余其贵；王永；吴继雄
目的:脂肪间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的干细胞,在特定培养条件下可分化为骨、软骨、脂肪、神经、心肌、内皮细胞等.实验拟采用高密度、多种生长因子体外诱导兔脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化.方法:实验于2007-01/12在解放军兰州军区总医院实验中心完成.①实验材料:7 d龄乳兔6只,雌雄不限,体质量150～200 g,由兰州生物制品研究所动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:分离乳兔脂肪间充质干细胞,体外扩增至第3代,高密度诱导组按Zuk等高密度微团培养法调整细胞密度为1×1010 L-1高密度培养,加入 10 μg/L转化生长因子β1、50 μg/L胰岛素样生长因子、100 μmol/L地塞米松、50 mg/L维生素C诱导成软骨;低密度诱导组按5×108 L-1低密度培养,并加入与高密度诱导组相同的诱导剂诱导培养;高密度常规培养组按1×1010 L-1高密度加入常规培养基培养;对照组按5×108 L-1的密度接加入常规培养基培养.③实验评估:诱导7、14、21 d后观察细胞形态学变化,应用MTT法检测细胞生长曲线,RT-PCR、免疫细胞化学法检测Ⅱ型胶原表达,阿尔新蓝染色检测糖氨多糖的合成.结果:①兔脂肪间充质干细胞经诱导后生长速度减慢,由长梭形细胞变为短梭多角细胞,呈铺路石状.常规培养的脂肪间充质干细胞潜伏期为一二天,3 d为对数增殖期,第5天以后进入生长平台期.诱导的脂肪间充质干细胞潜伏期为1～3 d,4 d为对数增殖期,第6天进入平台期.②RT-PCR、免疫细胞化学法检测显示,高密度诱导组诱导14、21 dⅡ型胶原阳性表达, 阿尔新蓝染色见胞浆和细胞基质有棕黄色颗粒.低密度诱导组组诱导14、21 dⅡ型胶原弱阳性表达,阿尔新蓝染色仅少量细胞基质着色.高密度常规培养组和对照组Ⅱ型胶原与阿尔新蓝染色均为阴性.结论:高密度培养的脂肪间充质干细胞经多种生长因子诱导可以向软骨细胞分化.
作者：王海燕；耿排力；吕同德；哈小琴；张晓岩 刊期： 2008年第16期
目的:国内外研究报道,重组粒细胞集落刺激因子可以动员骨髓干细胞向脑梗死病损部位迁徙,减轻脑缺血后的脑水肿和脑损伤,但是,国内关于该类药物对脑出血后脑水肿影响的报道鲜见.观察重组粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞对大鼠脑出血后脑水肿及血肿周边区脑组织基质金属蛋白酶9表达的影响.方法:实验于2006-03/11在泸州医学院中心实验室进行.①实验材料:健康雄性SD大鼠144只,体质量(300±20)g,由泸州医学院动物科提供.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:将大鼠随机分为假手术组、脑出血组、治疗组,48只/组.脑出血组和治疗组参照Yang的方法,采用断尾取自体血方式制备大鼠脑出血模型.假手术组用生理盐水代替自体血,其余条件与脑出血组一致.治疗组于造模1h后腹腔注射重组粒细胞集落刺激因子 60μg/kg.③实验评估:检测大鼠脑组织含水量,并采用免疫组织化学法检测大鼠脑组织基质金属蛋白酶9的表达.结果:144只大鼠中共有16只大鼠脱落,其中7只大鼠术后模型评价为0级,9只死亡.均在实验过程中予以补足.①脑出血组大鼠脑组织含水量明显高于假手术组(P < 0.05),脑出血组含水量在造模后48,72 h明显,且与造模后6 h、12 h、24 h、7 d相比差异显著(P < 0.05).治疗组大鼠脑组织含水量明显低于脑出血组 (P < 0.05).②脑出血组大鼠脑组织基质金属蛋白酶9的表达明显高于假手术组(P < 0.05),在造模后48 h、72 h明显,且与6 h、12 h、24 h 、7 d相比差异显著(P < 0.05).治疗组造模后各时间点基质金属蛋白酶9的表达低于脑出血组(P < 0.05).结论:重组粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞能下调脑出血后血肿周边组织基质金属蛋白酶9的表达,并减轻脑水肿的程度.
作者：何晓英；李小刚；谭华；袁平 刊期： 2008年第16期
目的:体外诱导脐血间充质干细胞定向分化为神经元包括抗氧化剂法及细胞因子法,如何选择一种既能够如细胞因子般可广泛保护神经,又具有较强抗氧化作用的诱导剂?通过广泛筛选,观察中药单体黄芩苷对人脐血间充质干细胞体外纯化、扩增及向神经元样细胞诱导分化的作用.方法:实验于2005-02/06在南昌大学第一附属医院神经内科实验室完成.①对象及药物:无内外科并发症和传染性疾病、无血液系统疾病、乙肝表面抗原阴性、非高危妊娠、年龄23～35岁的健康孕妇足月顺产儿的脐带血10份,由南昌大学第一附属医院产科提供,孕妇及其家属对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.黄芩苷,分子量446,纯度 > 95%,由中南大学湘雅医学院药剂科提供.抗氧化添加剂β-巯基乙醇为SABC公司产品.②实验方法:无菌条件下采集胎儿脐带血,肝素抗凝,用明胶沉降+密度梯度离心两步法分离出脐血单个核细胞,经冷冻保存和复苏后,调整细胞浓度为1×109 L-1,以含20%胎牛血清、谷氨酰胺、B27、粒巨噬细胞集落刺激因子300 μg/L、干细胞因子300 μg/L的DMEM液体培养基进行纯化和扩增.按照抗氧化添加剂的不同分为4组:黄芩苷组加入黄芩苷100 μmol/L;空白对照组不添加抗氧化剂;β-巯基乙醇组添加β-巯基乙醇2 mmol/L;共培养组添加黄芩苷100 μmol/L、β-巯基乙醇2 mmol/L.连续培养4周.③实验评估:观察细胞形态学变化;采用流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志;制作细胞爬片,采用免疫细胞化学染色评价神经细胞特异性烯醇化酶、神经微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率.结果:①细胞形态学观察:脐血单个核细胞培养第2～3天开始贴壁生长,2周左右达高峰,3周后细胞生长达80%～90%融合,此时脐血原始间充质干细胞呈较均一的长梭形.4周后,黄芩苷组原来呈梭形的胞体一部分发生收缩,细胞边缘出现细的突起;一部分胞体逐渐近似圆形、锥形、三角形,伪足有多个细长突起,且发出分支,形成圆锥状终末端.β-巯基乙醇组、共培养组细胞虽然也有上述类似形态学的改变,但少量细胞存在脱落、死亡现象,且随着培养时间延长呈逐渐增加的趋势.②细胞表型检测:扩增培养4周后,空白对照组以CD45阳性细胞为主;其余3组均以CD29和CD83阳性细胞为主,其中共培养组多,黄芩苷组次之,β-巯基乙醇组少,组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.01);各组贴壁生长细胞中均未见CD34+阳性细胞.③细胞扩增培养过程中黄芩苷的预诱导效果:扩增培养4周后与黄芩苷组比较,空白对照组、β-巯基乙醇组神经细胞特异性烯醇化酶及神经微管相关蛋白2阳性细胞表达率均显著降低(P < 0.01),共培养组无明显差异 (P > 0.05).各组胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率均低于1%.结论:100 μmol/L黄芩苷可促进脐血间充质干细胞体外扩增,且随抗氧化作用时间的延长效果显著增强,同时在一定程度上还能够诱导其向神经元样细胞方向分化.
作者：颜小华；黄瑞滨；陈启文 刊期： 2008年第16期
为严格控制人类胚胎嗅鞘细胞培养和临床使用准备过程中诸多环节的质量,制定了人类胚胎嗅球嗅鞘细胞培养操作规范.因为完善的操作流程,可以大限度的减少人为因素,确保细胞质量的稳定性.所以对嗅鞘细胞来源的标本要求,要严格规定人类胚胎嗅球嗅鞘细胞培养过程中的实验室条件以及细胞培养的规范,对操作中关键步骤进行严格规范要求,质控嗅鞘细胞冻存和复苏过程,提出细胞培养中微生物污染的检测方法,减少应用风险,为人类胚胎嗅球嗅鞘细胞临床使用提供高质量保证.
作者：任玉水；田国忠；王洪美；黄红云；陈琳 刊期： 2008年第16期
目的:赤芍总苷能诱导鼠HepA和S180细胞凋亡,但赤芍总苷能否抑制K562细胞增殖及其诱导K562细胞凋亡的机制尚不明确.观察赤芍总苷诱导人红白血病细胞株K562细胞凋亡及线粒体膜电位与Ca2+水平的变化,以探讨凋亡机制.方法:实验于2007-03-02/2007-10-20在北京中医药大学细胞生化实验室,国家重点实验完成.①实验材料:赤芍总苷由西安奥晶科技发展有限公司提供,批号:060417,纯度>95%.人红白血病K562细胞株购自上海中科院细胞库.②实验方法:取对数生长期的K562细胞,培养24 h后加入50 mg/L赤芍总苷进行干预,光镜下观察细胞形态.MTT显色法检测25,50,75,100,150,200,400 mg/L赤芍总苷对K562细胞增殖的抑制作用,以仅加入无血清培养基培养的为对照.③实验评估:采用Annexin V/PI双标记法检测凋亡效应,罗丹明123(Rh123)染色流式检测线粒体膜电位和荧光染料Fluo-3AM流式检测K562细胞内游离Ca2+浓度.结果:①50 mg/L 赤芍总苷作用K562细胞24 h后,出现核固缩、核碎裂和凋亡小体等形态学改变.②与对照组相比,不同质量浓度赤芍总苷能明显抑制K562细胞的增殖(P < 0.01),并具有量效关系,呈时间和剂量依赖性.③细胞线粒体经Rh123染色呈现明亮绿,不同质量浓度赤芍总苷干预组荧光强度均较对照组明显减弱,膜电位水平较高.④赤芍总苷可引起细胞线粒体膜电位下降.不同质量浓度赤芍总苷组细胞内游离Ca2+浓度均升高, 线粒体膜电位下降,与对照组比较差异显著(P < 0.01).结论:赤芍总苷诱导K562细胞凋亡的可能机制是通过减低细胞内线粒体膜电位及提高游离Ca2+水平,从而导致细胞凋亡.
作者：许惠玉；陈志伟；牛建昭；邹宇；孙勇伟；彭波 刊期： 2008年第16期
背景:诱导因子及软骨微环境是影响骨髓基质干细胞成软骨分化及软骨形成的主要因素.目的:利用少量软骨细胞以共培养方式诱导骨髓基质干细胞体内成软骨.设计、时间及地点:2004-09/2005-03在解放军第四军医大学口腔医院病理教研室完成的随机对照动物实验.材料:选择清洁级新西兰兔15只用于细胞支架复合物的种植,随机分为混合细胞组、软骨细胞组、骨髓基质干细胞组,5只/组.取新生1～3 d龄新西兰兔5只用于骨髓基质干细胞、软骨细胞的分离培养.聚羟基乙酸无纺网支架为上海易括公司产品,材料直径15 μm,平均间距150～200 μm,孔隙率97%,厚2 mm.方法:混合细胞组将骨髓基质干细胞与软骨细胞按3:1混匀,调整细胞密度为6.0×1010 L-1,接种于经培养液预湿的塑形聚羟基乙酸 5 mm×5 mm的支架上,然后在复合物周围滴加含胎牛血清的DMEM液培养1周.软骨细胞组、骨髓基质干细胞组的细胞密度调整为6.0×1010 L-1后同法接种于支架上.各组兔麻醉后于背部一侧皮下组织植入对应的细胞-支架复合物.主要观察指标:植入后第8周行新生软骨大体观察和苏木精-伊红、Masson三色染色.结果:各组细胞与聚羟基乙酸支架黏附情况良好.植入8周后,混和培养组和软骨细胞组均形成了成熟的软骨样组织,并基本保持复合物初始的大小和形状,两组新生软骨外观及组织学特征较接近.骨髓基质干细胞组在体内培养过程中未形成软骨组织,而是形成了纤维结缔组织.结论:骨髓基质干细胞与软骨细胞按3:1混合形成的微环境,能有效诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化,并促进骨髓基质干细胞的体内成软骨.
作者：倪云峰；李小飞；刘源；雷战军；卢强 刊期： 2008年第16期
目的:脂肪干细胞来源于成脂细胞,取材容易,已经成为干细胞研究一个新的方向.观察脂肪干细胞移植脑冻伤大鼠的脑组织局部组织学变化以及神经行为学变化.方法:实验于2006-01/2007-08在中南大学湘雅医院神经病学实验室完成.①实验材料:SD大鼠,雌雄不限,体质量300 g左右,由中南大学湘雅医学院动物学部提供.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:体外培养并传代SD大鼠脂肪干细胞,并用BrdU标记.制作大鼠的脑冷冻伤模型,实验组在冷冻伤动物脑内移植脂肪干细胞,对照组在冷冻伤动物脑内移植培养基,假手术组仅行颅骨开窗,每组15只.③实验评估:分别在移植细胞后1,3,5,7,14,30 d对实验动物进行NSS神经行为学评分,并制作脑组织切片,行免疫荧光染色检测BrdU阳性细胞.采用Tunel染色检测凋亡细胞,脑组织RT-PCR检测血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子等因子mRNA表达.结果:①与对照组相比,实验组大鼠在3～14 d NSS神经行为学评分降低(P < 0.05).②免疫荧光检测显示,Brdu标记的脂肪干细胞在大鼠脑组织内存活并且迁移.③Tunel法检测显示,3 d后实验组凋亡细胞数目明显少于其他组.④RT-PCR检测显示,与其他两组比较,移植脂肪干细胞的大鼠脑组织中血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子表达更高.结论:脂肪干细胞可以在中枢神经系统中存活,并分化为神经元样细胞,它可以引起血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子等因子的高表达从而减少细胞凋亡,加速神经功能修复过程并达到保护脑组织的目的.
作者：周向阳；邓永文；方芳；王飞；陈若琨；宋涛；方加胜 刊期： 2008年第16期
目的:茶黄素是红茶中的主要成分,具有调节血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗心脑血管疾病等多种药理活性.以往茶黄素对人体内脂肪代谢的影响多数属于宏观分析,实验在细胞水平上探讨茶黄素对兔骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化的影响.方法:实验于2007-05/09在安徽医科大学附属省立医院中心实验室完成.①动物:清洁级4～8周龄家兔10只,由安徽医科大学动物试验中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:兔全身肝素化后麻醉状态下处死,取双侧股骨胫骨和肱骨,去除软组织,切除包括骺板在内的两侧骺端,采用全骨髓法分离培养骨髓基质干细胞,按2×108 L-1密度接种,当细胞生长至80%～90%融合时消化传代.取传至3代的细胞按1×105/cm2密度接种,加入含重组人胰岛素 10 mg/L、地塞米松10-6 mol/L、0.5 mmol/L IBMX的DMEM成脂诱导液培养2周.设立3组:脂肪对照组单纯放入成脂诱导液1 mL;茶黄素组向1 mL成脂诱导液中加入500μg/L茶黄素;空白对照组仅加入等量普通DMEM培养液.③实验评估:取第2代培养细胞绘制生长曲线;油红O染色对诱导的脂肪细胞进行鉴定,计算脂肪细胞转化率.结果:①细胞生长曲线:骨髓基质干细胞具有旺盛的增殖能力,培养1 d为细胞适应期,3 d后为对数增长期,8 d时进入平台期,之后细胞增殖迅速减慢,细胞数下降.②脂肪细胞油红O染色鉴定结果:脂肪细胞中的脂滴被染成橙红色,胞核为蓝色.脂肪对照组多数骨髓基质干细胞诱导为脂肪细胞,转化率为(64.8±4.8)%,茶黄素组仅为(32.0±3.4)%,空白对照组未见明显脂肪细胞形成.结论:茶黄素可明显抑制兔骨髓基质干细胞向脂肪细胞方向的分化.
作者：李府；尚希福；谢涛 刊期： 2008年第16期
目的:目前对于体外诱导分化的多巴胺能神经元的生物学功能、体内存活状况,以及与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠的疗效比较方面尚缺乏深入的研究.观察神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠的作用,并与胚胎中脑多巴胺能神经元组织移植治疗帕金森病大鼠的疗效进行比较.方法:实验于2006-06/2007-09在中山大学附属第一医院完成.①实验材料:健康成年雄性SD大鼠及孕14～15 d的SD大鼠由中山大学动物实验中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:在含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中培养胚胎大鼠中脑神经干细胞.经传代扩增后,在含白细胞介素1a、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中向多巴胺能神经元分化,并进行免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测.参考Sauer和Lee等方法制备帕金森病大鼠模型,并将造模成功大鼠随机分组,每组9只:分化细胞组向每一坐标点注入1×1011 L-1神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元;胚胎中脑组注入 1×1011 L -1胚胎中脑多巴胺能神经元;手术对照组注入DMEM/F12细胞培养液.③实验评估:移植术后10、20、40、60 d诱发大鼠不对称旋转行为以观察治疗效果,并对移植区进行酪氨酸羟化酶免疫组织化学检测以了解移植细胞体内存活的情况.结果:①大鼠神经干细胞球在诱导分化液中呈贴壁生长,球内细胞从球体中央逐渐向四周分化扩展出形态各异的细胞.免疫细胞化学染色显示,分化细胞中含有酪氨酸羟化酶染色阳性细胞.流式细胞仪检测诱导分化6 d的细胞中酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比率为(16.7±2.8)%.②移植后20 d分化细胞组大鼠的不对称旋转行为开始明显下降(P < 0.05).移植后40 d和60 d,分化细胞组大鼠的旋转圈数与胚胎中脑组比较差异不显著(P > 0.05).③分化细胞组和胚胎中脑组大鼠纹状体移植区有酪氨酸羟化酶染色阳性细胞,多数细胞位于移植针道边缘.结论:神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠具有相同的疗效.
作者：柯春龙；陈白莉；金华伟；郭少雷 刊期： 2008年第16期
目前人们对肝干细胞的分化潜能及特性已形成共识,但体外分离培养肝干细胞的方法还不成熟,肝干细胞体外分离培养方法的建立是在体外条件下对肝干细胞的生物学特性进行深入研究的前提和基础.肝细胞生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素、转化生长因子等细胞生长因子对肝干细胞的体外培养、生长和分化可能具有重要的调控作用.肝干细胞在一定条件下可以转化为肝癌细胞,肝干细胞在肝癌的发生中起着非常重要的作用.肝干细胞移植研究为肝细胞移植、生物型人工肝、肝癌靶向基因治疗提供细胞来源.
作者：陈强 刊期： 2008年第16期
目的:国内外对骨髓间充质干细胞体外成功诱导分化为胰岛素分泌细胞的报道屡见不鲜,但这些诱导方法都比较繁琐,而且大多都应用了细胞因子.实验拟验证体外非细胞因子方法诱导骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的可能性.方法:实验于2005-11/2007-01在大连医科大学诊断学实验中心,校一级实验室完成.①实验材料:4～6周龄Wistar大鼠由大连医科大学实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:无菌条件下取大鼠的骨髓细胞,并通过贴壁时间差异性去除单核细胞从而获得骨髓干细胞.应用二甲基亚砜及高糖环境依次对大鼠骨髓间充质干细胞进行体外诱导,以直接加入含体积分数为0.10胎牛血清的L-DMEM培养基培养的为对照.③实验评估:通过形态、双硫腙染色、免疫组织化学及RT-PCR方法对诱导后的细胞进行检测,采用ELISA方法对诱导后细胞分泌的胰岛素进行检测. 结果:①培养10 d时,诱导组细胞呈细胞团样改变,内层的细胞为圆形,外层的细胞呈长梭形并包绕着内层细胞.对照组细胞也呈团样改变,但形态不规则,呈发散状,细胞呈梭形类似骨髓间充质细胞.②诱导组的细胞团双硫腙染色后呈明显猩红色,对照组形成的细胞团双硫腙染色不显色.③诱导组成团及单个存在的圆形和梭形细胞中有胰岛素存在,对照组细胞团及未成团细胞中无胰岛素存在.④在内参蛋白GAPDH表达量大致相等的条件下,诱导组诱导的细胞表达Ins1和Ins2,对照组培养的细胞不表达Ins1和Ins2.⑤ELISA法证实诱导后细胞向胞外分泌胰岛素,与对照组比较差异显著(P < 0.05).结论:大鼠骨髓间充质干细胞体外经过二甲基亚砜和高糖环境诱导可分化为胰岛素分泌细胞.
作者：张伟；苏本利；孟秀香；刘奔；刘丹丹；王莺燕；范颖 刊期： 2008年第16期
目的:应用原始生殖细胞进行全能干细胞的研究具有与胚胎干细胞同样广阔的前景,尤其适合于难以从囊胚内细胞团中分离培养胚胎干细胞的动物.但胚胎生殖细胞体外培养条件一直是制约这方面发展的瓶颈.实验设计了体外有效扩增小鼠原始生殖细胞的方法,拟搭建稳定高效的原始生殖细胞培养平台.方法:实验于2006-10/2007-08在重庆医科大学组织胚胎学教研室重庆市生物化学分子药理学重点实验室完成.①实验材料:清洁级昆明孕鼠由重庆医科大学动物实验中心提供,见阴栓计为0.5 d胚龄,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:取胚龄8.5 d胎鼠尾端尿囊及周围组织, 取胚龄9.5～10.5 d胎鼠后肠及周围组织,取胚龄11.5 d,12.5 d胎鼠生殖嵴及周围组织,分别经0.25%胰酶-0.02%EDTA消化并接种于0.1%明胶包被的培养皿中.比较不同妊娠时间点取材对原代、F1代胚胎生殖细胞克隆形成的影响.采用SSEA-1免疫组织化学法计数细胞阳性率,计数胚胎生殖细胞克隆联合MTT法比较胚龄11.5 d,12.5 d两个时间点原始生殖细胞的增殖能力.比较上述两种取材培养方法对胚龄11.5 d,12.5 d原始生殖细胞扩增的影响.采用碱性磷酸酶染色、免疫组化检测SSEA-1、免疫荧光检测Nanog,体外分化实验鉴定分化能力.结果:①胚龄11.5 d,12.5 d胎鼠原代和F1代集落形成率较胚龄8.5～10.5 d高,扩增效率显著提高(P < 0.01).②免疫组织化学法检测分离的胚龄11.5 d,12.5 d原始生殖细胞 SSEA-1阳性率差异不显著 (P > 0.05).原代第3天克隆计数显示,胚龄11.5 d胎鼠高于12.5胚龄胎鼠 (P < 0.01),MTT数据显示11.5胚龄组稍高于12.5胚龄组.③两种方法对胚龄11.5 d,12.5 d胎鼠胚胎生殖细胞集落形成无显著性差异(P > 0.05),但生长方式有所不同.④克隆胚胎生殖细胞呈典型的胚胎干细胞样集落生长,能稳定传代;碱性磷酸酶、SSEA-1、Nanog表达强阳性;体外能分化为囊状类胚体.结论:胚龄11.5 d和12.5 d胎鼠,尤其是胚龄11.5 d胎鼠扩增原始生殖细胞效率较高,在这两个时间点运用与周围组织共培养法和生殖嵴分离培养法均适宜.
作者：王璐；刘永刚；李芳菲；姜蓉；王亚平 刊期： 2008年第16期
目的:回顾性分析化疗后骨髓抑制期输注体外扩增的异基因骨髓间充质干细胞治疗低增生性复发难治性急性髓细胞白血病的可行性与安全性.方法:①53岁女性患者1例,2002-01在南京医科大学第一附属医院确诊为急性髓细胞性白血病M0型,予HA、EA等诱导方案化疗后达完全缓解,在随后的4年中给予包括MA、中剂量Ara-C、DA、TA在内的多次巩固治疗以维持完全缓解.2006-01中性粒细胞缺乏,白血病复发.同年3月再次给予TAE方案诱导治疗未缓解,骨髓持续低增生,并持续粒细胞缺乏达半年.②患者有一位HLA配型完全相合的同胞姐姐,为行异体造血干细胞移植,于2006-07再次入院,患者及其家属对治疗知情同意,实验经医院伦理委员会批准.③患者于2006-08-23予CAG方案化疗,即阿柔比星10 mg/d,×8 d;阿糖胞苷15 mg/次,2次/d,×14 d;2006-08-23～2006-09-25给予洁欣300 μg/d.化疗过程中骨髓抑制进一步加重,并出现霉菌性败血症等重症感染.抗感染治疗的同时,于CAG化疗结束后第2天输注经体外扩增的异基因骨髓间充质干细胞,细胞数为1.4×106/kg受者体质量,以促进骨髓造血恢复支持治疗.结果:异基因骨髓间充质干细胞输注后第15天,中性粒细胞数达到半年多来第1次大于0.5×109 L-1.输注1个月后,外周血白细胞数5.5×109 L-1,中性粒细胞数4.64×109 L-1,血红蛋白量94 g/L,血小板数25×109 L-1,外周血象渐恢复正常水平.复查骨髓涂片显示骨髓三系增生活跃,原始细胞占0.4%,骨髓流式细胞仪检查MRD阴性,骨髓达完全缓解,感染症状逐渐控制.随访半年,患者持续完全缓解,未有移植物抗宿主病等并发症出现.结论:CAG方案联合输注体外扩增的异体骨髓间充质干细胞有助于衰竭骨髓的造血重建,对长期反复化疗后出现低增生性复发难治急性白血病患者的治疗是一个新的有前途的方法,但其安全性与有效性需要通过临床试验进一步证实.
作者：陆世丰；陆化；刘澎；沈文怡；洪鸣；张建富；杨慧；李建勇 刊期： 2008年第16期
目的:糖尿病及大血管病变是自身免疫反应介导的炎症反应, 近年研究表明,糖尿病的各种并发症与血糖的波动性有密切关系.文章拟进一步对比观察波动性高血糖和稳定高血糖对树突状细胞分化成熟及免疫功能的影响.方法:实验于2006-12/2007-09在佛山市第一人民医院中心实验室完成.人外周血样品取自中山大学肿瘤防治中心健康医务工作者, 年龄27～35岁, 共12份,所有抽血者对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准.①实验方法:从健康人新鲜血分离外周血单个核细胞,并将其在含重组人粒巨噬细胞集落刺激因子和重组人白细胞介素的完全培养基中培养为不成熟树突状细胞.将不成熟树突状细胞分别在含有正常血糖(5.5 mmol/L葡萄糖),稳定性高血糖(20 mmol/L葡萄糖),波动性高血糖(5.5 mmol/L和20 mmol/L葡萄糖交替作用)的完全培养基中培养48h.②实验评估:采用流式细胞术检测树突状细胞表型.以混合淋巴细胞反应强度观察树突状细胞对淋巴细胞增殖的影响.采用ELISA法检测细胞培养上清细胞因子白细胞介素12浓度.结果:①与正常血糖组比, 稳定性高血糖组和波动性高血糖组树突状细胞表面协同刺激分子CD86表达、特征性表面标志CD1a、成熟度标志CD83以及HLA-DR表达明显增高(P < 0.01).波动性高血糖组对树突状细胞的作用明显高于稳定性高血糖组(P < 0.05).②与正常血糖组相比,稳定性高血糖组和波动性高血糖组可激发强烈的异种T淋巴细胞的增殖反应( P < 0.01),随着细胞数的增多,促增殖作用增强;波动性高血糖组激发混合淋巴细胞反应的强度明显大于稳定性高血糖组(P < 0.05).③20 mmol/L葡萄糖或5.5 mmol/L葡萄糖和20 mmol/L葡萄糖交替培养干预后的树突状细胞分泌细胞因子白细胞介素12明显高于正常血糖组(P < 0.05).结论:波动性高血糖和稳定性高血糖均可促进和增强树突状细胞的成熟分化和免疫功能,波动性高血糖的效果更加明显.
作者：梁明；栾晓军；陈小雨；梁敏 刊期： 2008年第16期
背景:造血干细胞移植使恶性血液病的预后得到很大的改观,外周血造血干细胞移植逐渐取代了骨髓移植而成为造血干细胞移植的主要方式.目的:观察自体或异基因外周血造血干细胞移植对53例恶性血液病患者的治疗效果.设计:随机对照观察.单位:郑州大学第一附属医院血液科骨髓移植中心.对象:选择2003-07/2006-05在郑州大学第一附属医院血液科收治的53例恶性血液病患者,男33例,女20例,平均37岁.35例患者行异基因外周血造血干细胞移植,其中急性髓细胞性白血病13例、急性淋巴细胞白血病7例、慢性粒细胞白血病10例、多发性骨髓瘤2例、骨髓增生异常综合征3例.18例患者行自体外周血造血干细胞移植,其中急性髓细胞性白血病7例、急性淋巴细胞白血病6例、多发性骨髓瘤2例、非霍奇金病3例.33名供者与受者HLA配型完全相合,2名1个位点不合,男20例,女13例,平均35岁.性别不相合者16例.实验经过医院伦理委员会批准许可,所有受试对象均对检测项目知情同意.方法:①利用粒系集落刺激因子或化疗联合粒系集落刺激因子动员外周血干细胞,自体移植患者接受CD34+细胞中位数为3.0×106/kg,异基因移植患者接受CD34+细胞中位数为6.2×106/kg;自体移植采用MAC预处理方案,异基因移植采用改良的Bu/Cy预处理方案;移植物抗宿主病的预防采用甲氨喋呤、环孢菌素A联合骁悉,1例1位点不合患者加用抗淋巴细胞球蛋白.②观察患者移植后中性粒细胞＞ 0.5× 109 L-1和血小板＞20×109 L-1恢复时间.③观察患者移植物抗宿主病发生情况.④术后1年随访所有患者复发情况.主要观察指标:①中性粒细胞和血小板恢复时间.②移植后移植物抗宿主病发生情况.③随访结果.结果:纳入患者53例均进入结果分析.①自体移植患者移植后中性粒细胞＞ 0.5×109 L-1、血小板＞ 20×109 L-1的恢复时间分别为13和19 d,在异基因移植患者中分别为12和15 d.②异基因移植患者中Ⅰ～Ⅲ度急性移植物抗宿主病的发生率为31.4%,慢性移植物抗宿主病的发生率为71.4%.③术后患者自体移植和异基因移植患者复发率分别为38.9%和5.7%.结论:自体或异基因外周血造血干细胞移植较快建立恶性血液病患者造血能力,是治疗恶性血液病的重要手段.
作者：谢新生；万鼎铭；孙慧；孙玲；刘林湘；姜中兴 刊期： 2008年第16期
目的:梭华-Sofast是新一代阳离子聚合物转染试剂,具有高效率转染所必备特征,如浓缩DNA,将DNA运送到细胞内,并使其在细胞核内释放等,且细胞毒性很低,很稳定,不被血清清除等特点.观察梭华-Sofast介导绿色荧光蛋白转染骨髓间充质干细胞的转染效果及细胞毒性.方法:实验于2006-03-01/12-31在福建医科大学神经生物学研究中心完成.①实验材料:实验动物选用清洁级健康雄性SD大鼠10只,二三月龄,体质量150～250 g,由福建医科大学实验动物中心提供.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:SD大鼠10只,用密度梯度离心及贴壁法相结合的方法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,分别以Sofast、阳离子聚合物Jet PEI、Superfect和阳离子脂质体Lipofectamine 2000为转染试剂,转染绿色荧光蛋白入骨髓间充质干细胞,倒置荧光显微镜下检测转染细胞的绿色荧光蛋白基因表达,并通过MTT法检测转染细胞毒性.结果:梭华-Sofast、阳离子聚合物Jet PEI、Superfect和阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导的绿色荧光蛋白能有效转染入骨髓间充质干细胞,转染效率分别为(85.62±8.76 )%、(73.34±7.32)%、(75.61±7.79)%和(76.62±8.21)%,梭华-Sofast转染率高(P < 0.05);转染细胞的存活分数分别为(92.18±9.27)%、(86.98±8.54)%,(87.84±8.59)%和(87.17±8.61)%,梭华-Sofast细胞毒性低(P < 0.05).结论:梭华-Sofast介导绿色荧光蛋白转染骨髓间充质干细胞具有高转染效率和低细胞毒性的优点.
作者：吴碧莲；陈少强；贾小力 刊期： 2008年第16期
目的:Nur77是介导T细胞凋亡的重要基因,它的激活需要第二信使钙离子,而Nur77基因启动子的钙反应元件是转录因子肌细胞增强因子2D的结合位点.探讨在Nur77诱导T细胞凋亡过程中肌细胞增强因子2D是否可以被乙酰化,以及通过调节Nur77基因乙酰化对T细胞凋亡的影响.方法:实验于2006-11/2007-09在吉林大学第一医院血液肿瘤科完成.①材料:大肠杆菌DH5α、pcDNA3质粒由吉林大学第一医院中心研究室保存.pET32M质粒、Flag-p300质粒、pSilencerTM-p300 RNAi质粒由香港科技大学Zhengguo Wu博士馈赠.NFATp质粒由哈佛大学Yun Chen博士馈赠.Jurkat细胞由吉林大学第一医院血液肿瘤科提供.②实验方法:PCR法产生全长的Nur77和依赖Nur77的荧光报告基因被亚克隆到pcDNA质粒中,产生的肌细胞增强因子2D(1-514)、(1-121)、(1-300)、(301-514)各片段以及含4个赖氨酸(K245/K250/K267/K279)位点突变为精氨酸位点的肌细胞增强因子2D (4KR)突变体亚克隆到pcDNA后在氨基端含有Flag抗原簇,于细菌表达载体上进行质粒构建,验证正确的质粒使用脂质体DMRIE-C进行转染.③实验评估:将Nur77荧光报告基因与肌细胞增强因子2D、p300、NFATp共转染到Jurkat细胞中,检测p300对肌细胞增强因子2D促进Nur77转录的影响.免疫沉淀法检测内源性肌细胞增强因子2D是否能够被乙酰化,以及阻滞p300表达后是否影响其乙酰化.体外乙酰化法检测肌细胞增强因子2D的乙酰化位点.荧光素报告分析法检测肌细胞增强因子2D的乙酰化功能缺失对Nur77转录活性的影响.采用流式细胞仪检测其功能缺陷对Nur77诱导T细胞凋亡的影响.结果:①肌细胞增强因子2D与NFATp的二聚体虽然不能促进Nur77的转录,但p300、NFAT、肌细胞增强因子2D的三聚体却能明显促进Nur77的转录,且p300与肌细胞增强因子2D的二聚体也明显促进Nur77的转录.②PMA/Iono活化钙信号传导通路后,肌细胞增强因子2D被乙酰化.当内源性p300RNAi后,p300的表达被阻滞时,肌细胞增强因子2D的乙酰化水平显著下降.③K245,K250,K267,K279氨基酸同时突变可以使肌细胞增强因子2D乙酰化程度大部分丧失,说明在体外这4个赖氨酸位点是肌细胞增强因子2D的主要乙酰化位点.④与空载体比较,转染乙酰化缺陷的肌细胞增强因子2D可使Nur77转录功能提高2.48倍;与转染野生型的肌细胞增强因子2D比较,转染乙酰化缺陷的肌细胞增强因子2D能降低Nur77基因70.4%的转录功能.⑤与空载体比较,Nur77表达能够促进T细胞凋亡,早晚期凋亡之和从4.3%提高至16.3%;共表达野生型肌细胞增强因子2D与Nur77能够进一步促进T细胞的凋亡,早晚期凋亡之和从16.3%提高到31.0%;但肌细胞增强因子2D乙酰化功能缺失的突变体肌细胞增强因子2D明显降低Nur77介导的T细胞凋亡,早晚期凋亡之和从16.3%降低到9.2%.结论:p300对肌细胞增强因子2D促进Nur77的转录起主要作用.肌细胞增强因子2D在Nur77诱导的T细胞凋亡过程中可以被乙酰化,乙酰化的肌细胞增强因子2D通过上调Nur77基因的转录来促进T细胞凋亡.
作者：杨艳萍；王冠军；马克威 刊期： 2008年第16期
背景:目前临床上II度根分叉病变区牙周组织的再生仍是一项难题.目的:比较不同密度自体骨髓间充质干细胞修复II度牙根分叉病变区牙周组织缺损的能力.设计:随机对照观察实验.单位:福建医科大学附属口腔医院实验室和福州总医院动物实验科.材料:实验于2005-07/2006-09在解放军南京军区福州总医院动物实验科和福建医科大学附属口腔医院实验室完成.6只1岁半雄性Beagle犬由解放军南京军区福州总医院动物实验科提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.实验中选用Bio-Gide胶原膜和BME-10X胶原膜.方法:在犬的下颌第2,3前磨牙和第1磨牙颊侧根分叉处制备慢性II度牙根分叉病变模型.从6只18月龄的Beagle犬抽取自体骨髓间充质干细胞.应用5×108 L-1,5×109 L-1,5×1010 L-1的骨髓间充质干细胞复合BME-10X胶原膜移植治疗牙根分叉病变,表面覆盖Bi0-Gide胶原膜,单纯Bi0-Gide胶原膜组为对照组.采用OLYPUS IX 71显微照相系统和OLYSIA BioAutoCell软件计算新生牙骨质长度的百分比和新生牙槽骨面积的百分比.主要观察指标:苏木精-伊红染色观察并测量牙周组织再生(新生牙骨质长度和新生牙槽骨面积的百分比)情况.结果:对照组的新生牙骨质长度和新生牙槽骨面积的百分比分别为:(51.5±5.6)%和(27.1±7.7)%;5×108 L-1骨髓间充质干细胞组为:(84.8±8.9)%和(30.6±7.7)%; 5×109 L-1骨髓间充质干细胞组为:(91.8±5.2)%和(68.3±11.4)%;5×1010 L-1骨髓间充质干细胞组为:(88.8±7.2)%和(78.5±12.7)%.细胞组的新生牙骨质量与对照组相比,差异有显著性意义(P < 0.01),但各细胞组间相互比较差异无显著性意义;5×109 L-1组和5×1010 L-1组的新生牙槽骨量与 5×108 L-1组和对照组相比差异有显著性 (P < 0.05),但前两组间和后两组间比较则差异无显著性意义.结论:骨髓间充质干细胞移植能促进牙根分叉病变区的牙周组织再生,其作用与细胞的接种密度有关.
作者：詹暶；闫福华；肖毅 刊期： 2008年第16期
目的:大量研究表明,类胰岛素生长因子I促成肌细胞增殖作用明显,低浓度水平就有活性,但是对于其作用机制目前还不太清楚.应用流式细胞仪碘化丙啶染色法(PI法)检测成肌细胞生长周期,拟探讨类胰岛素生长因子I对原代及传代人胚骨骼肌成肌细胞体外增殖的作用与机制.方法:实验于2004-06/12在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室、干细胞与组织工程研究室以及成都市第三人民医院检验科流式细胞室完成.在产妇知情同意的前提下,选取孕8～12周水囊引产胎儿,性别不限,切取部分小腿腓肠肌与股四头肌组织后,采用文献的方法进行成肌细胞分离、纯化与传代培养,实验经医院伦理委员会批准.选取原代、第2、4、6代成肌细胞以1×105 /孔密度接种于24孔板,每3孔为1组计7组.1～7组细胞以无血清F12培养基同步化后分别予以含0,1,2,4,8,16,32 μg/L类胰岛素生长因子I的培养基,运用核素掺入法确定类胰岛素生长因子I促增殖的适宜浓度用于实验.同步化后其中一板的生长培养基不加类胰岛素生长因子I作为对照组;另一个加入适宜浓度的类胰岛素生长因子I作为实验组.每组每天取3孔细胞计数,绘制生长曲线,推算成肌细胞的群体倍增时间,作为细胞增殖周期TC.运用流式细胞技术PI法分别测定细胞生长周期和各亚周期时相时间.结果:4～8 μg/L 类胰岛素生长因子I具有良好促进成肌细胞增殖的能力.各代的实验组与对照组成肌细胞在24 h后进入对数生长期,各实验组细胞生长曲线明显左移.6代以内成肌细胞的增殖周期、各亚周期细胞百分比、各亚周期所占时相以及各代细胞对类胰岛素生长因子I的反应一致,生长模式与能力一致,细胞倍增时间平均从4.8 d缩短到3.3 d.结论:类胰岛素生长因子I能促进成肌细胞体外增殖,成肌细胞的增殖指数明显提高.其促增殖作用是通过缩短DNA合成前期和合成期来实现的.
作者：张峻梅；岑石强；杨志明；解慧琪；唐方 刊期： 2008年第16期
背景:骨髓基质细胞能透过血脑屏障在脑中存活并迁移至脑梗死区,而在脑梗死区转化生长因子β1的增加将有助于减轻神经元的损害.目的:观察静脉移植骨髓基质细胞对大鼠脑缺血再灌注损伤神经元转化生长因子β1的影响.设计、时间及地点:随机对照设计,于2005-09/2006-03在中国医科大学实验动物中心完成.材料:清洁级成年Wistar大鼠36只,随机分为模型对照组、盐水组、细胞移植组,12只/组.另取2月龄Wistar大鼠2只用于制备骨髓基质细胞.方法:贴壁法+胰蛋白酶消化分离培养骨髓基质细胞,传至3～5代用于实验,移植前24 h向培养基中加入BrdU进行体外标记.采用改良线栓法建立左侧大脑中动脉梗死大鼠模型,造模后24 h,细胞移植组于尾静脉输入浓度为3×109 L-1骨髓基质细胞悬液1 mL,盐水组尾静脉注射1 mL生理盐水,模型对照组不给予任何处理.主要观察指标:免疫组化染色检测BrdU阳性细胞及转化生长因子β1的表达,原位TUNEL法检测神经细胞凋亡情况.结果:造模后3 d,细胞移植组脑梗死灶周围可见大量BrdU阳性细胞,盐水组及模型对照组未见BrdU阳性细胞;细胞移植组转化生长因子β1的表达明显高于盐水组及模型对照组(P < 0.01);细胞移植组纹状体梗死区神经细胞凋亡数明显低于盐水组及模型对照组(P < 0.01).结论:经静脉移植的骨髓基质细胞可选择性进入脑缺血区,增强脑损伤区转化生长因子β1的表达,从而减少神经细胞的凋亡.
作者：陈敬；赵彬 刊期： 2008年第16期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
