丁鹏；薛黎萍；宋晓斌；李玉；龙江；王伟民；杨智勇；王进昆；林荣安
背景:超顺磁性氧化铁作为磁共振对比剂已进行了大量临床实验,但其随标记细胞传代分化后的分布及代谢却报道甚少.目的:实验首次观察和描述了体外超顺磁性氧化铁标记的大鼠骨髓基质干细胞及其传代细胞的情况,并以磁共振信号检测铁粒子随细胞传代的演变情况.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-06/2007-01在川北医学院附属医院医学影像研究所和风湿免疫研究所完成.材料:清洁级雌性大白鼠2只,由川北医学院动物中心提供.超顺磁性氧化铁由德国先灵公司惠赠.方法:抽取大鼠双侧股骨和胫骨的骨髓,采用贴壁法分离纯化骨髓基质干细胞,用铁浓度为42 mg/L的氧化铁-多聚赖氨酸复合物600 μL进行体外标记.主要观察指标:倒置显微镜下观察各代细胞标记阳性率,磁共振扫描测定磁共振信号强度变化百分率.结果:普鲁士蓝染色后,镜下第1代细胞超顺磁性氧化铁标记阳性率为100%,随着传代次数的增加,第1～5代细胞标记阳性率逐级降低.与未接受超顺磁性氧化铁标记的PBS对照比较,除第1,2代细胞信号强度变化率无明显变化外,随着细胞的传代磁共振信号强度变化百分率逐渐降低,细胞标记率与T2~*WI信号强度呈负性相关(r=-0.986 6,P<0.005).结论:标记入骨髓基质干细胞内的铁能随细胞的传代而传向子代,并可以在一定时期内用磁共振进行追踪检测,实验结果亦首次提出了磁标记的细胞铁粒子可随细胞传代而递减的规律.
作者：杨华；张小明；蒋红；邵阳；曾南林 刊期： 2009年第49期
目的:观察人脐带间充质干细胞体外长期培养的生物学特性,探讨其向肝样细胞分化的可能性.方法:脐带来源于天津市第三中心医院住院的健康足月产妇,采用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,待细胞生长至80%-90%融合时传代.取传至第9代细胞接种于12孔板内,调整细胞浓度为5×10~(10)L~(-1),加入含肝细胞生长因子、成纤维生长因子4、抑瘤素的DMEM培养基,诱导28 d.MTT法测定细胞生长活性,流式细胞仪检测细胞周期,免疫细胞化学及流式细胞仪鉴定细胞表型;免疫细胞化学染色鉴定诱导后肝细胞特异表面标志物的表达,以及糖原染色结果.结果:从人脐带中分离得到的间充质干细胞贴壁生长,形态类似于成纤维细胞,80%以上处于G_0/G_1期,具有良好的生长活性,可在体外稳定传代20次以上;CD29,CD90,CD105,Vimentin呈阳性表达,基本不表达造血细胞标志CD34和内皮细胞标志CD31.随诱导时间的延长,圆形细胞逐渐增多,形态似肝细胞;诱导1周时细胞开始表达肝细胞表面标志物甲胎蛋白、细胞胶蛋白18、细胞胶蛋白19;诱导3周时开始表达成熟肝细胞标志白蛋白;诱导4周时白蛋白表达增强,且诱导细胞糖原染色呈阳性.结论:从人脐带中可成功分离出间充质干细胞,实现体外长期培养,并可诱导分化为肝样细胞.
作者：朱争艳；阎俊卿；韩涛；杜智；骆莹；王鹏；高英堂；刘彤 刊期： 2009年第49期
背景:富血小板血浆中含有大量骨再生所需的生长因子,且各生长因子的比例是机体自身形成的,具有良好的协同作用.目的:探讨富血小板血浆体外诱导犬骨髓间充质干细胞成骨的效果.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-06/2008-02在中南大学湘雅医院中心实验室完成.材料:健康12月龄雄性比格犬,由中南大学湘雅医学院实验动物部提供.方法:收集第3代犬骨髓间充质干细胞,分为4组:对照组加入标准培养基;成骨诱导培养基组向培养板孔内加入含胎牛血清、地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的高糖DMEM培养基;富血小板血浆组根据预实验结果,向培养板内加入含体积分数为6.25%富血小板血浆的低糖DMEM培养基;联合组向培养板内加入含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、体积分数为6.25%富血小板血浆的高糖DMEM培养基.主要观察指标:细胞内碱性磷酸酶活性,免疫细胞化学染色检测I型胶原的表达,改进Yon Kossa染色标记钙结节形成情况,RT-PCR检测诱导后骨钙素mRNA的表达.结果:各组碱性磷酸酶活性均随诱导时间的延长而逐渐增高,联合组升高幅度为明显(P<0.05).诱导7,14 d后,成骨诱导培养基组、联合组I型胶原均呈阳性表达,富血小板血浆组、对照组I型胶原始终呈阴性表达.诱导14 d后,成骨诱导培养基组、联合组可见卵圆形钙结节.诱导7,14 d后,对照组与富血小板血浆组之间骨钙素mRNA表达水平无明显差异(P>0.05),此2组骨钙素mRNA表达水平均明显低于成骨诱导培养基组、联合组(P<0.05);成骨诱导培养基组骨钙素mRNA表达水平明显低于联合组(P<0.05).结论:经成骨条件培养基诱导培养的骨髓基质干细胞,富血小板血浆能在体外显著诱导其成骨指标的表达.
作者：尹科；廖前德；钟达；卢吉平；周星；翁晓军；严安 刊期： 2009年第49期
背景:近年来,部分学者证明骨髓基质细胞移植可促进轴突再生,改善脊髓损伤引起的运动功能障碍,但目前关于移植骨髓基质细胞如何促进轴突再生,移植细胞与再生轴突的关系尚不清楚.目的:通过免疫荧光组织化学和免疫电镜的方法,探讨移植骨髓基质细胞促进脊髓全横断损伤区轴突再生的机制.设计、时间及地点:随机对照动物实验,细胞学体内观察,于2006-03/2007-06在新加坡国立大学解剖系完成.材料:清洁级Wistar新生大鼠1只,用于骨髓基质细胞培养.清洁级成年雌性Wistar大鼠36只,无菌条件下显露、切断脊髓T_(10),制备脊髓全横断损伤模型.方法:通过传代法培养、纯化骨髓基质细胞.36只成年Wistar雌性大鼠随机投币法分为移植组和对照组,每组18只.移植组大鼠脊髓全横断损伤9 d后以1×10~(11)L~(-1)的密度移植骨髓基质细胞,缺损区5μL,损伤区上、下1 mm处各2.5 μL,对照组动物在相同部位注射等量DMEM完全培养基,注射速度1 μL/min.主要观察指标:①移植骨髓基质细胞存活、分化情况.②轴突再生情况.③移植组和对照组宿主自身的nestin、NF200、GFAP和CNP阳性细胞在脊髓损伤区存活情况.④内源性CNP阳性细胞和再生纤维关系.结果:骨髓基质细胞移植2周时,脊髓损伤区可见大量CFDA-SE标记的移植细胞,随时间延长,存活的移植细胞数目逐渐降低,考虑脊髓损伤区内大量的0×42阳性吞噬细胞,激活小胶质细胞及空洞可能影响移植细胞的存活.虽然骨髓基质细胞数目逐渐降低,骨髓基质细胞移植可促进损伤区轴突的再生,而且还可促进宿主自身的nestin、NF200、GFAP和CNP阳性细胞在脊髓损伤区存活.宿主自身CNP和许旺细胞促进损伤轴突的再生和髓鞘形成.结论:移植骨髓基质细胞移植可促进宿主自身CNP和许旺细胞在脊髓损伤区存活,后者具有促进损伤轴突再生和髓鞘形成的作用.
作者：丁鹏；薛黎萍；宋晓斌；李玉；龙江；王伟民；杨智勇；王进昆；林荣安 刊期： 2009年第49期
背景:间充质干细胞的增殖分化缺乏可调控性,结合适当载体后不能高效增殖分化是阻碍其进入临床的瓶颈.脉冲电磁场若能有效调控干细胞向骨源细胞分化将具有重要的临床价值.目的:观察脉冲电磁场刺激后,小鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化情况.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2004-0512007-10在华中科技大学同济医学院附属普爱医院骨科实验室完成.材料:BALB/C小鼠20只,由同济医学院实验动物中心提供.脉冲电磁场发生器由海军工程大学电机系设计与制造.方法:无菌分离小鼠双侧股骨,Percoll密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,再用贴壁筛选法纯化扩增.取生长良好的第3代细胞,调整细胞密度为2×10~7L~(-1)接种于6孔板,分成4组:空白对照组加入完全培养基组;脉冲电磁场组给予50 Hz、正弦波形、强度1 mT的脉冲电磁场辐射,2次/d,30 min/次,间隔12 h,共10 d;成骨诱导组加入含地塞米松、甘油磷酸钠、VitC的完全诱导培养基;脉冲电磁场+成骨诱导组给予相同的脉冲电磁场辐射后加入完全诱导培养基.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的分化情况.结果:碱性磷酸酶染色结果显示,干预10 d后,空白对照组为阴性;脉冲电磁场组呈弱阳性:成骨诱导组呈阳性;脉冲电磁场+成骨诱导组呈强阳性.与空白对照组比较,成骨诱导组、脉冲电磁场+成骨诱导组I型胶原免疫组化染色吸光度值均明显升高(P<0.05,P<0.01).结论:50 Hz、正弦波形、强度1 mT脉冲电磁场干预一定时间后,能够增强小鼠骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶及I型胶原的表达,促进其分化成骨.
作者：方真华；陈明；谢鸣；郑琼；勘武生 刊期： 2009年第49期
背景:近研究证实黄芩苷对多种脑损伤具有广泛的神经系统保护作用.目的:探讨中药单体黄芩苷干预并协同人脐血间充质干细胞静脉移植治疗幼鼠缺氧缺血性脑损伤的可行性.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-02/2008-01在南昌大学第一附属医院神经内科实验室完成.材料:健康孕妇足月顺产儿的脐带血10份,取自南昌大学一附院产科.清洁级7 d龄SD新生鼠85只,随机分为正常对照组15只、模型组20只、细胞移植组25只、细胞移植+黄芩苷组25只.方法:采用明胶沉降+密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,体外扩增至第5代用于移植,使用前6-12 h行DAPI标记.模型组、细胞移植组、细胞移植+黄芩苷组新生鼠建立缺氧缺血性脑损伤模型,空白对照组不作任何处理.分别于造模后2,3,4,5周,细胞移植组、细胞移植+黄芩苷组经尾静脉注射DAPI标记好的人脐血间充质干细胞悬液5～10 μL/g,细胞浓度为1×10~9L(-1).从细胞移植第1天起,细胞移植+黄芩苷组动物经腹腔注射120 mg,kg黄芩苷,1次/d,连续3 d.主要观察指标:脑组织病变情况,脑组织DAPI阳性细胞数,脐血间充质干细胞移植后定位情况.结果:移植后4周,细胞移植+黄芩苷组脑组织病变率明显低于模型组、细胞移植组(P<0.05).与细胞移植组比较,第1,2,4周细胞移植+黄芩苷组DAPI阳性细胞数均显著增加(P<0.01).造模后第3周开始细胞移植的病灶脑组织,在黄芩苷的协同作用下可见大量DAPI阳性细胞集中分布于病灶区周围,与宿主脑整合,没有明显的界限,而对侧非缺血区很少见到DAPI阳性的脐血间充质干细胞分布;造模后第4,5周开始细胞移植的病灶脑组织,其DAPI阳性细胞明显减少.结论:选择缺氧缺血性脑损伤后第3周进行细胞移植效果较佳,黄芩苷能够协同人脐血间充质干细胞有效地透过血脑屏障,在病灶脑组织周围迁移、扩散、整合.
作者：颜小华；徐昕；陈启文；黄涛；管让宪 刊期： 2009年第49期
背景:CD58是一种糖蛋白,属于免疫蛋白超家族成员,广泛表达于人体各种免疫细胞和红细胞,是红细胞调控T细胞免疫功能的重要天然免疫物质基础.目的:通过在神阙、关元等传统保健穴上施灸,观察对健康人群红细胞CD58表达的影响.设计、时间及地点:前后对照、调查分析.于2008-03/12在山西中医学院实验中心完成.对象:选择山西中医学院在校健康大学生40例,男女各20例,平均年龄21.08岁.受试者均知情同意.方法:将以熟地、山药、山茱萸等为主方的药物制成药饼置于受试者神阙、关元、足三里、脾俞、肾俞等穴施灸,隔日1次,共灸10次,进行施灸前后的对比.主要观察指标:在施灸前、后分别进行血细胞的常规检查,流式细胞仪测定红细胞表面CD58分子的阳性百分率和平均荧光强度.结果:施灸后红细胞、白细胞数量较施灸前显著升高(均为P<0.01);与施灸前相比,红细胞CD58分子的阳性百分率和平均荧光强度均明显高于施灸前(均为P<0.01).其中,红细胞CD58荧光强度的变化尤为突出.结论:红细胞CD58分子数量表达与艾灸密切相关,隔药饼灸增强了机体的免疫调节功能.
作者：李雷勇；田岳凤；王格洪；王军；张斌仁；王旭；孟颖霞 刊期： 2009年第49期
目的:观察大鼠自体骨髓间充质干细胞移植诱导缺血肢体血管生成过程中,缺血组织单核细胞趋化蛋白1的变化.方法:雄性SD大鼠20只,随机分为模型组、细胞移植组,10只,组.抽取大鼠股骨骨髓,percoll密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞,取传至第3或4代的细胞用于移植.两组大鼠均建立急性双下肢缺血模型,造模后2 h,细胞移植组于双下肢缺血部位缓慢注射1 ×10~(11)L~(-1)骨髓间充质干细胞,模型组同法注射等量磷酸盐缓冲液.血管造影和组织学毛细血管密度检查侧支血管形成情况;免疫组化法检查CD68~+的巨噬细胞浸润情况;ELISA法检测血浆及缺血组织单核细胞趋化蛋白1蛋白的表达;RT-PCR法检测缺血组织单核细胞趋化蛋白1 mRNA的表达.结果:移植后28 d,细胞移植组缺血下肢可见明显侧支血管形成,且免疫组化显示CD68~+巨噬细胞的浸润少于模型组;与模型组比较,细胞移植组血浆、缺血组织单核细胞趋化蛋白1的蛋白浓度和mRNA表达水平均明显降低(P<0.05).结论:骨髓间充质干细胞移植后,单核细胞趋化蛋白1可能在缺血诱导血管生成的过程中起重要作用,提示其可成为一个调节骨髓间充质干细胞移植炎性血管生成的靶分子.
作者：霍鑫；张强 刊期： 2009年第49期
背景:间充质干细胞的生物学特性及影响分化调控因子的研究认为,体外原代培养的间充质干细胞自然分化为肝细胞的比例较低,选择一种合适的诱导剂提高其分化为肝细胞的比例尤为必要.目的:以肝细胞生长因子、表皮生长因子及成纤维生长因子体外联合,验证其诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-08在潍坊医学院实验中心完成.材料:Sprague-Dawley大鼠40只,由潍坊医学院实验动物中心提供.方法:采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,取传至第3代细胞,设立2组:空白对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基;联合诱导组在此基础上,另加入10 μg/L成纤维生长因子、8 pg/L.肝细胞生长因子、8 μg/L表皮生长因子.主要观察指标:倒置显微镜观察诱导后细胞形态变化,免疫荧光染色观察甲胎蛋白及白蛋白的表达,PAS检测糖原的表达,靛青绿摄入情况,酶学检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的水平.结果:联合诱导组细胞呈多角形、卵圆形或圆形细胞的特征性改变,空白对照组骨髓间充质干细胞仍保持梭形或纺锤形.联合诱导组培养14 d可见白蛋白和甲胎蛋白免疫反应阳性细胞:诱导7 d时偶见PAS阳性细胞与靛青绿阳性细胞,随诱导时间延长,阳性细胞逐渐增多;诱导14 d时开始检测到谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的合成,21 d达高峰,之后下降.上述各指标空白对照组细胞均呈阴性.结论:成纤维生长因子、肝细胞生长因子与表皮生长因子体外联合应用,能够成功诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化.
作者：吴金生；朱建祥；蒋吉英；王晓萃；丁洁；于树娜；魏德全；王宝松 刊期： 2009年第49期
目的:用hVEGF_(121)/EGFP真核质粒转染骨髓间充质干细胞,提纯其表达的hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白,并体外检测其功能.方法:用课题组前期工作构建的pEGFP-N_2-hVEGF_(121)重组质粒提取质粒DNA.通过阳离子脂质体介导pEGFP-N_2-hVEGF_(121)重组质粒DNA转染体外培养的骨髓间充质干细胞,使用荧光显微镜检测hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白表达.用Amicon超滤离心管纯化融合蛋白.结果:荧光显微镜下观察到转染pEGFP-N_2-hVEGF_(121)重组质粒的骨髓间充质干细胞,Westen blot证实转染骨髓间充质干细胞的培养液中存在hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白表达.MTT试验证实人脐静脉内皮细胞数量在hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白组明显多于对照组(P<0.05).Miles实验证实hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白增加血管壁的通透性.结论:①携带hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白表达基因的真核表达质粒,在骨髓间充质干细胞中获得表达.②骨髓间充质干细胞表达的hVEGF_(121)/EGFP融合蛋白在体外具有野生型血管内皮细胞生长因子的功能.
作者：何力鹏；王耀晟；周仪华；姜宇；吴晓玲；程晓曙 刊期： 2009年第49期
背景:移植物抗宿主病是导致异基因外周血造血干细胞移植失败的主要原因,口服耐受是研究治疗移植物抗宿主病的新模式.目的:探讨骨髓移植前供鼠经口服受鼠脾淋巴细胞诱导耐受是否能增加异基因骨髓移植后受鼠对供者移植物的免疫耐受,从而减轻移植物抗宿主病,并与目前常用于预防移植物抗宿主病的免疫抑制药物比较作用效果.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-12在东南大学医学院中心实验室完成.材料:供鼠为雄性纯种近交系小鼠C57BL/6J(H-2~b),受鼠为雌性纯种近交系小鼠BALB/c(H-2~b).方法:用主要组织相容性抗原完全不合的纯种近交系小鼠建立异基因骨髓移植,移植物抗宿主病动物模型,小鼠共分5组,分别给予不同的急性移植物抗宿主病预防方案:①口服耐受组:移植前口服受鼠脾淋巴细胞相当于10 μg蛋白,隔天1次,共3次.②雷帕霉素组:1.5 mg/(kg·d)灌胃,从移植后第1天(+1 d)开始用药.③环孢索Al+甲氨蝶呤组:环孢素A 1.5 mg/(kg·d)腹腔注射,从移植后+1 d开始用药,当小鼠的胃肠功能逐渐恢复后,改为环孢素A 5 mg/(kg·d)灌胃,甲氨蝶呤0.4 mg/(kg·d)腹腔注射,移植后+1,+3,+6,+11 d用药.④空白对照组:移植后未用药.⑤辐照不移植组:照射后未予骨髓移植.主要观察指标:各组小鼠骨髓移植后移植物抗宿主病的出现情况及免疫耐受指标差异.结果:移植后小鼠出现典型的移植物抗宿主病症状,空白对照组小鼠死亡高峰在移植后第14-18天,死亡率接近100%.口服耐受组、雷帕霉素组和环孢素A+甲氨蝶呤组小鼠急性移植物抗宿主病症状明显减轻,平均生存时间较空白对照组显著延长(P<0.05);小鼠急性移植物抗宿主病病理表现减轻,口服耐受组病理变化少于其他各组;流式细胞仪监测CD4~+/CD8~+比值增加,CD4~+CD25~+细胞增加,口服耐受组增加明显;ELISA检测移植物抗宿主病产生相应细胞因子减低,且口服耐受组明显减轻.MTT结果显示,口服耐受组免疫耐受显著增强,淋巴细胞增殖明显降低.结论:口服耐受可以显著抑制体外T淋巴细胞增殖效应,增强小鼠对骨髓移植的免疫耐受,减轻移植物抗宿主病症状和病理损害程度,延长平均生存时间;与目前常用于预防移植物抗宿主病的免疫抑制药物比较,减轻移植物抗宿主病的作用更强.
作者：赵刚；陈宝安；丁家华；顾炎；王珏琼；邓晓静；吴亚男 刊期： 2009年第49期
背景:如何促进脊髓损伤后的神经再生和功能恢复始终是医学界一大难题,胚胎神经干细胞有利于神经元的存活,并能促进轴突再生.目的:观察胚胎鼠神经干细胞局部注射移植治疗高位脊髓损伤大鼠的可行性,以神经电生理及后肢运动功能评分评价其效果.设计、时间及地点:细胞学体内实验,于2007-06/2008-06在哈尔滨医科大学动物实验中心完成.材料:健康成年雌性SD大鼠40只,随机分为生理盐水组、细胞移植组,20只/组.另取孕14 d的SD大鼠5只用于制备胚胎神经干细胞.方法:生理盐水组、细胞移植组大鼠均建立高位脊髓损伤模型,取双侧第8-10对肋间神经各2 cm,交叉植入脊髓缺损处(近端白质与远端灰质、远端白质与近端灰质),细胞移植组局部注射鼠胚胎神经干细胞2×10~6个,生理盐水组局部注射等量无菌生理盐水.主要观察指标:通过体感诱发电位和运动诱发电位的检测,观察神经电生理恢复情况;通过BDA顺行神经示踪,观察运动传导束恢复情况:BBB后肢运动功能评分结果.结果:细胞移植组大鼠体感诱发电位及运动诱发电位的潜伏期、波幅明显优于生理盐水组(P<0.01);细胞移植组大鼠在损伤区有较多BDA标记阳性神经纤维通过,而生理盐水组未见BDA标记阳性神经纤维;细胞移植组大鼠BBB后肢运动功能评分较生理盐水组明显提高(P<0.01).结论:胎鼠神经干细胞局部注射可以较好地恢复高位脊髓损伤后的神经电生理及后肢运动功能.
作者：王广志；刘明娜 刊期： 2009年第49期
背景:肝细胞自身增殖能力有限,近几年关于各类干细胞向肝细胞分化的成功报道很多,包括胚胎干细胞、骨髓细胞、胰腺干细胞、神经干细胞及各种来源的间充质干细胞等.目的:探讨应用多种生长分化因子体外联合诱导人脐血间充质干细胞向肝样细胞分化的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-10/2006-04在暨南大学医学院血液病研究所完成.材料:胎儿脐带血来源于顺产及剖腹产的健康孕妇,由暨南大学第一附属医院产科提供,产妇均签署知情同意书.方法:体外分离培养人脐血间充质干细胞,胰酶-EDTA消化传代.取传至第3代细胞,按5×10~4/cm~2接种,48 h后去除原培养基,PBS洗涤后,第1阶段用含地塞米松、肝细胞生长因子、表皮生长因子、ITS的F12培养基诱导2周,第2阶段用含地塞米松、肝细胞生长因子、致瘤素M、ITS的F12培养基继续诱导2周.主要观察指标:流式细胞仪检测脐血间充质干细胞表面标志的表达,RT-PCR检测肝细胞相关基因的表达,免疫荧光染色检测肝细胞相关蛋白的表达,透射电镜观察细胞超微结构.结果:培养的细胞不表达造血细胞系标志CD34,CD45,CDl4;亦不表达CD54,CD49f,HLA-DR;部分表达内皮细胞标志CD106;强表达CD29,CD44及CDl3.诱导4周后,甲胎蛋白、白蛋白、ck-18及tat基因均呈阳性表达;免疫荧光染色显示细胞浆中甲胎蛋白、白蛋白、ck-18均呈阳性;细胞胞浆中出现脂滴及糖原的沉积,细胞表面有微绒毛,出现双核细胞,初步具备了肝细胞的超微结构特征.结论:联合应用地塞米松、肝细胞生长因子、表皮生长因子、致瘤素M及ITS等多种生长分化因子,可在体外成功诱导人脐血间充质干细胞向肝样细胞分化.
作者：迟作华；张洹；陆琰 刊期： 2009年第49期
背景:干细胞移植早期出现的大量细胞缺失可明显影响移植效果,目前已证实AKT1基因的过表达能明显抑制细胞凋亡.目的:探讨过表达AKT1基因的猪自体骨髓间充质干细胞移植能否在体内缺氧状态下抑制干细胞凋亡,及其修复受损心肌的效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-08/2007-02在苏州大学完成.材料:健康雄性梅山猪24只,由苏州大学动物实验中心提供.方法:扩增AKT1 cDNA基因,并构建表达载体.扩增后,使用慢病毒转染系统进行基因重组,以其为载体转染建立稳定过表达AKT1基因的猪自体骨髓间充质干细胞,并行BrdU标记.24只猪均应用明胶海绵栓塞冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,造模后4周,随机均分为4组:模型对照组不做任何治疗性处理;DMEM组行冠脉内注射DMEM液5 mL;单纯细胞移植组行冠咏内注射骨髓间充质干细胞悬液5 mL(1×10~7个细胞):AKT转染细胞移植组同法注射等量转染AKT1基因的骨髓间充质干细胞悬液.主要观察指标:载体酶切鉴定和测序验证结果,心脏磁共振检查评估心功能,免疫组化染色观察心肌组织学变化,ELISA法测定血清中血管内皮生长因子及转化生长因子β1的水平.结果:①双酶切鉴定和测序结果均表明所获取的cDNA为AKT1的CDS功能区基因;转染入293T细胞和骨髓间充质干细胞24,48 h后,均可检测到强荧光出现;其蛋白表达产物的分子量与已知分子量相符,实时荧光定量检测结果表明转染2周后的骨髓间充质干细胞能稳定转录AKT1,其AKT1-mRNA的转录水平是原代细胞的120倍.②细胞移植前,梗死心脏的左室舒张末径增加,每搏量明显下降.与移植前比较,移植后单纯细胞移植组、AKT转染细胞移植组心功能明显改善,梗死区的收缩功能和血流灌注均有所改善,左室腔缩小,梗死区的毛细血管密度明显增加,且AKT转染细胞移植组上述各指标改善更为显著(P<0.05).③苏木精-伊红染色结果显示,模型对照组、DMEM组梗死区纤维化明显:单纯细胞移植组、AKT转染细胞移植组梗死区均可见岛样心肌组织,且后者含有较丰富的小血管样结构.免疫组化染色结果显示,移值4周后单纯细胞移植组、AKT转染细胞移植组心肌切片中均发现有VWF及Cx-43阳性表达,且后组Brdu和Cx-43双阳性细胞占所有Brdu阳性细胞的比例明显高于前组(P<0.05).④细胞移植后,血管内皮生长因子水平呈逐渐升高的趋势,1周后达峰值,后逐渐下降,至4周后接近正常水平;而转化生长因子β1水平呈逐渐下降的趋势,至4周后明显低于同期模型对照组、DMEM组(P<0.05),且明显低于移植前水平(P<0.05).结论:使用携带目的基因AKT1的慢病毒系统转染猪骨髓间充质干细胞可使其长期稳定过表达AKT1,移植体内后可能通过防止梗死区变薄、抑制收缩功能异常而改善左室功能,同时AKT1的过表达可显著改善梗死后心脏功能.
作者：余云生；郭世强；虞桂平；叶文学；黄浩岳；陈一欢；华菲；谷涌泉；沈振亚 刊期： 2009年第49期
背景:目前国内外对嗅鞘细胞培养条件的报道各不相同,个别方法重复性较差,不利于实际应用.目的:观察差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化法纯化大鼠嗅鞘细胞的效果,并与化学药物法、差速贴壁法培养结果进行比较.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-06/2008-06在福建医科大学人体解剖与组织胚胎学系实验室完成.材料:新生2 d的SD大鼠8只,由福建医科大学试验动物中心提供.方法:无菌条件下完整取出大鼠双侧嗅球,剥除嗅球表面的软脑膜及毛细血管网,剪成0.5 mm~3的小块进行胰蛋白酶消化,过筛后按4.0×10~8L~(-1)密度种植于包被多聚左旋赖氨酸的培养瓶中进行原代培养.设立4组:①未经纯化的常规对照组.②化学药物组加入5 μmol/L阿糖胞苷抑制成纤维细胞分裂.③差速贴壁组采用Nash差速贴壁法纯化嗅鞘细胞.④差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化组首先采用Nash差速贴壁法去除大部分成纤维细胞,而后对于少量残留的成纤维细胞加入阿糖胞苷处理,培养6 d贴壁细胞大部分融合后,加入1.25 g/L胰蛋白酶消化1 min,显微镜下见突起回缩、细胞变圆、少量细胞浮起时终止消化.主要观察指标:嗅鞘细胞的形态,NGFR p75免疫细胞荧光染色结果.结果:体外培养的新生大鼠嗅球嗅鞘细胞主要为双极或三极细胞,其突起细长;未经纯化的常规对照组培养7 d时视野内成纤维细胞已达60%以上,至14 d成纤维细胞完全长满;经过纯化处理的另外3组始终以嗅鞘细胞居多,嗅鞘细胞的形态与原代基本相同.存活的双极和3极嗅鞘细胞呈NGFRp75阳性反应,但化学药物组、差速贴壁组嗅鞘细胞纯度偏低,仅为75%:差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化组嗅鞘细胞纯化效率明显增高,达85%以上.结论:实验结果证实了差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化法的三合一操作技术,是一种高效率的纯化培养嗅球嗅鞘细胞的方法.
作者：杨博宇；王锋；王玮 刊期： 2009年第49期
背景:不同来源饲养层条件下,人胚胎干细胞是否具有相同或相似的生物学特性尚不清楚,该问题的解决有利于建立标准化的饲养层体系.目的:观察比较人胚胎干细胞在人源和鼠源饲养层上的生长特性是否相同?设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-09,2009-02在中国科学院昆明动物所完成.材料:清洁级孕12.5～13.5 d的ICR小鼠2只,由昆明医学院动物中心提供.永生化人成纤维细胞由美国约翰霍普金斯大学医学院建系并赠送,人胚胎干细胞株BG02由中国科学院昆明动物所提供.方法:无菌条件下取ICR胎鼠,组织块胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,永生化人成纤维细胞按常规培养,两种细胞经γ射线处理后,以2.5×10~4/cm~3接种在明胶包被的6孔板中.取人胚胎干细胞,分别接种在小鼠胚胎成纤维细胞或永生化人成纤维细胞饲养层上,加入含β-巯基乙醇的DMEM/F12培养基,使用前添加碱性成纤维细胞生长因子.主要观察指标:两种饲养层上的人胚胎干细胞的形态、特异性标记表达、Oct-4阳性率、细胞倍增时间.结果:培养在小鼠胚胎成纤维细胞和永生化人成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞,其形态相似,呈圆形或椭圆形集落;均表达SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81和Sct-4,但不表达SSEA-1.与小鼠胚胎成纤维细胞饲养层比较,永生化人成纤维细胞饲养层上人胚胎干细胞Oct-4阳性细胞率明显升高(P<0.05),倍增时间明显延长(P<0.05).结论:人源和鼠源成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞体外培养生物学特性存在明显差异.
作者：胡智兴；周轶平；吴兰鸥；罗敏；郑存兰；李玛琳 刊期： 2009年第49期
背景:相对于成体干细胞和胚胎干细胞自身存在的问题,羊水来源的干细胞系的建立,能为每一个个体建立一份自身的、具有高度增殖分化能力的干细胞储备,有望成为神经性退行性疾病细胞治疗的理想细胞来源.目的:观察Noggin和碱性成纤维细胞生长因子对人羊水来源干细胞向神经细胞分化的影响.方法:羊水标本来自怀孕16-22周行产前诊断的孕妇,在超声引导下行羊膜腔穿刺取得.利用CD117抗体,选用免疫磁珠法从人孕中期羊水标本中分离获得羊水干细胞,培养扩增后,通过流式细胞仪检测表面抗原表达进行鉴定.选取生长状态良好的第3代羊水干细胞,利用无血清的神经诱导培养液诱导其向神经细胞分化,分为空白对照组、基础诱导液组、Noggin诱导组和碱性成纤维细胞生长因子诱导组.倒置相差显微镜观察诱导后细胞形态的变化,细胞免疫荧光检测巢蛋白、β-Ⅲtubulin和神经丝蛋白在诱导后细胞中的表达.结果与结论:利用免疫磁珠方法分离出的羊水干细胞呈CD44和HLA-ABC表达阳性,CD45和HLA-DR表达阴性.诱导2周后,碱性成纤维细胞生长因子诱导组光镜下细胞形态发生显著变化,免疫荧光染色巢蛋白、β-Ⅲ tubulin和神经丝蛋白表达阳性率较高.Noggin诱导组细胞形态和染色结果与基础诱导液组无显著性差异.提示利用羊水来源的干细胞诱导分化为神经细胞的过程中碱性成纤维细胞生长因子的作用远优于Noggin.
作者：张胜利；陈柏松；吴齐全；马晓荣；高同斌；陈方；周君梅 刊期： 2009年第49期
背景:以往对脑缺血再灌注后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific protease 3,Caspase-3)的表达均缺乏长时间的动态观察.目的:探讨胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的神经干细胞移植对暂时性脑缺血大鼠脑组织Caspase-3表达的影响.设计:随机对照动物实验.材料:清洁级成年SD大鼠60只,随机分为4组:正常对照组5只、缺血再灌注组5只、单纯细胞移植组25只、基因修饰细胞移植组25只.另取清洁级新生SD大鼠数只,用于分离培养神经干细胞.方法:除正常对照组外,其余3组大鼠按改良性线栓法制备暂时性脑缺血模型.再灌注3 d,单纯细胞移植组从右侧侧脑室每只注入20 μL神经干细胞悬液,含(4.0-5.0)×10~5个神经干细胞;基因修饰细胞移植组每只注入等量胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的神经干细胞悬液;缺血再灌注组每只注入20μL生理盐水.正常对照组、缺血再灌注组在缺血再灌注1周麻醉处死动物,单纯细胞移植组、基因修饰细胞移植组分别在缺血再灌注1,2,3,5,7周麻醉处死动物,5只/时间点.主要观察指标:采用免疫组织化学SP法观察Caspase-3在海马和额顶皮质表达及分布特点.结果:免疫组织化学染色显示,Caspase-3免疫阳性产物位于细胞核、细胞质和部分突起.在海马:单纯细胞移植组、基因修饰细胞移植组Caspase-3阳性细胞数均随再灌注时间的延长而逐渐减少;除缺血再灌注第1周外,其余各时间点基因修饰细胞移植组Caspase-3阳性细胞数均明显少于单纯细胞移植组(P<0.05).在额顶皮质:单纯细胞移植组、基因修饰细胞移植组Caspase-3阳性细胞数亦均随再灌注时间的延长而逐渐减少;除缺血再灌注第1,2周外,其余各时间点基因修饰细胞移植组Caspase-3阳性细胞数均明显少于单纯细胞移植组(P<0.05).结论:胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的神经干细胞移植通过降低Caspase-3的表达,减少神经元凋亡,从而抑制缺血性脑损伤的进行性恶化,其移植效果优于单纯神经干细胞移植.
作者：先雄斌；高小青；杨朝鲜；袁琼兰 刊期： 2009年第49期
背景:骨髓基质干细胞具有扩增迅速、分化潜能广泛等特点,因此建立骨髓基质干细胞的体外定向诱导模型有利于组织工程学研究.目的:探讨应用5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化的可能性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-06/2008-06在辽宁医学院附属第一医院中心实验室完成.材料:SD大鼠20只,由辽宁医学院实验动物中心提供.5-氮胞苷为Sigma公司产品.方法:大鼠麻醉后,分离股骨和胫骨,全骨髓法+贴壁法分离培养骨髓基质干细胞,待细胞生长融合至90%后传代扩增.取P3代骨髓基质干细胞,以2×10~4/孔密度接种于24孔培养板,分别加入5,10,15,20 μmol/L 5-氮胞苷诱导培养,同时设立不加诱导剂的空白对照,诱导24 h后更换为正常培养液继续培养至3周.主要观察指标:细胞形态及生长曲线,诱导后细胞形态变化,诱导后细胞连接蛋白43和α-横纹肌肌动蛋白的表达.结果:①培养的骨髓基质干细胞大多呈梭形,有时可见细胞融合,P3代细胞接种后第1,2天为静止生长期,从第3天开始进入对数生长期,第9天达高峰,以后进入平台期,第12天细胞数量开始减少.②5 μmol/L 5-氮胞苷诱导后,骨髓基质干细胞形态无明显变化;10 μmol/L 5-氮胞苷诱导后骨髓基质干细胞变长,宽大,并朝一个方向延伸,具有肌管形成细胞的形态特点;15 μmol/L 5-氮胞苷诱导后,24孔板周边区有少量细胞存活;20 μmol/L 5-氮胞苷诱导后细胞死亡.③经10 μmol/L5-氮胞苷诱导3周后.骨髓基质干细胞胞浆内可见连接蛋白43和α-横纹肌肌动蛋白的表达;空白对照组均呈阴性表达.结论:骨髓基质干细胞自身无法向心肌细胞方向转化,体外经5-氮胞苷诱导后具有向心肌细胞分化的潜能.5-氮胞苷浓度过低不能起到诱导分化作用,浓度过高则会造成细胞大量死亡,10 μmol/L为较适宜的诱导浓度.
作者：张凤香；李树青；孙大鹏；司忠义 刊期： 2009年第49期
背景:人骨髓内间充质干细胞含量稀少,且随着年龄增加或体质衰弱细胞数量会逐渐减少,因此进行大量扩增非常必要,但目前关于扩增后各代骨髓间充质干细胞的生物学特性是否相同仍无准确定论.目的:分析比较不同传代人骨髓间充质干细胞的生物学特性,着眼于推荐其应用于临床组织工程的实际需求.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/10在北京中医药大学附属东直门医院骨科和中心实验室完成.材料:骨髓间充质干细胞来源于非造血系统疾病的患者骨髓,由北京中医药大学附属东直门医院骨科提供.方法:从患者髂后上棘抽取骨髓,Percoll法分离培养骨髓间充质干细胞.当细胞融合至90%以上时胰酶消化传代,定期在倒置显微镜下观察各代细胞形态变化,取第2代细胞用于指标检测.主要观察指标:细胞形态及免疫表型,MTT检测细胞活性,流式细胞仪分析细胞分裂及凋亡坏死比例.结果:传代培养的骨髓间充质干细胞形态均一,呈梭形、纺锤形,克隆样生长,培养至9代后生长减慢,并出现胞浆空泡化、胞体变大等老化现象.第2代细胞表面标志CD44,CD106,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45则呈阴性.骨髓间充质干细胞增殖到第9代MTT值达到高,从第10代开始MTT值下降.细胞增殖到1 1代,分裂期细胞数量仍呈上升趋势,但从第6代开始凋亡细胞数量明显增加,第8代以后凋亡细胞数量达到60%以上.结论:通过对各代骨髓间充质干细胞生物学特性分析,推荐使用第3～6代骨髓间充质干细胞用于临床治疗使用.
作者：胡炜；俞兴；朱陵群；徐林；王硕仁 刊期： 2009年第49期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
