻疹得到了有效控制,年平均发病率由计划免疫前阶段(1953 ～ 1982年)的489.99/10万降至计划免疫后阶段(1983～2015年)的8.66/10万.
作者：马运葵；祁昆；李廷学；张耀喜；吴丽清；余庆福；杨晶；任志艳 刊期： 2016年第04期
基因工程和蛋白质工程等分子水平的操作均需从生物体中提取基因组DNA,尤其在分子遗传学及动物遗传育种的研究中.提取的DNA质量会影响后续结果的可靠性,而提取过程中DNA的质量受多种因素的影响,其中温度是影响其质量的一个重要因素.本实验采用苯酚-氯仿法在不同温度(4℃和常温)条件下提取奶牛血液DNA,探讨不同提取温度对DNA质量的影响.
作者：李强子；张丽 刊期： 2016年第04期
目的 比较膜免疫荧光抗体法(fluorescent antibody to membrane antigen,FAMA)与ELISA法检测水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)血清抗体的效果.方法 以FAMA法为“金标准”,同时用德国Serion定量ELISA试剂盒检测184份血清样本(水痘疫苗免前92份、免后92份)的VZV IgG抗体滴度,并对两种方法的测定结果进行比较.结果 FAMA法检测的阳性率为64.7％,抗体几何平均滴度(GMT)为1∶6.34,ELISA法检测的阳性率为47.8％,平均抗体活性值为492.33 mIU/ml.ELISA法的特异性为100％,阳性符合率(灵敏度)为69.7％,阳性符合率随着抗体滴度的增加而升高(z=-6.03,P＜0.001).Fisher精确概率法分析结果显示,抗体滴度1∶8、1∶16和1∶32组与≥1∶64组阳性符合率差异均有统计学意义(P＜0.05),其余各组间阳性符合率差异均无统计学意义(P＞0.05).ELISA抗体活性值与抗体滴度呈明显正相关,相关系数R2=0.656,P＜0.001;Kappa值为0.707,两种方法具有较高的吻合度.结论 德国Serion定量ELISA试剂盒在检测低抗体滴度VZV抗体时易出现假阴性,在检测高滴度VZV抗体时,两种方法敏感性相当;ELISA试剂盒检测的滴度临界值为1∶8～1∶32.该试剂盒可用于疫苗免疫效果评价和人群VZV抗体水平监测.
作者：张磊；赖文辉；许瑛；李慧敏；包光妍；瞿奔；苏家立；汤妍；张吉凯 刊期： 2016年第04期
目的 构建PRELP(proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein)基因shRNA慢病毒表达载体,并对其在Saos-2细胞中沉默效果进行鉴定.方法 针对PRELP mRNA设计2对干扰序列,化学合成后插入至慢病毒载体,将慢病毒载体以不同MOI值分别转染Saos-2细胞,筛选细胞内GFP阳性率高MOI值.将合成的慢病毒载体以筛选出的MOI值分别转染细胞,嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株,Western blot法验证两株稳定转染细胞株PRELP下调效率.结果 成功构建PRELP shRNA慢病毒载体,当MOI为50～ 70时,细胞内荧光蛋白表达阳性率高;嘌呤霉素筛选到稳定转染的细胞株;构建的稳转细胞系均特异性抑制PRELP蛋白的表达.结论 成功构建了PRELP shRNA慢病毒载体,并建立稳定的Saos-2细胞PRELP下调表达细胞模型,为研究PRELP在骨关节炎中的作用奠定了基础.
作者：李海英；崔亚洲；栾静；周小艳；韩金祥 刊期： 2016年第04期
目的 研究生产场地变更后,原生产工艺制备的甲型肝炎灭活疫苗(人二倍体细胞)的抗原特性.方法 采用双抗体夹心ELISA法检测在新场地制备的甲肝灭活疫苗病毒浓缩液和疫苗原液的甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)抗原含量.SDS-PAGE和Western blot分析二者的蛋白组分和特异性;疫苗成品(成人剂量)稀释为不同剂量(640、320、160、80和40 EU),免疫ICR小鼠(并设铝佐剂对照组),采用竞争ELISA法检测小鼠血清中HAV抗体效价;同时称量免疫后不同时间小鼠体重.结果 病毒浓缩液和疫苗原液的HAV抗原含量分别为12 800和3 200 EU/ml.疫苗原液中仅含HAV结构蛋白组分,且可与HAV抗体特异性结合.初免后28 d,640、320和160 EU剂量疫苗组小鼠血清抗体阳转率为100％,80和40 EU剂量疫苗组二免后血清抗体阳转率达100％和90％,所有免疫组小鼠血清抗体效价二免后14 d较初免28 d上升约2倍;疫苗免疫组小鼠体重及体重增幅与佐剂对照组相比,均无药物作用引起的异常变化(P＞0.05).结论 在新场地采用原生产工艺制备的甲型肝炎灭活疫苗原液有单纯的抗原蛋白组分和免疫学特异性,且与前期研究结果相比,其免疫原性及安全性具有一致性.
作者：杨二霞；李海巍；封晓菁；张浩然；黄成；刘碧云；田华平；李平忠；陈良宇 刊期： 2016年第04期
目的 分析内蒙古包头市2012年疑似预防接种异常反应(adverse event following immunization,AEFI)监测数据,评价包头市AEFI监测系统运转情况.方法 通过全国疑似预防接种异常反应信息管理系统,收集包头市2012年报告的AEFI个案,采用描述性方法对相关指标进行流行病学分析.结果 2012年包头市共报告AEFI 53例,报告发生率为9.03/10万,所有区县均有报告;AEFI多发生在6～11月;男女AEFI发生比例为1.12∶1;＜1岁的占41.51％,≥8岁的占3.77％;AEFI个案以一般反应为主,占92.45％,异常反应占7.55％;大多数AEFI发生在接种疫苗后24 h以内,以百白破(无细胞)疫苗和腮腺炎疫苗引起为主;治愈和好转占83.02％;48 h报告率为86.79％.结论 包头市AEFI监测系统运转情况较好,预防接种服务的质量和疫苗安全性较高,但仍需加强AEFI监测的敏感性和完整性.
作者：侯飞；李佳；李海；张娇；丁雪娇；时念民 刊期： 2016年第04期
目的 构建人葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 kD,GRP-78)shRNA真核表达质粒,并建立其稳定转染A549细胞系.方法 根据GenBank中登录的人GRP78基因序列(3309)设计3对互补寡聚单链DNA干扰序列(GRP78-miR-1 、GRP78-miR-2 、GRP78-miR-3)及1对阴性对照,分别插入至载体pcDNA6.2TM-GW/EmGFP,构建shRNA真核表达质粒.在Lipofectamine 3000介导下将各shRNA真核表达质粒分别转染A549细胞,并经Blasticidin S HCl加压筛选稳定的转染细胞系.实时荧光定量PCR和Western blot法检测A549细胞中GRP78基因mRNA转录和蛋白表达水平.结果 各shRNA真核表达质粒经测序鉴定证明均构建正确.稳定转染shRNA真核表达质粒的A549细胞,在荧光显微镜下可见均一表达绿色荧光.与空白对照组比较,A549细胞中GRP78基因mRNA转录和蛋白表达水平明显降低(P＜0.05),阴性对照组无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建了人GRP78的shRNA真核表达质粒,并建立了其稳定转染的A549细胞模型,为进一步研究GRP78在肺癌细胞的侵袭和转移中的作用机制奠定了基础.
作者：陈昌明；孙玲玲；林丽珠 刊期： 2016年第04期
目的 探讨基于A ctinomyces ruminicola的微生态制剂对瘤胃发酵的影响.方法 将分离得到的能生成挥发性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)的瘤胃厌氧菌Actinomyces ruminicola(命名为NY2,以下简写为Ar)与痤疮丙酸杆菌(以下简写为Pa)按3种比例混合制成微生态制剂(M1:Ar∶Pa=2∶3;M2:Ar∶Pa=1∶1;M3:Ar∶Pa=3∶2),进行羊体内发酵试验,分别于饲喂后0、2、4、6、8、10、12和24 h无菌采集各组羊的瘤胃液,用精密pH检测仪测定瘤胃液的酸碱度;Waters2695液相色谱仪测定瘤胃液中VFA(主要是乙酸、丙酸和丁酸)的含量.结果 各组瘤胃液的pH值均呈先下降后升高的趋势;M2组瘤胃液的pH值与M1和M3组差异有统计学意义(P均＜0.05).当微生态制剂中Ar∶Pa=∶1,饲喂4～6h后,瘤胃液中乙酸、丙酸、丁酸和总VFA的浓度均达高,分别为(82.49±2.51)、(35.12±1.69)、(22.92±1.02)和(139.81±5.61) mmol/L,该比例的微生态制剂可保持瘤胃内容物pH在6.0～7.0之间波动.结论 本实验制备的微生态制剂有利于瘤胃微生物发酵,能促进乙酸、丙酸等VFA的生成,为今后该瘤胃微生态制剂的应用奠定了基础.
作者：白云龙；肖鑫焕；胡盼；吴凌；夏成；张洪友；徐闯 刊期： 2016年第04期
随着高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis,HPCE)技术的不断发展,其在生物制品的质量控制方面表现出较高的实用价值和良好的应用前景.本文现就HPCE技术近年来在疫苗、抗体等生物制品的质量控制中的应用作一综述.
作者：林楠 刊期： 2016年第04期
目的 原核表达埃可病毒6型表面特异性蛋白VP1,并制备其多克隆抗体.方法 筛选VP1蛋白氨基酸序列中抗原性强的片段,优化基因序列,分别构建重组表达质粒pGEX-4T-2-vp1和pET-28a-vp1.将经双酶切及测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21 (DE3),IPTG诱导表达,进行15％ SDS-PAGE鉴定.将融合蛋白VP1-GST及VP1-His分别用Glutathione resin和High Affinity Ni-NTA resin进行纯化.以纯化后的VP1-His融合蛋白作为免疫原免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,以VP1-GST融合蛋白为检测抗原,间接ELISA法检测血清抗体效价,Western blot法检测血清抗体特异性.结果 经双酶切及测序鉴定证明,重组质粒pGEX-4T-2-vp1和pET-28a-vp1构建正确.VP1-GST和VP1-His融合蛋白的相对分子质量分别为38 000和19 000,两种融合蛋白分别以可溶性蛋白和包涵体形式表达,约占菌体总蛋白的60％和30％,纯化后的纯度均＞90％.兔抗VP1血清效价为1:320 000,可与融合蛋白VP1-GST和VP1-His发生特异性结合.结论 成功原核表达了融合蛋白VP1-His和VP1-GST,且VP1-His具有良好的免疫原性,其制备的多克隆抗体的特异性较好,为埃可病毒快速检测技术的建立奠定了基础.
作者：李素梅；齐永；潘英；李素芹；李佳萌；徐亭亭；陈晨；王新国；徐艺菲 刊期： 2016年第04期
目的 建立人凝血因子Ⅷ、人凝血因子Ⅸ、人凝血酶、人抗凝血酶Ⅲ蛋白含量Lowry快速检测法,并进行验证.方法 采用《中国药典》三部(2010版)Lowry法检测因子类产品的蛋白含量,通过耐用性研究降低辅料对方法的干扰,优化Lowry检测方法,并对方法的专属性、线性及范围、准确度、精密度进行验证.结果 不同辅料对Lowry法的干扰程度不同,人凝血因子Ⅷ、人凝血因子Ⅸ、人凝血酶、人抗凝血酶Ⅲ样品分别稀释20、10、80、160倍,可明显降低辅料的影响;Lowry法与凯氏定氮法相关性良好,方法线性R＞0.99,其准确度、精密度均良好.结论 Lowry法测定人凝血因子Ⅷ、人凝血因子Ⅸ、人凝血酶、人抗凝血酶Ⅲ蛋白含量操作简便、快速、准确,可用于产品的质量控制.
作者：王彬；李荣贞；耿文博；李虎 刊期： 2016年第04期
目的 分离小鼠肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM),并鉴定其纯度和吞噬活性.方法 采用肺泡灌洗法分离小鼠AM,分别通过瑞氏-姬姆萨染色法和Diff-Quik染色法鉴定AM的纯度;将FITC标记的大肠埃希菌与AM按不同比例混合(10∶1、15∶1、20∶1)后孵育不同时间(20、25、30 min),荧光倒置显微镜下观察AM的吞噬活性.结果 两种染色方法染色时,阳性细胞百分率均在94％以上,Diff-Quik染色法细胞阳性率略高于瑞氏-姬姆萨染色法,染色时间较瑞氏-姬姆萨染色法短,且背景干净无杂质.小鼠AM的吞噬率和吞噬指数随着FITC标记的细菌与AM比例的增加而增大,且随孵育时间的延长呈先升高再降低的趋势.当细菌与细胞比例为20∶1,孵育时间为25 min时,吞噬率和吞噬指数达大,分别为(63.67±4.04)％和1.41±0.07.结论 贴壁培养法可获得较高纯度的小鼠AM,Diff-Quik染色法鉴定巨噬细胞纯度优于瑞氏-姬姆萨染色法,其可代替瑞氏-姬姆萨染色法,成为一种快速、高效的鉴定巨噬细胞纯度的方法.
作者：黄燕霞；许娜；赵红；孙成彪；刘洋；陈华鑫；万家余；刘文森；金宁一 刊期： 2016年第04期
目的 分析北京市顺义区2008 ～ 2014年疑似预防接种异常反应(adverse events following immunization,AEFI)的发生特征,评价监测系统运转情况.方法 采用描述性流行病学方法对2008 ～ 2014年顺义区AEFI监测资料进行分析.结果 2008 ～ 2014年顺义区共接种疫苗3 304 208剂次,报告AEFI 1 072例,报告发生率为32.44/10万;AEFI 48 h内报告率为99.63％,48 h内调查率为99.72％,街乡覆盖率为93.88％.共报告一般反应825例(24.96/10万),发热、红肿、硬结占84.50％;异常反应120例(3.63/10万),过敏性皮疹占90.83％,严重异常反应7例(0.21/10万);偶合症113例(3.42/10万),上呼吸道感染占91.19％;心因反应14例(0.42/10万).病例报告集中于5～9月份,≤3岁组病例占总数的77.61％.流感(亚单位)疫苗、流脑A+C(结合)疫苗、百白破+IPV+ Hib五联疫苗3种疫苗不良反应发生率高.疫苗接种后当天发生反应的占54.10％,AEFI病例的治愈好转率为100％.结论 北京市顺义区AEFI监测系统整体工作质量较高,但报告街乡覆盖率偏低.目前所用疫苗安全性好,应加强禁忌筛查,以较少偶合症发生.AEFI常发生在3岁以内儿童接种后24 h内,应重点监测.有关政策的出台对AEFI监测工作有效开展起到积极作用.
作者：肖雷；王凤双；唐莹；彭枭然；黄蓉 刊期： 2016年第04期
目的 MTT法检测细胞因子信号负调控因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)稳转乳腺癌细胞株对他莫昔芬(tamoxifen,TAM)的耐药性.方法 用慢病毒LV-SOCS3(5775-1)感染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,经氨苄西林筛选及扩增后,建立SOCS3稳转乳腺癌细胞株.常规培养正常及SOCS3稳转入乳腺癌MDA-MB-231细胞,并分别加入不同浓度的TAM(0、10、20、30、40 μmol/L),采用MTr法检测各组细胞的相对增殖率.结果 相同TAM浓度下,SOCS3稳转人乳腺癌MDA-MB-231细胞的相对增殖率明显低于人乳腺癌MDA-MB-231细胞(P＜0.05).结论 SOCS3稳转细胞株对TAM耐药性显著降低,为内分泌治疗耐药的乳腺癌患者提供了一种新的治疗方法.
作者：李永福；王莉；熊亮发 刊期： 2016年第04期
目的 在杆状病毒中表达牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type-3,BPIV-3)血凝素-神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase,HN).方法 提取BPIV-3 BN-1株RNA,设计特异性引物扩增HN全长ORF,将其克隆至杆状病毒供体载体pFastBacHTA中,获得重组供体质粒pFastBac-HN.将pFastBac-HN转化至感受态细胞E.coli DH10Bac,制备穿梭质粒Bacmid-HN.将纯化的Bacmid-HN经脂质体转染至Sf21昆虫细胞,拯救重组杆状病毒,并进行Western blot鉴定.结果 经PCR及测序鉴定证明,HN基因重组供体质粒pFastBac-HN及穿梭质粒Bacmid-HN构建正确.利用Sf21昆虫细胞成功拯救重组杆状病毒,连续传代扩增3代的病毒滴度为2×108 CPE/ml.重组HN蛋白的相对分子质量约70 000,可与BPIV-3阳性血清发生特异性反应.结论 在杆状病毒表达系统中成功表达了BPIV-3重组HN蛋白,为BPIV-3的诊断及疫苗效力评价奠定了基础.
作者：卢元赫；张玲玲；张峣；任博雯；祝子涵；冉旭华；倪宏波；刘阳阳；李维香 刊期： 2016年第04期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
