解继胜；黄海玲；唐毓金；陈维平；罗小琼
目的:国内外研究报道,重组粒细胞集落刺激因子可以动员骨髓干细胞向脑梗死病损部位迁徙,减轻脑缺血后的脑水肿和脑损伤,但是,国内关于该类药物对脑出血后脑水肿影响的报道鲜见.观察重组粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞对大鼠脑出血后脑水肿及血肿周边区脑组织基质金属蛋白酶9表达的影响.方法:实验于2006-03/11在泸州医学院中心实验室进行.①实验材料:健康雄性SD大鼠144只,体质量(300±20)g,由泸州医学院动物科提供.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:将大鼠随机分为假手术组、脑出血组、治疗组,48只/组.脑出血组和治疗组参照Yang的方法,采用断尾取自体血方式制备大鼠脑出血模型.假手术组用生理盐水代替自体血,其余条件与脑出血组一致.治疗组于造模1h后腹腔注射重组粒细胞集落刺激因子 60μg/kg.③实验评估:检测大鼠脑组织含水量,并采用免疫组织化学法检测大鼠脑组织基质金属蛋白酶9的表达.结果:144只大鼠中共有16只大鼠脱落,其中7只大鼠术后模型评价为0级,9只死亡.均在实验过程中予以补足.①脑出血组大鼠脑组织含水量明显高于假手术组(P < 0.05),脑出血组含水量在造模后48,72 h明显,且与造模后6 h、12 h、24 h、7 d相比差异显著(P < 0.05).治疗组大鼠脑组织含水量明显低于脑出血组 (P < 0.05).②脑出血组大鼠脑组织基质金属蛋白酶9的表达明显高于假手术组(P < 0.05),在造模后48 h、72 h明显,且与6 h、12 h、24 h 、7 d相比差异显著(P < 0.05).治疗组造模后各时间点基质金属蛋白酶9的表达低于脑出血组(P < 0.05).结论:重组粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞能下调脑出血后血肿周边组织基质金属蛋白酶9的表达,并减轻脑水肿的程度.
作者：何晓英；李小刚；谭华；袁平 刊期： 2008年第16期
目前人们对肝干细胞的分化潜能及特性已形成共识,但体外分离培养肝干细胞的方法还不成熟,肝干细胞体外分离培养方法的建立是在体外条件下对肝干细胞的生物学特性进行深入研究的前提和基础.肝细胞生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素、转化生长因子等细胞生长因子对肝干细胞的体外培养、生长和分化可能具有重要的调控作用.肝干细胞在一定条件下可以转化为肝癌细胞,肝干细胞在肝癌的发生中起着非常重要的作用.肝干细胞移植研究为肝细胞移植、生物型人工肝、肝癌靶向基因治疗提供细胞来源.
作者：陈强 刊期： 2008年第16期
目的:骨髓间充质干细胞和许旺细胞作为脊髓组织工程学的两个重要的种子细胞,均可进行自体移植,具有其他种子细胞无以比拟的优势.应用联合细胞移植治疗大鼠脊髓半横切模型,观察其疗效.方法:实验于2007-03/12在辽宁医学院科学实验中心完成.①实验材料:清洁级健康成年SD雄性大鼠60只,体质量250～300 g ,由辽宁医学院实验动物中心提供.将大鼠按随机数字表法分为3组:联合细胞组、骨髓间充质干细胞组、磷酸盐缓冲液组,每组20只.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:采用全骨髓培养法制备大鼠骨髓间充质干细胞,混合酶消化法制备大鼠许旺细胞.制作大鼠右侧T10脊髓半横切模型,联合细胞组注射骨髓间充质干细胞和许旺细胞,骨髓间充质干细胞组注射骨髓间充质干细胞,磷酸盐缓冲液组注射磷酸盐缓冲液.③实验评估:术后4周行网格及斜板实验,并检测大鼠损伤区脊髓诱发电位波幅及潜伏期,并行苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色观察.结果:纳入大鼠60只,每组术后各2只因腹胀及感染死亡,进入结果分析54只. ①网格实验及斜板实验均显示,联合细胞组大鼠恢复情况明显优于其他两组(P < 0.01),骨髓间充质干细胞组优于磷酸盐缓冲液组(P < 0.01).②神经电生理检测显示,联合细胞组诱发电位波幅比其他两组高(P < 0.01),诱发电位潜伏期比其他两组短(P < 0.01),骨髓间充质干细胞组优于磷酸盐缓冲液组(P < 0.01).③联合细胞组囊性病变区面积小,其次是骨髓间充质干细胞组,磷酸盐缓冲液组囊性变区面积大(P < 0.01).④联合细胞组损伤侧灰质内神经元样细胞数多于其他两组(P < 0.01).结论:骨髓间充质干细胞和许旺细胞可以联合移植,在体内存活良好,并互相协同促进损伤脊髓恢复,比单一细胞移植疗效更佳.
作者：智晓东；吕刚 刊期： 2008年第16期
目的:检索中国期刊全文数据库2005/2008相关文献显示,RNA干扰研究中,转染效率的高低直接决定siRNA 的表达效果,目前关于应用小分子干扰RNA对人羊膜WISH细胞转染效率的检测研究少见.实验应用化学合成siRNA转染人羊膜WISH细胞,通过流式细胞仪检测转染效率,并初步检测转染对细胞凋亡的影响.方法:实验于2007-03/12在广州医学院试验医学研究中心完成.①实验材料:实验中应用的人羊膜WISH细胞株购于中国科学院上海生命科学研究所.②实验方法:应用0,5,10,20,30 nmol/L化学合成的CY3-Negative siRNA转染人羊膜WISH细胞,转染后24 h应用荧光显微镜和流式细胞仪定性、定量评估其转染效率;20 nmol/L CY3-Negative-siRNA转染细胞24 h后,应用Annexin V-EGFP试剂盒检测细胞早期凋亡情况.结果:荧光显微镜显示,5,10,20,30 nmol/L CY3- Negative siRNA转染细胞内均可见红色荧光,对照组无荧光信号.20 ,30 nmol/L CY3-Negative siRNA 的转染效率明显高于5,10 nmol/L组(P < 0.05);20 nmol/L和30 nmol/L siRNA组转染效率差异不显著(P > 0.05).检测20 nmol/L Negative siRNA转染细胞24 h后的细胞早期凋亡情况,转染组与对照组细胞早期凋亡率分别为1.96 %和2.36 %,两组之间细胞早期凋亡率差异不显著.结论:①化学合成的siRNA可以成功转染人羊膜WISH细胞,转染后对细胞的早期凋亡率无影响.②20 nmol/L的siRNA即可获得理想的转染效果.
作者：郝荣增；刘慧姝；马保华 刊期： 2008年第16期
目的:应用原始生殖细胞进行全能干细胞的研究具有与胚胎干细胞同样广阔的前景,尤其适合于难以从囊胚内细胞团中分离培养胚胎干细胞的动物.但胚胎生殖细胞体外培养条件一直是制约这方面发展的瓶颈.实验设计了体外有效扩增小鼠原始生殖细胞的方法,拟搭建稳定高效的原始生殖细胞培养平台.方法:实验于2006-10/2007-08在重庆医科大学组织胚胎学教研室重庆市生物化学分子药理学重点实验室完成.①实验材料:清洁级昆明孕鼠由重庆医科大学动物实验中心提供,见阴栓计为0.5 d胚龄,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:取胚龄8.5 d胎鼠尾端尿囊及周围组织, 取胚龄9.5～10.5 d胎鼠后肠及周围组织,取胚龄11.5 d,12.5 d胎鼠生殖嵴及周围组织,分别经0.25%胰酶-0.02%EDTA消化并接种于0.1%明胶包被的培养皿中.比较不同妊娠时间点取材对原代、F1代胚胎生殖细胞克隆形成的影响.采用SSEA-1免疫组织化学法计数细胞阳性率,计数胚胎生殖细胞克隆联合MTT法比较胚龄11.5 d,12.5 d两个时间点原始生殖细胞的增殖能力.比较上述两种取材培养方法对胚龄11.5 d,12.5 d原始生殖细胞扩增的影响.采用碱性磷酸酶染色、免疫组化检测SSEA-1、免疫荧光检测Nanog,体外分化实验鉴定分化能力.结果:①胚龄11.5 d,12.5 d胎鼠原代和F1代集落形成率较胚龄8.5～10.5 d高,扩增效率显著提高(P < 0.01).②免疫组织化学法检测分离的胚龄11.5 d,12.5 d原始生殖细胞 SSEA-1阳性率差异不显著 (P > 0.05).原代第3天克隆计数显示,胚龄11.5 d胎鼠高于12.5胚龄胎鼠 (P < 0.01),MTT数据显示11.5胚龄组稍高于12.5胚龄组.③两种方法对胚龄11.5 d,12.5 d胎鼠胚胎生殖细胞集落形成无显著性差异(P > 0.05),但生长方式有所不同.④克隆胚胎生殖细胞呈典型的胚胎干细胞样集落生长,能稳定传代;碱性磷酸酶、SSEA-1、Nanog表达强阳性;体外能分化为囊状类胚体.结论:胚龄11.5 d和12.5 d胎鼠,尤其是胚龄11.5 d胎鼠扩增原始生殖细胞效率较高,在这两个时间点运用与周围组织共培养法和生殖嵴分离培养法均适宜.
作者：王璐；刘永刚；李芳菲；姜蓉；王亚平 刊期： 2008年第16期
背景:骨髓基质细胞能透过血脑屏障在脑中存活并迁移至脑梗死区,而在脑梗死区转化生长因子β1的增加将有助于减轻神经元的损害.目的:观察静脉移植骨髓基质细胞对大鼠脑缺血再灌注损伤神经元转化生长因子β1的影响.设计、时间及地点:随机对照设计,于2005-09/2006-03在中国医科大学实验动物中心完成.材料:清洁级成年Wistar大鼠36只,随机分为模型对照组、盐水组、细胞移植组,12只/组.另取2月龄Wistar大鼠2只用于制备骨髓基质细胞.方法:贴壁法+胰蛋白酶消化分离培养骨髓基质细胞,传至3～5代用于实验,移植前24 h向培养基中加入BrdU进行体外标记.采用改良线栓法建立左侧大脑中动脉梗死大鼠模型,造模后24 h,细胞移植组于尾静脉输入浓度为3×109 L-1骨髓基质细胞悬液1 mL,盐水组尾静脉注射1 mL生理盐水,模型对照组不给予任何处理.主要观察指标:免疫组化染色检测BrdU阳性细胞及转化生长因子β1的表达,原位TUNEL法检测神经细胞凋亡情况.结果:造模后3 d,细胞移植组脑梗死灶周围可见大量BrdU阳性细胞,盐水组及模型对照组未见BrdU阳性细胞;细胞移植组转化生长因子β1的表达明显高于盐水组及模型对照组(P < 0.01);细胞移植组纹状体梗死区神经细胞凋亡数明显低于盐水组及模型对照组(P < 0.01).结论:经静脉移植的骨髓基质细胞可选择性进入脑缺血区,增强脑损伤区转化生长因子β1的表达,从而减少神经细胞的凋亡.
作者：陈敬；赵彬 刊期： 2008年第16期
目的:目前国际上应用广泛的神经功能评估标准是2000年美国脊髓损伤学会制定的ASIA标准.通过实践作者发现ASIA标准主要偏重于神经学检查的评估,对于植物神经功能如大小便功能、出汗及皮肤营养等功能性的情况不能很好的评估.作者也曾经制定了ASIA标准的功能观察补充表,虽然此表能够较好的反映出脊髓损伤患者嗅鞘细胞移植术后植物神经功能的变化,但是必须要和ASIA标准同时使用,互为补充,使用较为繁琐.观察北京西山脊髓功能量表的使用效果.方法:选择2007-07/11来源于全国各地的陈旧性脊髓损伤患者21例,男17例,女4例,年龄8～54岁,损伤时间0.5～18年.受伤原因:创伤性脊髓损伤17例,手术创伤1例,生物源性损伤即脊髓炎3例.损伤节段:颈段8例,胸腰段13例.脊髓损伤程度:14例为完全性脊髓损伤,7例为不完全性脊髓损伤.13例曾行脊髓减压手术治疗.21例均接受过不同种类的神经营养因子等治疗.患者自愿接受细胞移植治疗并签自愿接受协议书.4～6个月中期引产胚胎由家属自愿捐献,并经过医院伦理委员会批准.取胚胎嗅球,经细胞分离、培养、纯化7～14 d,后消化成单细胞混悬液,然后在手术显微镜下移植到患者损伤脊髓区域的上下方.术后1～2个月,采用北京西山医院脊髓损伤功能量表进行术前和术后评定对比,该量表共9大项16小项,采用4分制,正常3分,差为0分,总分0～48分,0～16分为重度残障,17～32分为中度残障,33～47分为轻度残障,48分正常,能全面地体现患者的功能变化,不仅包括运动感觉的变化,还包括了膀胱、直肠、肌张力、皮肤营养状况、泌汗、性功能、疼痛、生存和生活质量的评价.结果:21例患者均进入结果分析.嗅鞘细胞移植术后1～2个月,21例患者的脊髓功能评分都有明显提高(术前:21.33±10.29,术后:25.19±11.16,P < 0.01)结论:西山医院脊髓功能量表能较全面的反映出术后脊髓患者功能的变化,使用较简便.
作者：刘超；郑遵成；高瑞；张林；张坤；张磊；魏树刚；张立清；匡乃峰；宋延军 刊期： 2008年第16期
目的:回顾性分析化疗后骨髓抑制期输注体外扩增的异基因骨髓间充质干细胞治疗低增生性复发难治性急性髓细胞白血病的可行性与安全性.方法:①53岁女性患者1例,2002-01在南京医科大学第一附属医院确诊为急性髓细胞性白血病M0型,予HA、EA等诱导方案化疗后达完全缓解,在随后的4年中给予包括MA、中剂量Ara-C、DA、TA在内的多次巩固治疗以维持完全缓解.2006-01中性粒细胞缺乏,白血病复发.同年3月再次给予TAE方案诱导治疗未缓解,骨髓持续低增生,并持续粒细胞缺乏达半年.②患者有一位HLA配型完全相合的同胞姐姐,为行异体造血干细胞移植,于2006-07再次入院,患者及其家属对治疗知情同意,实验经医院伦理委员会批准.③患者于2006-08-23予CAG方案化疗,即阿柔比星10 mg/d,×8 d;阿糖胞苷15 mg/次,2次/d,×14 d;2006-08-23～2006-09-25给予洁欣300 μg/d.化疗过程中骨髓抑制进一步加重,并出现霉菌性败血症等重症感染.抗感染治疗的同时,于CAG化疗结束后第2天输注经体外扩增的异基因骨髓间充质干细胞,细胞数为1.4×106/kg受者体质量,以促进骨髓造血恢复支持治疗.结果:异基因骨髓间充质干细胞输注后第15天,中性粒细胞数达到半年多来第1次大于0.5×109 L-1.输注1个月后,外周血白细胞数5.5×109 L-1,中性粒细胞数4.64×109 L-1,血红蛋白量94 g/L,血小板数25×109 L-1,外周血象渐恢复正常水平.复查骨髓涂片显示骨髓三系增生活跃,原始细胞占0.4%,骨髓流式细胞仪检查MRD阴性,骨髓达完全缓解,感染症状逐渐控制.随访半年,患者持续完全缓解,未有移植物抗宿主病等并发症出现.结论:CAG方案联合输注体外扩增的异体骨髓间充质干细胞有助于衰竭骨髓的造血重建,对长期反复化疗后出现低增生性复发难治急性白血病患者的治疗是一个新的有前途的方法,但其安全性与有效性需要通过临床试验进一步证实.
作者：陆世丰；陆化；刘澎；沈文怡；洪鸣；张建富；杨慧；李建勇 刊期： 2008年第16期
目的:大量研究表明,类胰岛素生长因子I促成肌细胞增殖作用明显,低浓度水平就有活性,但是对于其作用机制目前还不太清楚.应用流式细胞仪碘化丙啶染色法(PI法)检测成肌细胞生长周期,拟探讨类胰岛素生长因子I对原代及传代人胚骨骼肌成肌细胞体外增殖的作用与机制.方法:实验于2004-06/12在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室、干细胞与组织工程研究室以及成都市第三人民医院检验科流式细胞室完成.在产妇知情同意的前提下,选取孕8～12周水囊引产胎儿,性别不限,切取部分小腿腓肠肌与股四头肌组织后,采用文献的方法进行成肌细胞分离、纯化与传代培养,实验经医院伦理委员会批准.选取原代、第2、4、6代成肌细胞以1×105 /孔密度接种于24孔板,每3孔为1组计7组.1～7组细胞以无血清F12培养基同步化后分别予以含0,1,2,4,8,16,32 μg/L类胰岛素生长因子I的培养基,运用核素掺入法确定类胰岛素生长因子I促增殖的适宜浓度用于实验.同步化后其中一板的生长培养基不加类胰岛素生长因子I作为对照组;另一个加入适宜浓度的类胰岛素生长因子I作为实验组.每组每天取3孔细胞计数,绘制生长曲线,推算成肌细胞的群体倍增时间,作为细胞增殖周期TC.运用流式细胞技术PI法分别测定细胞生长周期和各亚周期时相时间.结果:4～8 μg/L 类胰岛素生长因子I具有良好促进成肌细胞增殖的能力.各代的实验组与对照组成肌细胞在24 h后进入对数生长期,各实验组细胞生长曲线明显左移.6代以内成肌细胞的增殖周期、各亚周期细胞百分比、各亚周期所占时相以及各代细胞对类胰岛素生长因子I的反应一致,生长模式与能力一致,细胞倍增时间平均从4.8 d缩短到3.3 d.结论:类胰岛素生长因子I能促进成肌细胞体外增殖,成肌细胞的增殖指数明显提高.其促增殖作用是通过缩短DNA合成前期和合成期来实现的.
作者：张峻梅；岑石强；杨志明；解慧琪；唐方 刊期： 2008年第16期
背景:诱导因子及软骨微环境是影响骨髓基质干细胞成软骨分化及软骨形成的主要因素.目的:利用少量软骨细胞以共培养方式诱导骨髓基质干细胞体内成软骨.设计、时间及地点:2004-09/2005-03在解放军第四军医大学口腔医院病理教研室完成的随机对照动物实验.材料:选择清洁级新西兰兔15只用于细胞支架复合物的种植,随机分为混合细胞组、软骨细胞组、骨髓基质干细胞组,5只/组.取新生1～3 d龄新西兰兔5只用于骨髓基质干细胞、软骨细胞的分离培养.聚羟基乙酸无纺网支架为上海易括公司产品,材料直径15 μm,平均间距150～200 μm,孔隙率97%,厚2 mm.方法:混合细胞组将骨髓基质干细胞与软骨细胞按3:1混匀,调整细胞密度为6.0×1010 L-1,接种于经培养液预湿的塑形聚羟基乙酸 5 mm×5 mm的支架上,然后在复合物周围滴加含胎牛血清的DMEM液培养1周.软骨细胞组、骨髓基质干细胞组的细胞密度调整为6.0×1010 L-1后同法接种于支架上.各组兔麻醉后于背部一侧皮下组织植入对应的细胞-支架复合物.主要观察指标:植入后第8周行新生软骨大体观察和苏木精-伊红、Masson三色染色.结果:各组细胞与聚羟基乙酸支架黏附情况良好.植入8周后,混和培养组和软骨细胞组均形成了成熟的软骨样组织,并基本保持复合物初始的大小和形状,两组新生软骨外观及组织学特征较接近.骨髓基质干细胞组在体内培养过程中未形成软骨组织,而是形成了纤维结缔组织.结论:骨髓基质干细胞与软骨细胞按3:1混合形成的微环境,能有效诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化,并促进骨髓基质干细胞的体内成软骨.
作者：倪云峰；李小飞；刘源；雷战军；卢强 刊期： 2008年第16期
目的:寻找白血病细胞和正常细胞之间生物特性的差异,进而利用这种差异进行靶向治疗,在大限度地杀伤白血病细胞的同时保护正常细胞是近年来白血病药物治疗一直在探索的领域.测定白血病细胞K562、HL-60细胞低密度脂蛋白胆固醇受体和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CoA)活性,并与正常细胞系HK-2比较,分析其活性变化,并寻找抑制K562、HL-60细胞增殖的有效方法.方法:实验于2006-07/2007-05在青岛大学医学院附属医院中心实验室及血液免疫研究室完成.实验过程中应用的K562(慢粒急变的的白血病)、HL-60(原髓细胞白血病)细胞株为中国医学科学院血液病研究所惠赠.参照孟凡青方法并加以改进,采用低浓度阿托伐他汀抑制细胞内源性胆固醇合成途径,提供外源性低密度脂蛋白胆固醇供细胞生长,应用MTT比色法检测细胞分裂生长抑制率,进而判断低密度脂蛋白受体活性.应用紫外分光光度法测定细胞3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶活性;采用MTT法观察HMG-CoA抑制剂阿托伐他汀对 K562、HL-60和HK-2细胞增殖作用的影响:将对数期生长的细胞按每孔100 μL接种于96孔培养板中,阿托伐他汀用RPMI1640分别配成10,20,40,80,160 μmol/L加入培养体系,每孔100 μL,以不加药物而加含10%胎牛血清的RPMI1640 100 μL及上述细胞100 μL的培养体系为对照.结果:与正常细胞HK-2比较,白血病细胞K562、HL-60低密度脂蛋白胆固醇受体活性增高、HMG-CoA 还原酶活性增高 (P < 0.05);阿托伐他汀以时间和剂量依赖性的方式抑制K562、HL-60细胞增殖,即随着阿托伐他汀处理浓度的加大、作用时间的延长,细胞存活率逐渐下降.阿托伐他对HK-2细胞增殖抑制作用与时间及剂量无关.结论:白血病细胞系K562、HL-60细胞低密度脂蛋白胆固醇受体和HMG-CoA 还原酶活性较正常细胞HK-2增高;阿托伐他汀具有抑制K562、HL-60细胞增殖的作用.
作者：于洁；赵春亭；孙慧丽；杨颉；陈兵；孟冬梅 刊期： 2008年第16期
目的:前期研究表明,吲哚亚甲基异烟腙(简称TJU103)可以明显降低异基因造血干细胞移植小鼠移植物抗宿主病的发生率和程度,明显延长小鼠移植后的生存期.实验拟观察TJU103诱导造血干细胞移植免疫耐受和对移植物抗白血病的影响,探索一条既能降低移植物抗宿主病又能保留移植物抗白血病的移植途径.方法:实验于2007-07/10在南方医科大学珠江医院血液科实验室完成.①实验材料:人急性髓系白血病细胞株KG1a由中国医学科学院血液学研究所宋增璇教授惠赠.10份自愿捐献的健康人外周血白细胞由广州市中心血站提供,等分为供者与受者.②实验方法:采用梯度密度沉淀法常规分离人外周血单个核细胞.以供者外周血单个核细胞作为反应细胞,受者正常外周血单个核细胞作为刺激细胞,体外建立异基因造血干细胞移植中供、受者间的单向混合淋巴细胞反应体系,应用TJU103阻断CD4+T细胞激活的抗原信号通路,设单独刺激细胞和反应细胞对照以及1640完全培养基空白对照.③实验评估:于培养第1、3、5天应用MTT检测TJU103对供者淋巴细胞的增殖活性的影响,于第5天用乳酸脱氢酶释放法分别检测10∶1, 20∶1,40∶1效靶比时供者淋巴细胞对受者单个核细胞和急性髓系白血病细胞KG1a的细胞毒活性影响,同时采用流式细胞仪检测CD4+CD25+T细胞的百分比.结果:第3天和第5天实验组A值低于对照组 (P < 0.05).单向混合淋巴细胞5 d后实验组各效靶比供者T细胞杀伤受者外周血单个核细胞的活性明显低于对照孔 (P < 0.05);二者对KG1a细胞的杀伤活性差异不显著 (P > 0.05).TJU103对供者CD4+CD25+T细胞无影响.结论:TJU103降低T淋巴细胞增殖反应的同时并不影响其抗白血病效应,有望用于临床异基因造血干细胞移植中移植物抗宿主病和移植物抗白血病的免疫调节.
作者：周健；涂三芳；郭坤元；孙明；胡亮杉；吴远彬；卢晓珣；王杨 刊期： 2008年第16期
背景:目前临床上II度根分叉病变区牙周组织的再生仍是一项难题.目的:比较不同密度自体骨髓间充质干细胞修复II度牙根分叉病变区牙周组织缺损的能力.设计:随机对照观察实验.单位:福建医科大学附属口腔医院实验室和福州总医院动物实验科.材料:实验于2005-07/2006-09在解放军南京军区福州总医院动物实验科和福建医科大学附属口腔医院实验室完成.6只1岁半雄性Beagle犬由解放军南京军区福州总医院动物实验科提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.实验中选用Bio-Gide胶原膜和BME-10X胶原膜.方法:在犬的下颌第2,3前磨牙和第1磨牙颊侧根分叉处制备慢性II度牙根分叉病变模型.从6只18月龄的Beagle犬抽取自体骨髓间充质干细胞.应用5×108 L-1,5×109 L-1,5×1010 L-1的骨髓间充质干细胞复合BME-10X胶原膜移植治疗牙根分叉病变,表面覆盖Bi0-Gide胶原膜,单纯Bi0-Gide胶原膜组为对照组.采用OLYPUS IX 71显微照相系统和OLYSIA BioAutoCell软件计算新生牙骨质长度的百分比和新生牙槽骨面积的百分比.主要观察指标:苏木精-伊红染色观察并测量牙周组织再生(新生牙骨质长度和新生牙槽骨面积的百分比)情况.结果:对照组的新生牙骨质长度和新生牙槽骨面积的百分比分别为:(51.5±5.6)%和(27.1±7.7)%;5×108 L-1骨髓间充质干细胞组为:(84.8±8.9)%和(30.6±7.7)%; 5×109 L-1骨髓间充质干细胞组为:(91.8±5.2)%和(68.3±11.4)%;5×1010 L-1骨髓间充质干细胞组为:(88.8±7.2)%和(78.5±12.7)%.细胞组的新生牙骨质量与对照组相比,差异有显著性意义(P < 0.01),但各细胞组间相互比较差异无显著性意义;5×109 L-1组和5×1010 L-1组的新生牙槽骨量与 5×108 L-1组和对照组相比差异有显著性 (P < 0.05),但前两组间和后两组间比较则差异无显著性意义.结论:骨髓间充质干细胞移植能促进牙根分叉病变区的牙周组织再生,其作用与细胞的接种密度有关.
作者：詹暶；闫福华；肖毅 刊期： 2008年第16期
目的:国内外对骨髓间充质干细胞体外成功诱导分化为胰岛素分泌细胞的报道屡见不鲜,但这些诱导方法都比较繁琐,而且大多都应用了细胞因子.实验拟验证体外非细胞因子方法诱导骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的可能性.方法:实验于2005-11/2007-01在大连医科大学诊断学实验中心,校一级实验室完成.①实验材料:4～6周龄Wistar大鼠由大连医科大学实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:无菌条件下取大鼠的骨髓细胞,并通过贴壁时间差异性去除单核细胞从而获得骨髓干细胞.应用二甲基亚砜及高糖环境依次对大鼠骨髓间充质干细胞进行体外诱导,以直接加入含体积分数为0.10胎牛血清的L-DMEM培养基培养的为对照.③实验评估:通过形态、双硫腙染色、免疫组织化学及RT-PCR方法对诱导后的细胞进行检测,采用ELISA方法对诱导后细胞分泌的胰岛素进行检测. 结果:①培养10 d时,诱导组细胞呈细胞团样改变,内层的细胞为圆形,外层的细胞呈长梭形并包绕着内层细胞.对照组细胞也呈团样改变,但形态不规则,呈发散状,细胞呈梭形类似骨髓间充质细胞.②诱导组的细胞团双硫腙染色后呈明显猩红色,对照组形成的细胞团双硫腙染色不显色.③诱导组成团及单个存在的圆形和梭形细胞中有胰岛素存在,对照组细胞团及未成团细胞中无胰岛素存在.④在内参蛋白GAPDH表达量大致相等的条件下,诱导组诱导的细胞表达Ins1和Ins2,对照组培养的细胞不表达Ins1和Ins2.⑤ELISA法证实诱导后细胞向胞外分泌胰岛素,与对照组比较差异显著(P < 0.05).结论:大鼠骨髓间充质干细胞体外经过二甲基亚砜和高糖环境诱导可分化为胰岛素分泌细胞.
作者：张伟；苏本利；孟秀香；刘奔；刘丹丹；王莺燕；范颖 刊期： 2008年第16期
目的:Nur77是介导T细胞凋亡的重要基因,它的激活需要第二信使钙离子,而Nur77基因启动子的钙反应元件是转录因子肌细胞增强因子2D的结合位点.探讨在Nur77诱导T细胞凋亡过程中肌细胞增强因子2D是否可以被乙酰化,以及通过调节Nur77基因乙酰化对T细胞凋亡的影响.方法:实验于2006-11/2007-09在吉林大学第一医院血液肿瘤科完成.①材料:大肠杆菌DH5α、pcDNA3质粒由吉林大学第一医院中心研究室保存.pET32M质粒、Flag-p300质粒、pSilencerTM-p300 RNAi质粒由香港科技大学Zhengguo Wu博士馈赠.NFATp质粒由哈佛大学Yun Chen博士馈赠.Jurkat细胞由吉林大学第一医院血液肿瘤科提供.②实验方法:PCR法产生全长的Nur77和依赖Nur77的荧光报告基因被亚克隆到pcDNA质粒中,产生的肌细胞增强因子2D(1-514)、(1-121)、(1-300)、(301-514)各片段以及含4个赖氨酸(K245/K250/K267/K279)位点突变为精氨酸位点的肌细胞增强因子2D (4KR)突变体亚克隆到pcDNA后在氨基端含有Flag抗原簇,于细菌表达载体上进行质粒构建,验证正确的质粒使用脂质体DMRIE-C进行转染.③实验评估:将Nur77荧光报告基因与肌细胞增强因子2D、p300、NFATp共转染到Jurkat细胞中,检测p300对肌细胞增强因子2D促进Nur77转录的影响.免疫沉淀法检测内源性肌细胞增强因子2D是否能够被乙酰化,以及阻滞p300表达后是否影响其乙酰化.体外乙酰化法检测肌细胞增强因子2D的乙酰化位点.荧光素报告分析法检测肌细胞增强因子2D的乙酰化功能缺失对Nur77转录活性的影响.采用流式细胞仪检测其功能缺陷对Nur77诱导T细胞凋亡的影响.结果:①肌细胞增强因子2D与NFATp的二聚体虽然不能促进Nur77的转录,但p300、NFAT、肌细胞增强因子2D的三聚体却能明显促进Nur77的转录,且p300与肌细胞增强因子2D的二聚体也明显促进Nur77的转录.②PMA/Iono活化钙信号传导通路后,肌细胞增强因子2D被乙酰化.当内源性p300RNAi后,p300的表达被阻滞时,肌细胞增强因子2D的乙酰化水平显著下降.③K245,K250,K267,K279氨基酸同时突变可以使肌细胞增强因子2D乙酰化程度大部分丧失,说明在体外这4个赖氨酸位点是肌细胞增强因子2D的主要乙酰化位点.④与空载体比较,转染乙酰化缺陷的肌细胞增强因子2D可使Nur77转录功能提高2.48倍;与转染野生型的肌细胞增强因子2D比较,转染乙酰化缺陷的肌细胞增强因子2D能降低Nur77基因70.4%的转录功能.⑤与空载体比较,Nur77表达能够促进T细胞凋亡,早晚期凋亡之和从4.3%提高至16.3%;共表达野生型肌细胞增强因子2D与Nur77能够进一步促进T细胞的凋亡,早晚期凋亡之和从16.3%提高到31.0%;但肌细胞增强因子2D乙酰化功能缺失的突变体肌细胞增强因子2D明显降低Nur77介导的T细胞凋亡,早晚期凋亡之和从16.3%降低到9.2%.结论:p300对肌细胞增强因子2D促进Nur77的转录起主要作用.肌细胞增强因子2D在Nur77诱导的T细胞凋亡过程中可以被乙酰化,乙酰化的肌细胞增强因子2D通过上调Nur77基因的转录来促进T细胞凋亡.
作者：杨艳萍；王冠军；马克威 刊期： 2008年第16期
目的:细胞外基质蛋白是整合素重要的配体,通过信号转导系统可影响细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖和分化.细胞外基质蛋白是否参与小胶质细胞的活化过程,是否参与小胶质细胞调控表达整合素而进一步参与一些疾病的进展,目前尚不清楚.实验拟观察纤维结合蛋白、玻璃体结合蛋白和层黏连蛋白3种细胞外基质蛋白对大鼠小胶质细胞整合素表达的影响.方法:实验于2006-05/2007-08在华中科技大学同济医学院临床神经研究中心完成.①实验材料:新生Wistar大鼠由同济医学院实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:体外分离培养和纯化大鼠小胶质细胞,应用纤维结合蛋白、玻璃体结合蛋白和层黏连蛋白包被培养板,以未加任何细胞外基质成分的为对照.③实验评估:采用流式细胞术检测3种细胞外基质蛋白对小胶质细胞MHCⅠ类分子的表达和整合素表达的影响.结果:①相对于对照组,添加纤维结合蛋白和玻璃体结合蛋白的培养基使小胶质细胞MHCⅠ类分子表达明显增加(P < 0.001),添加层黏连蛋白的培养基使小胶质细胞MHCⅠ类分子表达明显下降(P < 0.05).②相对于对照组,添加纤维结合蛋白的培养基可以上调小胶质细胞α4亚基的表达、α5亚基和Mac-1整合素(即αMβ2)表达(P均 < 0.005),添加玻璃体结合蛋白的培养基同样可上调α4亚基表达、α5亚基和Mac-1表达(P < 0.05,P < 0.005).层黏连蛋白对α4亚基,α5亚基和Mac-1整合素表达无影响,但可以上调小胶质细胞表达αⅤ亚基(P < 0.005),纤维结合蛋白和玻璃体结合蛋白对αⅤ亚基表达无影响.纤维结合蛋白、层黏连蛋白和玻璃体结合蛋白可小胶质细胞LFA-1(即αLβ2)表达增加(P < 0.001,P < 0.005),α6亚基表达下调(P < 0.005).结论:细胞外基质成分纤维结合蛋白和玻璃体结合蛋白可促进小胶质细胞的活化,使小胶质细胞α4β1和α5β1和Mac-1的表达增加.层黏连蛋白不能促进小胶质细胞的活化.
作者：薛峥；张苏明 刊期： 2008年第16期
目的:经冠状动脉途径行自体骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死已有较多改善心功能的肯定结论.实验拟验证骨髓间充质干细胞自体移植心肌梗死犬的细胞因子分泌情况,及其对血管新生和心肌细胞凋亡的作用.方法:实验于2005-12/2007-05在安徽医科大学第一附属医院动物实验室和中心实验室完成.选择健康杂种犬36只,无菌抽取犬骨髓液10 mL,经Percoll液密度梯度离心后贴壁法体外培养骨髓间充质干细胞,传2代后行5-氮胞苷诱导,5-溴脱氧尿苷标记备用.结扎冠状动脉途左前降支建立急性心肌梗死模型,术后随机分为细胞移植组、模型对照组,12只/组.细胞移植组分别在梗死区边缘4个不同部位点局部注射植入骨髓间充质干细胞悬液2 mL,模型对照组在相同对应部位注射等量DMEM培养基.术后取心肌梗死组织进行指标检测.结果:①经流式细胞仪检测,传至第3代后的骨髓间充质干细胞CD34和CD11b阳性率小于5%,CD44和CD105阳性率高达90%以上.②原位末端标记结果示,细胞移植组心肌细胞凋亡指数显著低于模型对照组(P < 0.01).③免疫组织化学检测显示,移植后2周细胞移植组梗死区微血管密度明显高于模型对照组(P < 0.05);随移植时间的延长,细胞移植组梗死区新生微血管密度逐渐增加,趋势检验差异有显著性意义(F=439.588,P < 0.01).移植后1,2,4周与模型对照组比较,细胞移植组心肌梗死区血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的表达均显著升高(P均 < 0.01).结论:自体骨髓间充质干细胞移植心肌梗死犬后,能分泌血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子,诱导血管新生,同时抑制心肌细胞凋亡.
作者：余其贵；王永；吴继雄 刊期： 2008年第16期
目的:茶黄素是红茶中的主要成分,具有调节血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗心脑血管疾病等多种药理活性.以往茶黄素对人体内脂肪代谢的影响多数属于宏观分析,实验在细胞水平上探讨茶黄素对兔骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化的影响.方法:实验于2007-05/09在安徽医科大学附属省立医院中心实验室完成.①动物:清洁级4～8周龄家兔10只,由安徽医科大学动物试验中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:兔全身肝素化后麻醉状态下处死,取双侧股骨胫骨和肱骨,去除软组织,切除包括骺板在内的两侧骺端,采用全骨髓法分离培养骨髓基质干细胞,按2×108 L-1密度接种,当细胞生长至80%～90%融合时消化传代.取传至3代的细胞按1×105/cm2密度接种,加入含重组人胰岛素 10 mg/L、地塞米松10-6 mol/L、0.5 mmol/L IBMX的DMEM成脂诱导液培养2周.设立3组:脂肪对照组单纯放入成脂诱导液1 mL;茶黄素组向1 mL成脂诱导液中加入500μg/L茶黄素;空白对照组仅加入等量普通DMEM培养液.③实验评估:取第2代培养细胞绘制生长曲线;油红O染色对诱导的脂肪细胞进行鉴定,计算脂肪细胞转化率.结果:①细胞生长曲线:骨髓基质干细胞具有旺盛的增殖能力,培养1 d为细胞适应期,3 d后为对数增长期,8 d时进入平台期,之后细胞增殖迅速减慢,细胞数下降.②脂肪细胞油红O染色鉴定结果:脂肪细胞中的脂滴被染成橙红色,胞核为蓝色.脂肪对照组多数骨髓基质干细胞诱导为脂肪细胞,转化率为(64.8±4.8)%,茶黄素组仅为(32.0±3.4)%,空白对照组未见明显脂肪细胞形成.结论:茶黄素可明显抑制兔骨髓基质干细胞向脂肪细胞方向的分化.
作者：李府；尚希福；谢涛 刊期： 2008年第16期
目的:研究发现,应用骨髓间充质干细胞联合周围神经移植治疗脊髓损伤有协同作用.实验拟验证自体骨髓间质干细胞联合周围神经移植治疗脊髓损伤的临床疗效,为脊髓损伤的治疗开辟新途径.方法:选择2003/2004河南省人民医院神经外科干细胞移植治疗中心收治的78例完全性脊髓损伤患者.男52例,女26例,年龄18～52岁.其中颈髓损伤12例,胸髓损伤46例,腰骶髓损伤20例,损伤1周至60个月.患者对治疗知情同意,并要求采用该方法治疗.无菌条件下,自患者髂前上棘及髂后上棘通过骨髓穿刺抽取骨髓,分离、纯化、培养骨髓间充质干细胞.选取患者自体腓肠神经作为周围神经移植供体,将自身腓肠神经应用显微外科方法去除外膜、束膜,并剪神经,使神经组织的质地、外观类似于马尾组织,将其排列呈多条状、纵行植入已切开的脊髓处或原囊肿腔内,然后用分离纯化的骨髓间充质干细胞移植焊接移植的神经,对患者行自体骨髓间充质干细胞联合周围神经移植治疗,术后给予神经生长因子等药物应用, 疗程为1个月,以促进损伤神经的修复.实验评估:通过电话随访和患者定时回医院复查的方式,术后每3个月随访1次,随访1年.术前、术后和随访按国际截瘫医学会评分标准ASIA评分标准评分,评分的增高表示患者的运动和感觉的功能的恢复.同时进行神经电生理、影像学等方面对比分析.结果:78例患者中除1例严重复合伤患者出现并发症,经积极治疗无效死亡,其余患者术后均顺利出院,原有症状改善情况,未出现明显不良毒副反应.患者术后ASIA评分的平均数较术前提高.37例出现运动、感觉、影像学、神经电生理方面的不同改善,25例出现不同程度的运动,感觉、神经电生理方面的改善,9例出现神经电生理方面的改善,6例无变化,1例死亡;在随后的1年随访中,除2例失访外,其余患者均有不同程度进一步恢复的趋势,无明显毒副反应发生.结论:自体骨髓间质干细胞联合周围神经移植治疗脊髓损伤促进脊髓损伤患者的功能恢复,安全有效,有临床推广应用的价值.
作者：李志营；步星耀；张圣旭；梁庆华；李太平；陈书连；李六一；赵耀武；翟亚平；张永福 刊期： 2008年第16期
背景:目前神经干细胞的定向分化是神经干细胞研究的热点.脑源性神经生长因子作为诱导剂可否诱导神经干细胞分化为神经元.目的:观察在表皮生长因子培养条件下,不同质量浓度脑源性神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化的影响.设计:对比实验.单位:中国医科大学人体解剖学教研室.材料:实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成.提取成年SD大鼠海马神经干细胞,无血清技术培养.清洁级成年SD大鼠3只,体质量200～250 g,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.实验过程中应用的表皮生长因子、脑源性神经生长因子均由R&D公司提供.方法:①无菌条件下分离大鼠海马组织,用含碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养神经干细胞.②取第4代神经干细胞,利用有限稀释法进行单细胞克隆培养.将单细胞克隆传代后的克隆球细胞进行神经干细胞的鉴定.克隆球细胞行巢蛋白免疫细胞化学染色,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色.③单细胞克隆的神经干细胞脑源性神经生长因子诱导分化实验,根据脑源性神经生长因子质量浓度不同分成0 μg/L浓度的对照组和50、100、150、200μg/L浓度的4个实验组,各组的培养液中均加入表皮生长因子,诱导分化1周后进行神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色,检测神经干细胞向神经元分化情况.主要观察指标:神经干细胞分化为神经元的比例.结果:①神经干细胞免疫细胞化学染色结果显示,单细胞克隆培养后克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达.②50,100μg/L组脑源性神经生长因子组神经干细胞分化为神经元比例明显高于对照组、150,200 μg/L脑源性神经生长因子组组(t=2.502～5.025,P < 0.05);50,100 μg/L脑源性神经生长因子组之间神经干细胞分化为神经元的比例差异不显著 (P > 0.05);对照组、150,200 μg/L组3组间神经干细胞分化为神经元比例差异不显著(P > 0.05)结论:在20 μg/L 表皮生长因子培养条件下,脑源性神经生长因子促使神经干细胞向神经元分化的较佳质量浓度为50 μg/L.
作者：王振宇；佟雷；季丽莉；赵久红；唐源远 刊期： 2008年第16期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
