周向阳；邓永文；方芳；王飞；陈若琨；宋涛；方加胜
目的:国内外对骨髓间充质干细胞体外成功诱导分化为胰岛素分泌细胞的报道屡见不鲜,但这些诱导方法都比较繁琐,而且大多都应用了细胞因子.实验拟验证体外非细胞因子方法诱导骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的可能性.方法:实验于2005-11/2007-01在大连医科大学诊断学实验中心,校一级实验室完成.①实验材料:4～6周龄Wistar大鼠由大连医科大学实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:无菌条件下取大鼠的骨髓细胞,并通过贴壁时间差异性去除单核细胞从而获得骨髓干细胞.应用二甲基亚砜及高糖环境依次对大鼠骨髓间充质干细胞进行体外诱导,以直接加入含体积分数为0.10胎牛血清的L-DMEM培养基培养的为对照.③实验评估:通过形态、双硫腙染色、免疫组织化学及RT-PCR方法对诱导后的细胞进行检测,采用ELISA方法对诱导后细胞分泌的胰岛素进行检测. 结果:①培养10 d时,诱导组细胞呈细胞团样改变,内层的细胞为圆形,外层的细胞呈长梭形并包绕着内层细胞.对照组细胞也呈团样改变,但形态不规则,呈发散状,细胞呈梭形类似骨髓间充质细胞.②诱导组的细胞团双硫腙染色后呈明显猩红色,对照组形成的细胞团双硫腙染色不显色.③诱导组成团及单个存在的圆形和梭形细胞中有胰岛素存在,对照组细胞团及未成团细胞中无胰岛素存在.④在内参蛋白GAPDH表达量大致相等的条件下,诱导组诱导的细胞表达Ins1和Ins2,对照组培养的细胞不表达Ins1和Ins2.⑤ELISA法证实诱导后细胞向胞外分泌胰岛素,与对照组比较差异显著(P < 0.05).结论:大鼠骨髓间充质干细胞体外经过二甲基亚砜和高糖环境诱导可分化为胰岛素分泌细胞.
作者：张伟；苏本利；孟秀香；刘奔；刘丹丹；王莺燕；范颖 刊期： 2008年第16期
目的:关节软骨创伤难以自行修复,传统疗法因修复的组织以纤维软骨为主,缺少正常透明软骨的力学性能及耐用性.种子细胞是组织工程化软骨形成的首要条件,为此拟建立一套较为简便、有效和实用的脐血间充质干细胞体外分离培养体系,探讨其向软骨细胞分化的可行性.方法:实验于2005-07/2006-09在右江民族医学院组织学与胚胎学教研室完成.①细胞来源:无妊娠并发症足月分娩后的胎盘脐静脉血,均征得供者同意,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:穿刺抽取15 mL脐带血,密度梯度法分离吸取分层界面的白色环形絮状物,其中富含单个核细胞,离心后沉积细胞用含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM高糖培养基悬浮,调整细胞密度为1×109 L-1接种于25 T培养瓶内,放置在37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养,72 h后更换培养基,去除红细胞及其他未贴壁细胞,至70%～80%融合时传代.③实验评估:取传至第2代的脐带血间充质干细胞进行增殖能力检测;加入含终浓度为100 μg/L胰岛素样生长因子1,15%胎牛血清的DMEM软骨细胞诱导培养基,倒置显微镜下连续观察细胞生长情况,并行苏木精-伊红染色,应用扫描电子显微镜对诱导后细胞进行鉴定.结果:①细胞形态学观察:来源于脐血的单个核细胞接种24 h少量贴壁,近似圆形或短梭形;体外培养3 d后可见分散的间充质干细胞小集落,集落细胞为长梭形,呈放射状生长;2周后细胞集落彼此融合,呈旋涡状或菊花状生长.传代后3周细胞基本融合成层.②细胞增殖能力检测:脐带血间充质干细胞传代后8～12 h贴壁,7～13 d细胞处于对数生长期,16～19 d进入平台期,扩增速度快于原代培养,倍增时间为8.5 d.③脐带血间充质干细胞向软骨细胞诱导分化结果:胰岛素样生长因子1诱导12 d,脐带血间充质干细胞苏木精-伊红染色可见分泌少量细胞外基质.扫描电子显微镜下呈现软骨细胞特点,多边形,外围被分泌细胞外基质所围绕,呈蜘蛛网样.结论:从人脐带血中成功分离获取间充质干细胞,在体外经胰岛素样生长因子1条件培养液诱导短期内可获得软骨细胞.
作者：解继胜；黄海玲；唐毓金；陈维平；罗小琼 刊期： 2008年第16期
目的:糖尿病及大血管病变是自身免疫反应介导的炎症反应, 近年研究表明,糖尿病的各种并发症与血糖的波动性有密切关系.文章拟进一步对比观察波动性高血糖和稳定高血糖对树突状细胞分化成熟及免疫功能的影响.方法:实验于2006-12/2007-09在佛山市第一人民医院中心实验室完成.人外周血样品取自中山大学肿瘤防治中心健康医务工作者, 年龄27～35岁, 共12份,所有抽血者对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准.①实验方法:从健康人新鲜血分离外周血单个核细胞,并将其在含重组人粒巨噬细胞集落刺激因子和重组人白细胞介素的完全培养基中培养为不成熟树突状细胞.将不成熟树突状细胞分别在含有正常血糖(5.5 mmol/L葡萄糖),稳定性高血糖(20 mmol/L葡萄糖),波动性高血糖(5.5 mmol/L和20 mmol/L葡萄糖交替作用)的完全培养基中培养48h.②实验评估:采用流式细胞术检测树突状细胞表型.以混合淋巴细胞反应强度观察树突状细胞对淋巴细胞增殖的影响.采用ELISA法检测细胞培养上清细胞因子白细胞介素12浓度.结果:①与正常血糖组比, 稳定性高血糖组和波动性高血糖组树突状细胞表面协同刺激分子CD86表达、特征性表面标志CD1a、成熟度标志CD83以及HLA-DR表达明显增高(P < 0.01).波动性高血糖组对树突状细胞的作用明显高于稳定性高血糖组(P < 0.05).②与正常血糖组相比,稳定性高血糖组和波动性高血糖组可激发强烈的异种T淋巴细胞的增殖反应( P < 0.01),随着细胞数的增多,促增殖作用增强;波动性高血糖组激发混合淋巴细胞反应的强度明显大于稳定性高血糖组(P < 0.05).③20 mmol/L葡萄糖或5.5 mmol/L葡萄糖和20 mmol/L葡萄糖交替培养干预后的树突状细胞分泌细胞因子白细胞介素12明显高于正常血糖组(P < 0.05).结论:波动性高血糖和稳定性高血糖均可促进和增强树突状细胞的成熟分化和免疫功能,波动性高血糖的效果更加明显.
作者：梁明；栾晓军；陈小雨；梁敏 刊期： 2008年第16期
目的:研究发现,应用骨髓间充质干细胞联合周围神经移植治疗脊髓损伤有协同作用.实验拟验证自体骨髓间质干细胞联合周围神经移植治疗脊髓损伤的临床疗效,为脊髓损伤的治疗开辟新途径.方法:选择2003/2004河南省人民医院神经外科干细胞移植治疗中心收治的78例完全性脊髓损伤患者.男52例,女26例,年龄18～52岁.其中颈髓损伤12例,胸髓损伤46例,腰骶髓损伤20例,损伤1周至60个月.患者对治疗知情同意,并要求采用该方法治疗.无菌条件下,自患者髂前上棘及髂后上棘通过骨髓穿刺抽取骨髓,分离、纯化、培养骨髓间充质干细胞.选取患者自体腓肠神经作为周围神经移植供体,将自身腓肠神经应用显微外科方法去除外膜、束膜,并剪神经,使神经组织的质地、外观类似于马尾组织,将其排列呈多条状、纵行植入已切开的脊髓处或原囊肿腔内,然后用分离纯化的骨髓间充质干细胞移植焊接移植的神经,对患者行自体骨髓间充质干细胞联合周围神经移植治疗,术后给予神经生长因子等药物应用, 疗程为1个月,以促进损伤神经的修复.实验评估:通过电话随访和患者定时回医院复查的方式,术后每3个月随访1次,随访1年.术前、术后和随访按国际截瘫医学会评分标准ASIA评分标准评分,评分的增高表示患者的运动和感觉的功能的恢复.同时进行神经电生理、影像学等方面对比分析.结果:78例患者中除1例严重复合伤患者出现并发症,经积极治疗无效死亡,其余患者术后均顺利出院,原有症状改善情况,未出现明显不良毒副反应.患者术后ASIA评分的平均数较术前提高.37例出现运动、感觉、影像学、神经电生理方面的不同改善,25例出现不同程度的运动,感觉、神经电生理方面的改善,9例出现神经电生理方面的改善,6例无变化,1例死亡;在随后的1年随访中,除2例失访外,其余患者均有不同程度进一步恢复的趋势,无明显毒副反应发生.结论:自体骨髓间质干细胞联合周围神经移植治疗脊髓损伤促进脊髓损伤患者的功能恢复,安全有效,有临床推广应用的价值.
作者：李志营；步星耀；张圣旭；梁庆华；李太平；陈书连；李六一；赵耀武；翟亚平；张永福 刊期： 2008年第16期
目的:前期研究表明,吲哚亚甲基异烟腙(简称TJU103)可以明显降低异基因造血干细胞移植小鼠移植物抗宿主病的发生率和程度,明显延长小鼠移植后的生存期.实验拟观察TJU103诱导造血干细胞移植免疫耐受和对移植物抗白血病的影响,探索一条既能降低移植物抗宿主病又能保留移植物抗白血病的移植途径.方法:实验于2007-07/10在南方医科大学珠江医院血液科实验室完成.①实验材料:人急性髓系白血病细胞株KG1a由中国医学科学院血液学研究所宋增璇教授惠赠.10份自愿捐献的健康人外周血白细胞由广州市中心血站提供,等分为供者与受者.②实验方法:采用梯度密度沉淀法常规分离人外周血单个核细胞.以供者外周血单个核细胞作为反应细胞,受者正常外周血单个核细胞作为刺激细胞,体外建立异基因造血干细胞移植中供、受者间的单向混合淋巴细胞反应体系,应用TJU103阻断CD4+T细胞激活的抗原信号通路,设单独刺激细胞和反应细胞对照以及1640完全培养基空白对照.③实验评估:于培养第1、3、5天应用MTT检测TJU103对供者淋巴细胞的增殖活性的影响,于第5天用乳酸脱氢酶释放法分别检测10∶1, 20∶1,40∶1效靶比时供者淋巴细胞对受者单个核细胞和急性髓系白血病细胞KG1a的细胞毒活性影响,同时采用流式细胞仪检测CD4+CD25+T细胞的百分比.结果:第3天和第5天实验组A值低于对照组 (P < 0.05).单向混合淋巴细胞5 d后实验组各效靶比供者T细胞杀伤受者外周血单个核细胞的活性明显低于对照孔 (P < 0.05);二者对KG1a细胞的杀伤活性差异不显著 (P > 0.05).TJU103对供者CD4+CD25+T细胞无影响.结论:TJU103降低T淋巴细胞增殖反应的同时并不影响其抗白血病效应,有望用于临床异基因造血干细胞移植中移植物抗宿主病和移植物抗白血病的免疫调节.
作者：周健；涂三芳；郭坤元；孙明；胡亮杉；吴远彬；卢晓珣；王杨 刊期： 2008年第16期
目的:体外诱导脐血间充质干细胞定向分化为神经元包括抗氧化剂法及细胞因子法,如何选择一种既能够如细胞因子般可广泛保护神经,又具有较强抗氧化作用的诱导剂?通过广泛筛选,观察中药单体黄芩苷对人脐血间充质干细胞体外纯化、扩增及向神经元样细胞诱导分化的作用.方法:实验于2005-02/06在南昌大学第一附属医院神经内科实验室完成.①对象及药物:无内外科并发症和传染性疾病、无血液系统疾病、乙肝表面抗原阴性、非高危妊娠、年龄23～35岁的健康孕妇足月顺产儿的脐带血10份,由南昌大学第一附属医院产科提供,孕妇及其家属对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.黄芩苷,分子量446,纯度 > 95%,由中南大学湘雅医学院药剂科提供.抗氧化添加剂β-巯基乙醇为SABC公司产品.②实验方法:无菌条件下采集胎儿脐带血,肝素抗凝,用明胶沉降+密度梯度离心两步法分离出脐血单个核细胞,经冷冻保存和复苏后,调整细胞浓度为1×109 L-1,以含20%胎牛血清、谷氨酰胺、B27、粒巨噬细胞集落刺激因子300 μg/L、干细胞因子300 μg/L的DMEM液体培养基进行纯化和扩增.按照抗氧化添加剂的不同分为4组:黄芩苷组加入黄芩苷100 μmol/L;空白对照组不添加抗氧化剂;β-巯基乙醇组添加β-巯基乙醇2 mmol/L;共培养组添加黄芩苷100 μmol/L、β-巯基乙醇2 mmol/L.连续培养4周.③实验评估:观察细胞形态学变化;采用流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志;制作细胞爬片,采用免疫细胞化学染色评价神经细胞特异性烯醇化酶、神经微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率.结果:①细胞形态学观察:脐血单个核细胞培养第2～3天开始贴壁生长,2周左右达高峰,3周后细胞生长达80%～90%融合,此时脐血原始间充质干细胞呈较均一的长梭形.4周后,黄芩苷组原来呈梭形的胞体一部分发生收缩,细胞边缘出现细的突起;一部分胞体逐渐近似圆形、锥形、三角形,伪足有多个细长突起,且发出分支,形成圆锥状终末端.β-巯基乙醇组、共培养组细胞虽然也有上述类似形态学的改变,但少量细胞存在脱落、死亡现象,且随着培养时间延长呈逐渐增加的趋势.②细胞表型检测:扩增培养4周后,空白对照组以CD45阳性细胞为主;其余3组均以CD29和CD83阳性细胞为主,其中共培养组多,黄芩苷组次之,β-巯基乙醇组少,组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.01);各组贴壁生长细胞中均未见CD34+阳性细胞.③细胞扩增培养过程中黄芩苷的预诱导效果:扩增培养4周后与黄芩苷组比较,空白对照组、β-巯基乙醇组神经细胞特异性烯醇化酶及神经微管相关蛋白2阳性细胞表达率均显著降低(P < 0.01),共培养组无明显差异 (P > 0.05).各组胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率均低于1%.结论:100 μmol/L黄芩苷可促进脐血间充质干细胞体外扩增,且随抗氧化作用时间的延长效果显著增强,同时在一定程度上还能够诱导其向神经元样细胞方向分化.
作者：颜小华；黄瑞滨；陈启文 刊期： 2008年第16期
目的:脂肪间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的干细胞,在特定培养条件下可分化为骨、软骨、脂肪、神经、心肌、内皮细胞等.实验拟采用高密度、多种生长因子体外诱导兔脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化.方法:实验于2007-01/12在解放军兰州军区总医院实验中心完成.①实验材料:7 d龄乳兔6只,雌雄不限,体质量150～200 g,由兰州生物制品研究所动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:分离乳兔脂肪间充质干细胞,体外扩增至第3代,高密度诱导组按Zuk等高密度微团培养法调整细胞密度为1×1010 L-1高密度培养,加入 10 μg/L转化生长因子β1、50 μg/L胰岛素样生长因子、100 μmol/L地塞米松、50 mg/L维生素C诱导成软骨;低密度诱导组按5×108 L-1低密度培养,并加入与高密度诱导组相同的诱导剂诱导培养;高密度常规培养组按1×1010 L-1高密度加入常规培养基培养;对照组按5×108 L-1的密度接加入常规培养基培养.③实验评估:诱导7、14、21 d后观察细胞形态学变化,应用MTT法检测细胞生长曲线,RT-PCR、免疫细胞化学法检测Ⅱ型胶原表达,阿尔新蓝染色检测糖氨多糖的合成.结果:①兔脂肪间充质干细胞经诱导后生长速度减慢,由长梭形细胞变为短梭多角细胞,呈铺路石状.常规培养的脂肪间充质干细胞潜伏期为一二天,3 d为对数增殖期,第5天以后进入生长平台期.诱导的脂肪间充质干细胞潜伏期为1～3 d,4 d为对数增殖期,第6天进入平台期.②RT-PCR、免疫细胞化学法检测显示,高密度诱导组诱导14、21 dⅡ型胶原阳性表达, 阿尔新蓝染色见胞浆和细胞基质有棕黄色颗粒.低密度诱导组组诱导14、21 dⅡ型胶原弱阳性表达,阿尔新蓝染色仅少量细胞基质着色.高密度常规培养组和对照组Ⅱ型胶原与阿尔新蓝染色均为阴性.结论:高密度培养的脂肪间充质干细胞经多种生长因子诱导可以向软骨细胞分化.
作者：王海燕；耿排力；吕同德；哈小琴；张晓岩 刊期： 2008年第16期
背景:川芎嗪抑制血管内皮生长因子的表达,但对其诱导HL-60白血病细胞增殖是否有抑制效应尚需进一步实验.目的:观察川芎嗪对血管内皮生长因子诱导的白血病细胞HL-60细胞增殖的影响.设计:重复测量观察.单位:武汉科技大学医学院.材料:实验于2007-03/06在武汉科技大学医学院分子生物学实验中心完成.人白血病细胞系HL-60细胞购于上海细胞生物研究所.盐酸川芎嗪注射液为无锡市第七制药有限公司产品, 批号为011014,硫酸鱼精蛋白注射液购自上海第一生化药业公司,批号为010302, 免疫组化试剂盒购自博士德公司.方法:①取对数生长期人白血病细胞系HL-60细胞,加入100 μg/L 血管内皮生长因子,分别加入终浓度为1.5,15,150 mg/L川芎嗪实验培养基,以未加川芎嗪注射液的细胞为空白对照组,只含20 mg/L鱼精蛋白的细胞为阳性对照组,同时设立血管内皮生长因子对照组,细胞培养48 h后,采用MTT法检测HL-60细胞的生长抑制率.②川芎嗪影响HL-60细胞血管内皮生长因子蛋白表达实验:用终浓度为1.5,15及150 mg/L川芎嗪处理HL-60细胞,24 h后采用免疫组织化学法计算血管内皮生长因子蛋白阳性细胞表达率.主要观察指标:① HL-60细胞生长抑制率.②血管内皮生长因子蛋白表达情况.结果:① HL-60细胞生长抑制率:川芎嗪15, 150 mg/L作用血管内皮生长因子诱导的HL-60细胞吸光度值均低于血管内皮生长因子对照组,差异有显著性意义(P < 0.05).②血管内皮生长因子蛋白表达情况:川芎嗪作用HL-60细胞24 h后,血管内皮生长因子蛋白随川芎嗪给药浓度升高表达逐渐下调,呈一定依赖性,各川芎嗪浓度干预HL-60细胞血管内皮生长因子蛋白表达阳性细胞表达率与对照组比较差异均有显著性意义(P < 0.01).结论:川芎嗪可抑制血管内皮生长因子诱导HL-60细胞的增殖, 并下调血管内皮生长因子蛋白的表达.
作者：范可；李中明 刊期： 2008年第16期
目的:检索中国期刊全文数据库2005/2008相关文献显示,RNA干扰研究中,转染效率的高低直接决定siRNA 的表达效果,目前关于应用小分子干扰RNA对人羊膜WISH细胞转染效率的检测研究少见.实验应用化学合成siRNA转染人羊膜WISH细胞,通过流式细胞仪检测转染效率,并初步检测转染对细胞凋亡的影响.方法:实验于2007-03/12在广州医学院试验医学研究中心完成.①实验材料:实验中应用的人羊膜WISH细胞株购于中国科学院上海生命科学研究所.②实验方法:应用0,5,10,20,30 nmol/L化学合成的CY3-Negative siRNA转染人羊膜WISH细胞,转染后24 h应用荧光显微镜和流式细胞仪定性、定量评估其转染效率;20 nmol/L CY3-Negative-siRNA转染细胞24 h后,应用Annexin V-EGFP试剂盒检测细胞早期凋亡情况.结果:荧光显微镜显示,5,10,20,30 nmol/L CY3- Negative siRNA转染细胞内均可见红色荧光,对照组无荧光信号.20 ,30 nmol/L CY3-Negative siRNA 的转染效率明显高于5,10 nmol/L组(P < 0.05);20 nmol/L和30 nmol/L siRNA组转染效率差异不显著(P > 0.05).检测20 nmol/L Negative siRNA转染细胞24 h后的细胞早期凋亡情况,转染组与对照组细胞早期凋亡率分别为1.96 %和2.36 %,两组之间细胞早期凋亡率差异不显著.结论:①化学合成的siRNA可以成功转染人羊膜WISH细胞,转染后对细胞的早期凋亡率无影响.②20 nmol/L的siRNA即可获得理想的转染效果.
作者：郝荣增；刘慧姝；马保华 刊期： 2008年第16期
目的:赤芍总苷能诱导鼠HepA和S180细胞凋亡,但赤芍总苷能否抑制K562细胞增殖及其诱导K562细胞凋亡的机制尚不明确.观察赤芍总苷诱导人红白血病细胞株K562细胞凋亡及线粒体膜电位与Ca2+水平的变化,以探讨凋亡机制.方法:实验于2007-03-02/2007-10-20在北京中医药大学细胞生化实验室,国家重点实验完成.①实验材料:赤芍总苷由西安奥晶科技发展有限公司提供,批号:060417,纯度>95%.人红白血病K562细胞株购自上海中科院细胞库.②实验方法:取对数生长期的K562细胞,培养24 h后加入50 mg/L赤芍总苷进行干预,光镜下观察细胞形态.MTT显色法检测25,50,75,100,150,200,400 mg/L赤芍总苷对K562细胞增殖的抑制作用,以仅加入无血清培养基培养的为对照.③实验评估:采用Annexin V/PI双标记法检测凋亡效应,罗丹明123(Rh123)染色流式检测线粒体膜电位和荧光染料Fluo-3AM流式检测K562细胞内游离Ca2+浓度.结果:①50 mg/L 赤芍总苷作用K562细胞24 h后,出现核固缩、核碎裂和凋亡小体等形态学改变.②与对照组相比,不同质量浓度赤芍总苷能明显抑制K562细胞的增殖(P < 0.01),并具有量效关系,呈时间和剂量依赖性.③细胞线粒体经Rh123染色呈现明亮绿,不同质量浓度赤芍总苷干预组荧光强度均较对照组明显减弱,膜电位水平较高.④赤芍总苷可引起细胞线粒体膜电位下降.不同质量浓度赤芍总苷组细胞内游离Ca2+浓度均升高, 线粒体膜电位下降,与对照组比较差异显著(P < 0.01).结论:赤芍总苷诱导K562细胞凋亡的可能机制是通过减低细胞内线粒体膜电位及提高游离Ca2+水平,从而导致细胞凋亡.
作者：许惠玉；陈志伟；牛建昭；邹宇；孙勇伟；彭波 刊期： 2008年第16期
背景:造血干细胞移植使恶性血液病的预后得到很大的改观,外周血造血干细胞移植逐渐取代了骨髓移植而成为造血干细胞移植的主要方式.目的:观察自体或异基因外周血造血干细胞移植对53例恶性血液病患者的治疗效果.设计:随机对照观察.单位:郑州大学第一附属医院血液科骨髓移植中心.对象:选择2003-07/2006-05在郑州大学第一附属医院血液科收治的53例恶性血液病患者,男33例,女20例,平均37岁.35例患者行异基因外周血造血干细胞移植,其中急性髓细胞性白血病13例、急性淋巴细胞白血病7例、慢性粒细胞白血病10例、多发性骨髓瘤2例、骨髓增生异常综合征3例.18例患者行自体外周血造血干细胞移植,其中急性髓细胞性白血病7例、急性淋巴细胞白血病6例、多发性骨髓瘤2例、非霍奇金病3例.33名供者与受者HLA配型完全相合,2名1个位点不合,男20例,女13例,平均35岁.性别不相合者16例.实验经过医院伦理委员会批准许可,所有受试对象均对检测项目知情同意.方法:①利用粒系集落刺激因子或化疗联合粒系集落刺激因子动员外周血干细胞,自体移植患者接受CD34+细胞中位数为3.0×106/kg,异基因移植患者接受CD34+细胞中位数为6.2×106/kg;自体移植采用MAC预处理方案,异基因移植采用改良的Bu/Cy预处理方案;移植物抗宿主病的预防采用甲氨喋呤、环孢菌素A联合骁悉,1例1位点不合患者加用抗淋巴细胞球蛋白.②观察患者移植后中性粒细胞＞ 0.5× 109 L-1和血小板＞20×109 L-1恢复时间.③观察患者移植物抗宿主病发生情况.④术后1年随访所有患者复发情况.主要观察指标:①中性粒细胞和血小板恢复时间.②移植后移植物抗宿主病发生情况.③随访结果.结果:纳入患者53例均进入结果分析.①自体移植患者移植后中性粒细胞＞ 0.5×109 L-1、血小板＞ 20×109 L-1的恢复时间分别为13和19 d,在异基因移植患者中分别为12和15 d.②异基因移植患者中Ⅰ～Ⅲ度急性移植物抗宿主病的发生率为31.4%,慢性移植物抗宿主病的发生率为71.4%.③术后患者自体移植和异基因移植患者复发率分别为38.9%和5.7%.结论:自体或异基因外周血造血干细胞移植较快建立恶性血液病患者造血能力,是治疗恶性血液病的重要手段.
作者：谢新生；万鼎铭；孙慧；孙玲；刘林湘；姜中兴 刊期： 2008年第16期
目的:目前国际上应用广泛的神经功能评估标准是2000年美国脊髓损伤学会制定的ASIA标准.通过实践作者发现ASIA标准主要偏重于神经学检查的评估,对于植物神经功能如大小便功能、出汗及皮肤营养等功能性的情况不能很好的评估.作者也曾经制定了ASIA标准的功能观察补充表,虽然此表能够较好的反映出脊髓损伤患者嗅鞘细胞移植术后植物神经功能的变化,但是必须要和ASIA标准同时使用,互为补充,使用较为繁琐.观察北京西山脊髓功能量表的使用效果.方法:选择2007-07/11来源于全国各地的陈旧性脊髓损伤患者21例,男17例,女4例,年龄8～54岁,损伤时间0.5～18年.受伤原因:创伤性脊髓损伤17例,手术创伤1例,生物源性损伤即脊髓炎3例.损伤节段:颈段8例,胸腰段13例.脊髓损伤程度:14例为完全性脊髓损伤,7例为不完全性脊髓损伤.13例曾行脊髓减压手术治疗.21例均接受过不同种类的神经营养因子等治疗.患者自愿接受细胞移植治疗并签自愿接受协议书.4～6个月中期引产胚胎由家属自愿捐献,并经过医院伦理委员会批准.取胚胎嗅球,经细胞分离、培养、纯化7～14 d,后消化成单细胞混悬液,然后在手术显微镜下移植到患者损伤脊髓区域的上下方.术后1～2个月,采用北京西山医院脊髓损伤功能量表进行术前和术后评定对比,该量表共9大项16小项,采用4分制,正常3分,差为0分,总分0～48分,0～16分为重度残障,17～32分为中度残障,33～47分为轻度残障,48分正常,能全面地体现患者的功能变化,不仅包括运动感觉的变化,还包括了膀胱、直肠、肌张力、皮肤营养状况、泌汗、性功能、疼痛、生存和生活质量的评价.结果:21例患者均进入结果分析.嗅鞘细胞移植术后1～2个月,21例患者的脊髓功能评分都有明显提高(术前:21.33±10.29,术后:25.19±11.16,P < 0.01)结论:西山医院脊髓功能量表能较全面的反映出术后脊髓患者功能的变化,使用较简便.
作者：刘超；郑遵成；高瑞；张林；张坤；张磊；魏树刚；张立清；匡乃峰；宋延军 刊期： 2008年第16期
目的:应用原始生殖细胞进行全能干细胞的研究具有与胚胎干细胞同样广阔的前景,尤其适合于难以从囊胚内细胞团中分离培养胚胎干细胞的动物.但胚胎生殖细胞体外培养条件一直是制约这方面发展的瓶颈.实验设计了体外有效扩增小鼠原始生殖细胞的方法,拟搭建稳定高效的原始生殖细胞培养平台.方法:实验于2006-10/2007-08在重庆医科大学组织胚胎学教研室重庆市生物化学分子药理学重点实验室完成.①实验材料:清洁级昆明孕鼠由重庆医科大学动物实验中心提供,见阴栓计为0.5 d胚龄,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:取胚龄8.5 d胎鼠尾端尿囊及周围组织, 取胚龄9.5～10.5 d胎鼠后肠及周围组织,取胚龄11.5 d,12.5 d胎鼠生殖嵴及周围组织,分别经0.25%胰酶-0.02%EDTA消化并接种于0.1%明胶包被的培养皿中.比较不同妊娠时间点取材对原代、F1代胚胎生殖细胞克隆形成的影响.采用SSEA-1免疫组织化学法计数细胞阳性率,计数胚胎生殖细胞克隆联合MTT法比较胚龄11.5 d,12.5 d两个时间点原始生殖细胞的增殖能力.比较上述两种取材培养方法对胚龄11.5 d,12.5 d原始生殖细胞扩增的影响.采用碱性磷酸酶染色、免疫组化检测SSEA-1、免疫荧光检测Nanog,体外分化实验鉴定分化能力.结果:①胚龄11.5 d,12.5 d胎鼠原代和F1代集落形成率较胚龄8.5～10.5 d高,扩增效率显著提高(P < 0.01).②免疫组织化学法检测分离的胚龄11.5 d,12.5 d原始生殖细胞 SSEA-1阳性率差异不显著 (P > 0.05).原代第3天克隆计数显示,胚龄11.5 d胎鼠高于12.5胚龄胎鼠 (P < 0.01),MTT数据显示11.5胚龄组稍高于12.5胚龄组.③两种方法对胚龄11.5 d,12.5 d胎鼠胚胎生殖细胞集落形成无显著性差异(P > 0.05),但生长方式有所不同.④克隆胚胎生殖细胞呈典型的胚胎干细胞样集落生长,能稳定传代;碱性磷酸酶、SSEA-1、Nanog表达强阳性;体外能分化为囊状类胚体.结论:胚龄11.5 d和12.5 d胎鼠,尤其是胚龄11.5 d胎鼠扩增原始生殖细胞效率较高,在这两个时间点运用与周围组织共培养法和生殖嵴分离培养法均适宜.
作者：王璐；刘永刚；李芳菲；姜蓉；王亚平 刊期： 2008年第16期
背景:诱导因子及软骨微环境是影响骨髓基质干细胞成软骨分化及软骨形成的主要因素.目的:利用少量软骨细胞以共培养方式诱导骨髓基质干细胞体内成软骨.设计、时间及地点:2004-09/2005-03在解放军第四军医大学口腔医院病理教研室完成的随机对照动物实验.材料:选择清洁级新西兰兔15只用于细胞支架复合物的种植,随机分为混合细胞组、软骨细胞组、骨髓基质干细胞组,5只/组.取新生1～3 d龄新西兰兔5只用于骨髓基质干细胞、软骨细胞的分离培养.聚羟基乙酸无纺网支架为上海易括公司产品,材料直径15 μm,平均间距150～200 μm,孔隙率97%,厚2 mm.方法:混合细胞组将骨髓基质干细胞与软骨细胞按3:1混匀,调整细胞密度为6.0×1010 L-1,接种于经培养液预湿的塑形聚羟基乙酸 5 mm×5 mm的支架上,然后在复合物周围滴加含胎牛血清的DMEM液培养1周.软骨细胞组、骨髓基质干细胞组的细胞密度调整为6.0×1010 L-1后同法接种于支架上.各组兔麻醉后于背部一侧皮下组织植入对应的细胞-支架复合物.主要观察指标:植入后第8周行新生软骨大体观察和苏木精-伊红、Masson三色染色.结果:各组细胞与聚羟基乙酸支架黏附情况良好.植入8周后,混和培养组和软骨细胞组均形成了成熟的软骨样组织,并基本保持复合物初始的大小和形状,两组新生软骨外观及组织学特征较接近.骨髓基质干细胞组在体内培养过程中未形成软骨组织,而是形成了纤维结缔组织.结论:骨髓基质干细胞与软骨细胞按3:1混合形成的微环境,能有效诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化,并促进骨髓基质干细胞的体内成软骨.
作者：倪云峰；李小飞；刘源；雷战军；卢强 刊期： 2008年第16期
目的:大量研究表明,类胰岛素生长因子I促成肌细胞增殖作用明显,低浓度水平就有活性,但是对于其作用机制目前还不太清楚.应用流式细胞仪碘化丙啶染色法(PI法)检测成肌细胞生长周期,拟探讨类胰岛素生长因子I对原代及传代人胚骨骼肌成肌细胞体外增殖的作用与机制.方法:实验于2004-06/12在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室、干细胞与组织工程研究室以及成都市第三人民医院检验科流式细胞室完成.在产妇知情同意的前提下,选取孕8～12周水囊引产胎儿,性别不限,切取部分小腿腓肠肌与股四头肌组织后,采用文献的方法进行成肌细胞分离、纯化与传代培养,实验经医院伦理委员会批准.选取原代、第2、4、6代成肌细胞以1×105 /孔密度接种于24孔板,每3孔为1组计7组.1～7组细胞以无血清F12培养基同步化后分别予以含0,1,2,4,8,16,32 μg/L类胰岛素生长因子I的培养基,运用核素掺入法确定类胰岛素生长因子I促增殖的适宜浓度用于实验.同步化后其中一板的生长培养基不加类胰岛素生长因子I作为对照组;另一个加入适宜浓度的类胰岛素生长因子I作为实验组.每组每天取3孔细胞计数,绘制生长曲线,推算成肌细胞的群体倍增时间,作为细胞增殖周期TC.运用流式细胞技术PI法分别测定细胞生长周期和各亚周期时相时间.结果:4～8 μg/L 类胰岛素生长因子I具有良好促进成肌细胞增殖的能力.各代的实验组与对照组成肌细胞在24 h后进入对数生长期,各实验组细胞生长曲线明显左移.6代以内成肌细胞的增殖周期、各亚周期细胞百分比、各亚周期所占时相以及各代细胞对类胰岛素生长因子I的反应一致,生长模式与能力一致,细胞倍增时间平均从4.8 d缩短到3.3 d.结论:类胰岛素生长因子I能促进成肌细胞体外增殖,成肌细胞的增殖指数明显提高.其促增殖作用是通过缩短DNA合成前期和合成期来实现的.
作者：张峻梅；岑石强；杨志明；解慧琪；唐方 刊期： 2008年第16期
目的:Nur77是介导T细胞凋亡的重要基因,它的激活需要第二信使钙离子,而Nur77基因启动子的钙反应元件是转录因子肌细胞增强因子2D的结合位点.探讨在Nur77诱导T细胞凋亡过程中肌细胞增强因子2D是否可以被乙酰化,以及通过调节Nur77基因乙酰化对T细胞凋亡的影响.方法:实验于2006-11/2007-09在吉林大学第一医院血液肿瘤科完成.①材料:大肠杆菌DH5α、pcDNA3质粒由吉林大学第一医院中心研究室保存.pET32M质粒、Flag-p300质粒、pSilencerTM-p300 RNAi质粒由香港科技大学Zhengguo Wu博士馈赠.NFATp质粒由哈佛大学Yun Chen博士馈赠.Jurkat细胞由吉林大学第一医院血液肿瘤科提供.②实验方法:PCR法产生全长的Nur77和依赖Nur77的荧光报告基因被亚克隆到pcDNA质粒中,产生的肌细胞增强因子2D(1-514)、(1-121)、(1-300)、(301-514)各片段以及含4个赖氨酸(K245/K250/K267/K279)位点突变为精氨酸位点的肌细胞增强因子2D (4KR)突变体亚克隆到pcDNA后在氨基端含有Flag抗原簇,于细菌表达载体上进行质粒构建,验证正确的质粒使用脂质体DMRIE-C进行转染.③实验评估:将Nur77荧光报告基因与肌细胞增强因子2D、p300、NFATp共转染到Jurkat细胞中,检测p300对肌细胞增强因子2D促进Nur77转录的影响.免疫沉淀法检测内源性肌细胞增强因子2D是否能够被乙酰化,以及阻滞p300表达后是否影响其乙酰化.体外乙酰化法检测肌细胞增强因子2D的乙酰化位点.荧光素报告分析法检测肌细胞增强因子2D的乙酰化功能缺失对Nur77转录活性的影响.采用流式细胞仪检测其功能缺陷对Nur77诱导T细胞凋亡的影响.结果:①肌细胞增强因子2D与NFATp的二聚体虽然不能促进Nur77的转录,但p300、NFAT、肌细胞增强因子2D的三聚体却能明显促进Nur77的转录,且p300与肌细胞增强因子2D的二聚体也明显促进Nur77的转录.②PMA/Iono活化钙信号传导通路后,肌细胞增强因子2D被乙酰化.当内源性p300RNAi后,p300的表达被阻滞时,肌细胞增强因子2D的乙酰化水平显著下降.③K245,K250,K267,K279氨基酸同时突变可以使肌细胞增强因子2D乙酰化程度大部分丧失,说明在体外这4个赖氨酸位点是肌细胞增强因子2D的主要乙酰化位点.④与空载体比较,转染乙酰化缺陷的肌细胞增强因子2D可使Nur77转录功能提高2.48倍;与转染野生型的肌细胞增强因子2D比较,转染乙酰化缺陷的肌细胞增强因子2D能降低Nur77基因70.4%的转录功能.⑤与空载体比较,Nur77表达能够促进T细胞凋亡,早晚期凋亡之和从4.3%提高至16.3%;共表达野生型肌细胞增强因子2D与Nur77能够进一步促进T细胞的凋亡,早晚期凋亡之和从16.3%提高到31.0%;但肌细胞增强因子2D乙酰化功能缺失的突变体肌细胞增强因子2D明显降低Nur77介导的T细胞凋亡,早晚期凋亡之和从16.3%降低到9.2%.结论:p300对肌细胞增强因子2D促进Nur77的转录起主要作用.肌细胞增强因子2D在Nur77诱导的T细胞凋亡过程中可以被乙酰化,乙酰化的肌细胞增强因子2D通过上调Nur77基因的转录来促进T细胞凋亡.
作者：杨艳萍；王冠军；马克威 刊期： 2008年第16期
目的:梭华-Sofast是新一代阳离子聚合物转染试剂,具有高效率转染所必备特征,如浓缩DNA,将DNA运送到细胞内,并使其在细胞核内释放等,且细胞毒性很低,很稳定,不被血清清除等特点.观察梭华-Sofast介导绿色荧光蛋白转染骨髓间充质干细胞的转染效果及细胞毒性.方法:实验于2006-03-01/12-31在福建医科大学神经生物学研究中心完成.①实验材料:实验动物选用清洁级健康雄性SD大鼠10只,二三月龄,体质量150～250 g,由福建医科大学实验动物中心提供.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:SD大鼠10只,用密度梯度离心及贴壁法相结合的方法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,分别以Sofast、阳离子聚合物Jet PEI、Superfect和阳离子脂质体Lipofectamine 2000为转染试剂,转染绿色荧光蛋白入骨髓间充质干细胞,倒置荧光显微镜下检测转染细胞的绿色荧光蛋白基因表达,并通过MTT法检测转染细胞毒性.结果:梭华-Sofast、阳离子聚合物Jet PEI、Superfect和阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导的绿色荧光蛋白能有效转染入骨髓间充质干细胞,转染效率分别为(85.62±8.76 )%、(73.34±7.32)%、(75.61±7.79)%和(76.62±8.21)%,梭华-Sofast转染率高(P < 0.05);转染细胞的存活分数分别为(92.18±9.27)%、(86.98±8.54)%,(87.84±8.59)%和(87.17±8.61)%,梭华-Sofast细胞毒性低(P < 0.05).结论:梭华-Sofast介导绿色荧光蛋白转染骨髓间充质干细胞具有高转染效率和低细胞毒性的优点.
作者：吴碧莲；陈少强；贾小力 刊期： 2008年第16期
背景:骨髓基质细胞能透过血脑屏障在脑中存活并迁移至脑梗死区,而在脑梗死区转化生长因子β1的增加将有助于减轻神经元的损害.目的:观察静脉移植骨髓基质细胞对大鼠脑缺血再灌注损伤神经元转化生长因子β1的影响.设计、时间及地点:随机对照设计,于2005-09/2006-03在中国医科大学实验动物中心完成.材料:清洁级成年Wistar大鼠36只,随机分为模型对照组、盐水组、细胞移植组,12只/组.另取2月龄Wistar大鼠2只用于制备骨髓基质细胞.方法:贴壁法+胰蛋白酶消化分离培养骨髓基质细胞,传至3～5代用于实验,移植前24 h向培养基中加入BrdU进行体外标记.采用改良线栓法建立左侧大脑中动脉梗死大鼠模型,造模后24 h,细胞移植组于尾静脉输入浓度为3×109 L-1骨髓基质细胞悬液1 mL,盐水组尾静脉注射1 mL生理盐水,模型对照组不给予任何处理.主要观察指标:免疫组化染色检测BrdU阳性细胞及转化生长因子β1的表达,原位TUNEL法检测神经细胞凋亡情况.结果:造模后3 d,细胞移植组脑梗死灶周围可见大量BrdU阳性细胞,盐水组及模型对照组未见BrdU阳性细胞;细胞移植组转化生长因子β1的表达明显高于盐水组及模型对照组(P < 0.01);细胞移植组纹状体梗死区神经细胞凋亡数明显低于盐水组及模型对照组(P < 0.01).结论:经静脉移植的骨髓基质细胞可选择性进入脑缺血区,增强脑损伤区转化生长因子β1的表达,从而减少神经细胞的凋亡.
作者：陈敬；赵彬 刊期： 2008年第16期
目的:茶黄素是红茶中的主要成分,具有调节血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗心脑血管疾病等多种药理活性.以往茶黄素对人体内脂肪代谢的影响多数属于宏观分析,实验在细胞水平上探讨茶黄素对兔骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化的影响.方法:实验于2007-05/09在安徽医科大学附属省立医院中心实验室完成.①动物:清洁级4～8周龄家兔10只,由安徽医科大学动物试验中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:兔全身肝素化后麻醉状态下处死,取双侧股骨胫骨和肱骨,去除软组织,切除包括骺板在内的两侧骺端,采用全骨髓法分离培养骨髓基质干细胞,按2×108 L-1密度接种,当细胞生长至80%～90%融合时消化传代.取传至3代的细胞按1×105/cm2密度接种,加入含重组人胰岛素 10 mg/L、地塞米松10-6 mol/L、0.5 mmol/L IBMX的DMEM成脂诱导液培养2周.设立3组:脂肪对照组单纯放入成脂诱导液1 mL;茶黄素组向1 mL成脂诱导液中加入500μg/L茶黄素;空白对照组仅加入等量普通DMEM培养液.③实验评估:取第2代培养细胞绘制生长曲线;油红O染色对诱导的脂肪细胞进行鉴定,计算脂肪细胞转化率.结果:①细胞生长曲线:骨髓基质干细胞具有旺盛的增殖能力,培养1 d为细胞适应期,3 d后为对数增长期,8 d时进入平台期,之后细胞增殖迅速减慢,细胞数下降.②脂肪细胞油红O染色鉴定结果:脂肪细胞中的脂滴被染成橙红色,胞核为蓝色.脂肪对照组多数骨髓基质干细胞诱导为脂肪细胞,转化率为(64.8±4.8)%,茶黄素组仅为(32.0±3.4)%,空白对照组未见明显脂肪细胞形成.结论:茶黄素可明显抑制兔骨髓基质干细胞向脂肪细胞方向的分化.
作者：李府；尚希福；谢涛 刊期： 2008年第16期
目的:脂肪干细胞来源于成脂细胞,取材容易,已经成为干细胞研究一个新的方向.观察脂肪干细胞移植脑冻伤大鼠的脑组织局部组织学变化以及神经行为学变化.方法:实验于2006-01/2007-08在中南大学湘雅医院神经病学实验室完成.①实验材料:SD大鼠,雌雄不限,体质量300 g左右,由中南大学湘雅医学院动物学部提供.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:体外培养并传代SD大鼠脂肪干细胞,并用BrdU标记.制作大鼠的脑冷冻伤模型,实验组在冷冻伤动物脑内移植脂肪干细胞,对照组在冷冻伤动物脑内移植培养基,假手术组仅行颅骨开窗,每组15只.③实验评估:分别在移植细胞后1,3,5,7,14,30 d对实验动物进行NSS神经行为学评分,并制作脑组织切片,行免疫荧光染色检测BrdU阳性细胞.采用Tunel染色检测凋亡细胞,脑组织RT-PCR检测血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子等因子mRNA表达.结果:①与对照组相比,实验组大鼠在3～14 d NSS神经行为学评分降低(P < 0.05).②免疫荧光检测显示,Brdu标记的脂肪干细胞在大鼠脑组织内存活并且迁移.③Tunel法检测显示,3 d后实验组凋亡细胞数目明显少于其他组.④RT-PCR检测显示,与其他两组比较,移植脂肪干细胞的大鼠脑组织中血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子表达更高.结论:脂肪干细胞可以在中枢神经系统中存活,并分化为神经元样细胞,它可以引起血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子等因子的高表达从而减少细胞凋亡,加速神经功能修复过程并达到保护脑组织的目的.
作者：周向阳；邓永文；方芳；王飞；陈若琨；宋涛；方加胜 刊期： 2008年第16期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
