田阳春；郑玲；袁英；石玥
在肿瘤形成学说中有随机学说与阶层学说两种.阶层学说认为肿瘤起源细胞即为肿瘤干细胞.在白细胞以及部分实体肿瘤中的一部分肿瘤细胞具有无限增殖的能力,并可形成新的肿瘤灶,称之为肿瘤干细胞.肿瘤干细胞是肿瘤转移、复发的根源.肿瘤是干细胞长期自我更新过程中,由于多基因突变导致其生长失去了正常调控而停止在分化的某一阶段无限制增殖所形成,所处的微环境通过某些信号通道以及分泌多种细胞因子来发挥调控作用,而微环境的改变致使干细胞的分化方向发生改变可能是肿瘤发生的基础.目前,利用细胞不同表面抗原标记及侧群细胞分选是肿瘤干细胞分选的两种常用方法.侧群细胞分选更为方便、经济,并可表面标记未知肿瘤干细胞的分选.肿瘤干细胞的鉴定只能用功能学方法,即对其自我更新能力与分化潜能两个主要特征进行评价.肿瘤干细胞放射抗拒的机制可能与损伤DNA的修复.影响细胞周期调控、细胞凋亡、增殖等转导通路改变有关.将肿瘤干细胞作为放射治疗的切入点,针对其放射生物学行为制订对策,才能从根本上解决问题.
作者：王一鸣；符生苗 刊期： 2008年第29期
背景:在胚胎干细胞向肝细胞诱导分化的培养条件基础上增加向胆管上皮细胞分化的培养条件,使其向胆管上皮细胞方向分化在理论上是可行的.目的:验证在细胞生长因子胚胎干细胞体外定向分化为胆管上皮细胞的可行性.设计:单一样本观察.单位:中山大学附属第一医院.材料:选用BALB/c系小鼠胚胎干细胞(BALB/c-ES)由中山大学实验动物中心建系和保存.分化生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、上皮生长因子、角化细胞生长因子均为美国Sigma公司产品,实验用抗小鼠细胞角蛋白7(CK7)和细胞角蛋白19(CK19)购自丹麦DAKO公司,间接免疫荧光试剂盒为美国Biodesign产品,IX70-S8F2倒置相差荧光显微镜为日本OLYMPUS产品.方法:实验于2004-10/2005-06在中山大学附属第一医院中心实验室完成.①将小鼠胚胎干细胞进行拟胚体分化,在培养系统中按不同时间段分别添加分化生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、上皮生长因子、角化细胞生长因子,使胚胎干细胞向胆管上皮细胞方向分化.以培养液中不添加上述细胞生长因子为对照组,使胚胎干细胞自然分化.②采用倒置相差荧光显微镜动态观察细胞生长及三维的环状结构形成情况.③于细胞分化第10天开始采用免疫细胞化学方法检测胆管上皮细胞标记物CK7、CK19,γ-谷胺酰转肽酶(GGT)表达变化,同时观察γ-谷胺酰转肽酶阳性细胞的形态学特点.主要观察指标:①细胞生长及三维环状结构形成情况.②胆管上皮细胞标记蛋白CK7、CK19的表达.③胆管上皮细胞标记酶GGT表达及其阳性细胞形态学情况.结果:①细胞生长及三维的环状结构形成情况:胚胎干细胞悬浮培养10 h后即可见小的拟胚体形成并悬浮在培养液中.分化第10天在拟胚体细胞分化群落中出现一种三维的环状结构,细胞呈同心圆层状排列,内层细胞排列紧密,继续培养.内层细胞逐渐排列疏松,分化20 d左右时细胞活力达到好,其后活力开始下降,分化36 d时三维结构裂解并呈条索状悬浮于培养液中.对照组环状结构于第13天出现,细胞结构于27d裂解.②CK7,CK19表达:胆管上皮细胞环状结构形成当日即有CK7表达,分化第13天时CK19表达,其后两者同时表达于三维结构细胞中并随培养时间增加而表达逐渐增强.对照组细胞在分化第13,15天开始出现CK7,CK19表达.③胆管上皮细胞标记酶GGT表达及其阳性细胞形态学变化:加入生长因子后,细胞环状结构形成初始即表达GGT,说明此结构中含有胆管上皮细胞.在环状结构形成初始,细胞间连接紧密,不能分清单个细胞结构,随着培养时间增长,单细胞结构逐渐清晰.GGT阳性细胞呈多角型或方形排列,核位于中央,细胞器较少,胞质染色较浅,符合立方上皮细胞特点,体现出胆管上皮细胞的形态学特点.结论:胚胎干细胞在细胞生长因子的作用下可定向分化为胆管上皮细胞并可以形成类胆管样结构.
作者：胡安斌；何晓顺；蔡继业；郑启昌 刊期： 2008年第29期
神经干细胞存在于人类神经系统中,具有自我更新、活跃的增殖和分化能力、向脑内病变部位迁移以及分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力.近年来神经干细胞疗法已成为治疗多种疾病的新策略,其目的是替代、修复或加强受损的细胞或器官的生物学功能,是基因疗法的一种理想的靶细胞.应用主要集中以下几方面:①直接细胞移植进行替代治疗,神经下细胞作为细胞移植的来源,可以通过神经干细胞的体外移植或体内神经干细胞的激活,分化为神经元和胶质细胞,与已经存在的细胞结构整合到一起.②作为基因载体,携带治疗作用的报告基因进行移植,从而达到细胞替代和基因治疗的双重作用.③通过对生长因子和细胞因子的研究.诱导自身的神经干细胞分化进行神经自我修复.可广泛应用于脑外伤、脑血管病后脑功能损伤、脑瘤及其他疾病的治疗.
作者：李明军；张琦玮；王维峰；杨波；李顺业 刊期： 2008年第29期
背景:急性移植物抗宿主病仍然是限制异基因造血干细胞移植临床应用的主要障碍之一,已证实造成发病的首要因素是转化生长因子β1、肿瘤坏死因子α、干扰素γ等分泌异常.目的:拟通过建立小鼠异基因骨髓移植模型诱导急性移植物抗宿主病反应,检测外周血血清中Th1及Th2型代表因子干扰素γ、白细胞介素4的表达水平,分析其与急性移植物抗宿主病严重程度的关系.设计、时间及地点:随机对照体内移植实验,于2005-08110在北京口腔医院动物部及首都医科大学附属北京友谊医院完成.材料:清洁级C57BL/6(H-2b)雄鼠20只作为供鼠用于制备骨髓细胞及脾脏淋巴细胞,BALB/c(H-2d)雌鼠50只作为受鼠,随机分为正常对照组10只、骨髓细胞移植组20只、混合移植组20只.方法:骨髓细胞移植组、混合移植组均给予总剂量9.0Gy的6MV-X射线照射,前者经尾静脉单纯输入异基因骨髓细胞2.0×107个,后者混合输入异基因骨髓细胞、脾脏淋巴细胞各2.0×107个.主要观察指标:记录小鼠生存时间,计数外周血白细胞,ELISA法测定移植后不同时间外周血血清中细胞因子水平,苏木精-伊红染色观察组织病理学变化.结果:骨髓细胞移植组从第8天开始出现死亡,混合移植组从第4天开始出现死亡.前者平均生存时间明显长于后者,Kaplan-Meier法检验P<0.05.移植后第7天,骨髓细胞移植组白细胞数明显低于混合移植组(P<0.05),第14,21天两组白细胞数比较差异无显著性意义(P>0.05).与骨髓细胞移植组比较,移植后第7,14天混合移植组白细胞介素4水平明显降低(P<0.05,P<0.01),干扰素γ水平明显升高(P<0.05).骨髓细胞移植组镜下可见肝细胞轻度变性,小肠有少量淋巴细胞浸润,病理分级为Ⅰ、Ⅱ级.混合移植组肝细胞呈不同程度的变性或坏死,小肠绒毛坏死脱落,黏膜下层大量淋巴细胞浸润,病理分级为Ⅲ-Ⅴ级.结论:随着急性移植物抗宿主病程度的加重,血清白细胞介素4水平明显下降,干扰素y水平显著升高,尤其在发病早期两种细胞因子变化更为明显.
作者：王昭；李卉惠；冯翠翠；李芳 刊期： 2008年第29期
背景:骨髓间充质干细胞在一定条件下可分化成为多种结缔组织细胞,也可分化成神经系统的神经元和神经胶质细胞.目的:观察采用免疫磁珠法分离成人骨髓来源神经干细胞的生物学特征.设计、时间及地点:以患者自身骨髓组织为观察对象的实验,于2003-03/2007-06在菏泽市立医院检验科完成.材料:骨髓组织来自菏泽市立医院神经内科住院的中风、老年性痴呆、帕金森病、脑缺血等神经系统疾病患者.方法:利用免疫磁珠表面的特异性抗体与骨髓组织中神经干细胞抗原相结合,在磁场作用下使结合磁珠与其他细胞分离,从而获得神经干细胞,再将所分离的纯化神经干细胞接种到含体积分数为0.20胎牛血清的Eagles MEM培养液,再在培养基中加入碱性成纤维因子和表皮生长因子进行原代培养.主要观察指标:采用免疫组织化学染色与免疫荧光染色鉴定细胞,并采用流式细胞术测定细胞DNA含量.结果:在相差显微镜下观察培养的神经干细胞,细胞形态丰满,胞核及核仁清晰可见,神经突起粗大,网络稠密.免疫组织化学和免疫荧光染色显示,细胞神经元特异性烯醇化酶、神经蛋白、胶质纤维酸性蛋白酶、微管相关蛋白为阳性.传代后的细胞用流式细胞术测定DNA含量为正常二倍体,无诱发突变.结论:利用免疫磁珠表面的特异性抗体与骨髓组织中神经干细胞抗原相结合方法从成人骨髓分离出神经干细胞,在神经化学和形态上已具备神经细胞的特征.
作者：李善玉 刊期： 2008年第29期
背景:干扰素调节因子4是B细胞终末分化的重要转录因子,限制性表达于淋巴细胞,在基因调控中起重要作用,但其与疾病预后的终关系仍未确定.目的:假设干扰素调节因子4在B淋巴细胞中的表达与细胞耐药有关,观察新型抗肿瘤药蛋白酶体抑制剂硼替佐米对干扰素调节因子4的影响.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2006-03/2007-02在河南省肿瘤医院中心实验室完成.材料:Daudi和Namalwa细胞株由上海血液学研究所提供.阿霉素为山西普德药业有限公司产品,硼替佐米为西安杨森公司产品.方法:将Daudi和Namalwa细胞各自接种于200 μ L RPMI-1640培养体系中,分别加入0,5,10,20,30,50,100 μg/L阿霉素:对T-Namalwa细胞,另设立联合用药组,即15nmol/L硼替佐米+上述各浓度阿霉素:药物处理48h后,加入MTT继续培养.选择单药50 μg/L阿霉素、15 mnol/L硼替佐米以及两药联合作用Namalwa细胞12,24,48,72h,行半定量RT-PCR和Western印迹分析.主要观察指标:干扰素调节因子4在细胞株中的表达.MTT法检测细胞增殖抑制率.AnnexinV/PI法检测细胞凋亡情况.药物对Namalwa细胞干扰素调节因子4基因和蛋白表达的影响.结果:Namalwa细胞表达干扰素调节因子4基因和蛋白,Dandi细胞中未检测出其表达.各浓度阿霉紊作用48 h后,Daudi细胞增殖抑制率显著高于Namalwa细胞(P<0.05);阿霉素联合硼替佐米共培养48 h,Namalwa细胞增殖抑制率显著高于单药阿霉素(P<0.05).硼替佐米、阿霉素联合硼替佐米作用48 h细胞凋亡率显著高于单药阿霉素(P<0.01).单药阿霉素处理12,24,48,72 h,干扰素调节因子4基因和蛋白均未发生明显变化:单药硼替佐米处理48 h干扰素调节因子4基因表达开始下调,72h出现蛋白表达下调;两药联合处理24 hEP出现干扰索调节因子4基因表达下调,4Bh随之出现蛋白表达下调.结论:Namalwa细胞中干扰素调节因子4的表达与阿霉素耐药有关,硼替佐米能够下调干扰素调节因子4的表达,克服阿霉素的耐药.
作者：王姣杰；宋永平；刘艳艳；李玉富；高全立；魏旭东 刊期： 2008年第29期
背景:研究发现促红细胞生成素尚具有多种非血液系统生理效应,如参与哺乳动物胚胎的正常发育、抑制炎症、促进血管生长.以及在多种组织和细胞损伤中抑制细胞凋亡、减少梗死面积、促进功能恢复等作用.目的:观察重组人促红细胞生成素与骨骼肌卫星细胞联合移植对兔急性心肌梗死是否具有积极作用?设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-01/07在深圳市人民医院中心实验室完成.材料:自体移植:清洁级雄性新西兰大白兔50只,随机分为假手术组、模型对照组、细胞移植组、重组人促红细胞生成素组、联合组,10只/组.异体异性移植:同品系雄性新西兰大白兔10只,作为供体用于制备骨骼肌卫星细胞;另取雌性兔10只作为受体,分为细胞移植组、联合组,5只/组.重组人促红细胞生成素为沈阳三生制药股份有限公司产品.方法:自体移植实验:除假手术组外,其余4组建立急性心肌梗死模型.重组人促红细胞生成素组、联合组在冠脉结扎同时,采用肌注法一次性给予重组人促红细胞生成素3 000 U/kg;细胞移植组、联合组将含有约107个骨骼肌卫星细胞的DMEM溶液200 μ L多点直接注射在心脏表面梗死区.异体异性移植实验:细胞移植组、联合组均建立急性心肌梗死模型,根据分组要求注射骨骼肌卫星细胞和重组人促红细胞生成素,浓度及方法同上,5 d后取材行PCR检测.主要观察指标:测定心肌梗死面积,免疫组织化学法检测心肌组织血运改善及desmin表达,荧光检测骨骼肌卫星细胞,SRY基因PCR检测结果.结果:移植后4周与模型对照组比较,细胞移植组、重组人促红细胞生成素组、联合组心肌梗死面积均明显减小(P<0.05),且联合组减小幅度强于另外两组(P<0.05).各组梗死中心区CD34阳性细胞数量与上面结果相似.细胞移植组、联合组心肌组织desmin呈阳性表达,其余3组呈阴性.联合组移植区DAPI标记的蓝色荧光细胞数较细胞移植组明显增多.异体异性移植实验中,联合组SRY基因扩增条带的宽度和亮度均明显强于细胞移植组.结论:重组人促红细胞生成素与骨骼肌卫星细胞联合移植能够进一步缩小兔心肌梗死面积,改善梗死区血运,提高骨骼肌卫星细胞移植后的存活率,二者对治疗急性心肌梗死具有协同作用.
作者：陈科奇；董少红；罗林杰；张鹏；梁新剑；庞新利；李江华 刊期： 2008年第29期
背景:通过直接转入基因可强化调控骨髓间充质干细胞特异性分化.所以,有效的基因转染技术是髓间充质干细胞可以在组织工程中使用的关键.目的:选择Nucleofector TM技术转染大鼠骨髓间充质干细胞的优化转染方案,为高效体外转染大鼠髓间充质干细胞提供一个新方法.设计、时间及地点:对比观察细胞基因工程实验,于2007-10/12在南方医科大学珠江医院神经外科实验室完成.材料:骨髓间充质干细胞来源于SD大鼠,三四周龄,清洁级,体质量60～70 g.实验过程:采用密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,采用全骨髓法+神经干细胞培养基获得巢蛋白阳性细胞.运用NucleofectorTM技术的A33及A31程序,分别用1,5,10 μ g重组质粒pEGFP-C1转染骨髓间充质干细胞及巢蛋白阳性细胞,并将转染后的细胞分别培养在含体积分数为0.10及体积分数为0.20胎牛血清的培养基中.主要观察指标:①通过Leica DMIRE荧光显微镜F观察和计数表达绿色荧光的细胞计数转染率.②台盼蓝排斥实验检测细胞活力.③用RT-PCR法分析胰腺十二指肠同源基因1基因在转染细胞中的表达.结果:应用NucleofectorTM技术的A33程序转染神经干细胞较转染骨髓间充质干细胞的转染率高,并优于A31程序.转染后在含体积分数为0.20胎牛血清中培养的细胞24 h转染率及存活率均显著高于在含体积分数为0.10胎牛血清培养的细胞(P<0.05).RT-PCR检测转染重组质粒的巢蛋白阳性细胞中可见胰腺十二指肠同源基因1的mRNA表达,未转染胰腺十二指肠同源基因1的巢蛋白阳性细胞无胰腺十二指肠同源基因1的mRNA表达.结论:运用Nucleofector TM技术的A33程序以5 μ g的DNA转染骨髓来源的巢蛋白阳性细胞,转染后的细胞接种于含体积分数为0.20胎牛血清的培养基中可获得较高的转染效率及较高的存活率.
作者：王海澜；蒋泽生；李爱辉；潘明新；高毅 刊期： 2008年第29期
背景:细胞分化、细胞融合乃至克隆均需要应用分离细胞核的方法以获得大量有活性的细胞核,但是目前很难在数量和质量上同时达到较高的水准.目的:探索简单易行的分离细胞核的方法,为神经元细胞核移植、细胞拆合以及细胞核成分的研究提供大量完好有活性的细胞核.设计、时间及地点:对比实验,于2006-09/2007-01在南京医科大学基础医学院卫生部抗体技术重点实验室完成.材料:Cytochalasin B为Sigma公司提供,清洁级SD孕大鼠来源于南京医科大学动物实验中心.方法:取胎鼠大脑皮质,进行神经元的培养并鉴定.用Cytochalasia B结合梯度离心法及细胞核分离液法两种方法进行细胞核分离的对比观察.主要观察指标:用碘化丙啶标记后进行流式细胞仪检测凋亡率并用免疫荧光染色对细胞核进行形态学观察.结果:两种方法均成功地分离出大量有活性神经元细胞核,且梯度离心法可以得到较为完整的胞质体,与完整细胞细胞核荧光强度比较无显著性差异(P>0.05).结论:Cytochalasin B结合梯度离心法及细胞核分离液法均能够有效地进行神经元细胞核的分离,且细胞核在短期内有较高的活性.
作者：冯伟生；阮成钧；冯振卿；仇振宁；顾萍；张化彪 刊期： 2008年第29期
背景:研究证明过氧化物酶体增殖物激活受体γ具有上调内皮祖细胞的功能.目的:验证过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂吡格列酮对体外培养自发性高血压大鼠骨髓来源内皮祖细胞数量及功能的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-05/08在解放军第四军医大学西京院心脏内科国家重点实验室完成.材料:选取清洁级自发性高血压大鼠及周龄、体质量相匹配的正常血压WKY大鼠各20只.方法:随机将自发性高血压大鼠及正常血压WKY大鼠各分为药物组和对照组,每组10只.分别给予毗格列酮(20 mg/kg·d)或等量生理盐水预处理14 d.于试验开始前1 d和结束当天分别测各组大鼠尾动脉收缩压.以密度梯度离心法分离骨髓来源单个核细胞体外培养,差速贴壁法培养收集贴壁细胞.主要观察指标:鉴定内皮祖细胞;测定内皮祖细胞数量;采用四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖活力及一氧化氮分泌功能.结果:吡格列酮治疗后,正常WKY大鼠内皮祖细胞数量、增殖及一氧化氮分泌功能无明显变化:自发性高血压大鼠内皮祖细胞数量增加,增殖能力增强,一氧化氮分泌增加,3项与对照组比较,差异均具有显著性意义(P<0.01,P<0.05,P<0.01).结论:吡格列酮预处理能上调其骨髓来源内皮祖细胞数量,并通过促进其增殖和一氧化氮分泌功能,对内皮祖细胞有保护作用.
作者：陆庆明；邸春霞；王海昌；张荣庆 刊期： 2008年第29期
背景:来氟米特是一种新型的免疫抑制剂,其活性产物A771726在体外能抑制增生分裂细胞的二氢乳清酸脱氢酶和酩氨酸激酶的活性,抑制活化淋巴细胞的增殖.目的:观察骨髓间充质干细胞在体外联合来氟米特对小鼠淋巴细胞增殖的抑制效应.设计、时间及地点:随机对照,细胞学免疫调控实验,于2007-06/11在江苏大学附属医院中心实验室完成.材料:清洁级5～6周龄BALB/c雌性小鼠42只,18只分离制备骨髓间充质干细胞,传至第3代用于实验:24只用于制备脾淋巴细胞.来氟米特活性代谢产物A771726由美国欣凯公司肖飞博士惠赠.非特异性有丝分裂原ConA、脂多糖为sigma公司产品.方法:将制备的T、B淋巴细胞恳液分为骨髓间充质干细胞组、来氟米特组、骨髓间充质干细胞+来氟米特组.其中骨髓间充质干细胞浓度为2×108L-1,骨髓间充质干细胞数:淋巴细胞数=1:30,来氟米特终浓度为15 mg/L,此外各组加入5 mg/L非特异性有丝分裂原ConA或25 mg/L脂多糖.主要观察指标:MTT法检测T、B淋巴细胞增殖抑制率.通过表面标志检测T、B淋巴细胞活化情况.流式细胞仪测定T淋巴细胞凋亡程度.RT-PCR法榆测T淋巴细胞干扰素γ、白细胞介素10、白细胞介素4 mRNA表达水平.结果:与阳性对照比较,骨髓间充质干细胞组、来氟米特组、骨髓间充质干细胞+来氟米特组T淋巴细胞体外增殖抑制率均明显提高(P<0.05),且后者变化幅度大于前两组(P<0.05):各组B淋巴细胞增殖抑制情况与上述结果相似.与阳性对照比较,各组T淋巴细胞CD3+CD69+、CD3+CD28+的表达以及B淋巴细胞CD19+CD69+、CD19+CD86+的表达均基本相似:骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞+来氟米特组T淋巴细胞凋亡率明显下降(P<0.05).与阳性对照比较,骨髓间充质干细胞+来氟米特组可使T淋巴细胞干扰素γ mRNA提高、白细胞介素10 mRNA降低(P<0.05),白细胞介素4 mRNA表达无变化,且其前2项指标变化幅度明显大于骨髓间充质干细胞组、来氟米特组(P<0.05).结论:骨髓间充质干细胞与来氟米特体外联合,能抑制T淋巴细胞凋亡,可协同抑制T、B淋巴细胞增殖、白细胞介素10 mRNA表达,协同促进干扰素γ mRNA的表达,对T、B淋巴细胞活化、白细胞介素4 mRNA表达无影响.
作者：裘影影；李晶；殷玉俊；汤郁；尤海燕；朱伟；焦志军 刊期： 2008年第29期
背景:血管内皮生长因子能促进内皮细胞分裂增殖及血运重建,诱导血管生成,近年来以血管内皮生长因子为基础的基因治疗已逐步试用于临床.但质粒载体转染率低、腺病毒载体对机体的免疫原性及存在潜在感染危险等问题尚需探讨.目的:拟构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒,鉴定并测定病毒滴度及活性.设计、时间和地点:开放性实验,于2007-03/09在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:病毒包装细胞AAV-293、病毒滴度检测细胞AAV-HT1080购自Stratagene公司;Ecoli DH5.菌株由陕西省疾病预防控制中心保存:AAV helper-free system腺相关病毒包装系统中pAAV-IRES-hrGFP质粒包含绿色荧光报告基因,购自Stratagene公司;重组携带hVEGF165基因的质粒pUC18-hVEGF165由西安交通大学第二医院骨科时志斌博士构建.方法: 从含有hVEGF165基因的pUC18-hVEGF165质粒中扩增出hVEGF165片段,插入腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-hrGFP,构建重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP.将此重组质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper磷酸钙法共转染AAV-293细胞,通过同源重组产生重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP.荧光显微镜下监测病毒包装效率,裂解AAV_293细胞收获重组病毒并进行浓缩纯化.应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞,荧光计数法测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因hVEGF165扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞.主要观察指标:荧光显微镜下监测病毒包装效率.荧光计数法测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因hVEGF165扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.结果:扩增产物经DNA测序确定为hVEGF165 cDNA片段,重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP经双酶切鉴定正确.病毒包装效率达95%以上,收获纯化病毒滴度达5.5×1011vg/mL.提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因片段hVEGF165,证实重组病毒rAAV-VEGF165-GFP包装成功.结论:成功构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒rAAV-VEGF165-GFP.收获的病毒具有较高滴度和感染活性.
作者：黄向辉；时志斌；王坤正；党晓谦；杨佩；余鹏博 刊期： 2008年第29期
背景:骨髓间充质干细胞可定向诱导为软骨细胞.目的:建立二维培养条件下骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的诱导体系,分析转化生长因子β 1作为诱导条件的佳浓度,以及诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的相关影响因素,观察细胞诱导后的细胞形态及表型变化.设计:随机对照动物实验.单位:贵阳医学院动物实验中心.材料:实验于2005-09/2006-11在贵阳医学院动物实验中心完成.4周龄雄性SD大鼠24只由贵阳医学院动物中心提供,体质量(98.23±7.97)g,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.方法:取SD大鼠的股骨及胫骨,采用贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,取第4代骨髓间充质干细胞行流式细胞术检测鉴定其表面抗原,分别以含1,5,10,15,20 μ g/L 的转化生长因子β 1的诱导培养基在二维培养条件下对第4代骨髓间充质干细胞诱导培养,对照组加入阴性诱导培养基.2周后采用免疫组织化学法对Ⅱ型胶原进行定性检测,采用二甲基亚甲蓝比色法定量检测诱导后细胞外基质糖胺多糖的表达.主要观察指标:各组细胞表面抗原检测、Ⅱ型胶原定性检测及细胞外基质糖胺多糖表达检测.结果:贴壁培养法可分离并纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞,所得第4代骨髓间充质干细胞表面抗原CD44阳性,CD34、CD45阴性.经诱导培养2周后细胞形态变为不规则,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示,15,10,15,20 μg/L 转化生长因子β1组可见阳性细胞,二甲基亚甲蓝比色法检测显示各实验组细胞外基质糖胺多糖含量均明显高于对照组(P<0.01).10 μg/L 转化生长因子β 1组细胞分泌的细胞外基质糖胺多糖明显多于其它剂量组(P<0.01),并且细胞分泌细胞外基质糖胺多糖的能力与细胞密度呈正相关(r=0.822,P<0.01).结论:10 μg/L转化生长因子β 1存在的二维培养条件下,较高的细胞密度有利于骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化.
作者：彭吾训；王蕾；邓进；李鹏 刊期： 2008年第29期
背景:目前神经细胞是否具有直接诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元的作用还未见报道.目的:拟在体外建立人骨髓间充质干细胞和神经细胞的共培养体系,观察共培养条件下神经细胞对骨髓间充质干细胞分化为神经元的影响.设计、时间及地点:分组对照,体外细胞学实验,于2006-12/2007-12在山东省青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.材料:骨髓间充质干细胞来源于青岛大学医学院附属医院行自体干细胞移植治疗的糖尿病患者骨髓血,神经细胞取材于分娩过程中窒息死亡的新生儿脑组织,传至第3代用于实验.用于细胞共培养的Transwell双层培养皿为Coming Costar公司产品,培养体系孔径小于3.0 μm,细胞不会迁徙通过,但上、下层培养液可互通融合.方法:共培养组将神经细胞按1×106密度接种于Transwell双层培养皿的底层,上层接种骨髓间充质干细胞,加入LG-DMEM培养基,培养4～5 d.对照组上、下层均接种骨髓间充质干细胞.主要观察指标:观察骨髓间充质干细胞的形态变化,免疫荧光染色检测骨髓间充质干细胞中神经元特异性标志物的表达.结果:共培养组骨髓间充质干细胞生长伸展,呈放射状突起,并可相互连接,神经元特异性烯醇化酶阳性率为(32.7±11.5)%,表现神经元细胞的特性.对照组骨髓间充质干细胞形状扁而宽,未形成神经样形态结构,神经元特异性烯醇化酶呈阴性.结论:神绛细胞生长过程中提供的微环境对骨髓间充质干细胞分化为神经元具有诱导促进作用.
作者：杨乃龙；杨芬；徐丽丽 刊期： 2008年第29期
背景:核基质附着区是染色质被限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列,不仅可影响邻近内源基因的表达,还能克服转基因沉默,提高外源基因的转录与表达.目的:探讨在CHO细胞中β-干扰素核基质附着区对氯霉素乙酰转移酶转基因表达的影响.设计、时间及地点:开放性实验,于2006-10/2007-04在新乡医学院生物化学与分子生物学实验室及分子研究室完成.材料:CHO细胞株由中国典型培养物保藏中心提供.含氯霉素乙酰转移酶报告基因及G418筛选标记的质粒pCATG载体由本实验室构建.方法:将PCR扩增得到的人β-干扰素核基质附着区分别用Sac I/Kpn I及BamHI/SalI酶切,连接至用相应内切酶酶切的pCATG载体上,转化E.coliJM109,提取质粒行酶切电泳,将构建好的载体命名为pCAT-MAR,该载体含氯霉素乙酰转移酶报告基因表达盒及两侧的β-干扰素核基质附着区.分别用载体pCATG及pCAT-MAR转化CHO细胞,提取具有G418抗性的细胞株基因组DNA,PCR扩增氯霉素乙酰转移酶基因.主要观察指标:ELISA法分析氯霉素乙酰转移酶报告基因的表达.PCR法检测pCAT-MAR载体是否稳定整合在宿主基因组上.结果:①pCATG转化的CHO细胞共筛选出16个阳性细胞株,pCAT-MAR转化的CHO细胞筛选出17个阳性细胞株.β-干扰素核基质附着区可使氯霉素乙酰转移酶报告基因表达水平提高2.8倍,pCATG转化CHO细胞的变异系数为2.065 0,PCAT-MAR转化CHO细胞的变异系数仅为0.8131.②稳定转化的细胞株基因组DNA均扩增出437 bp目的片段,证明pCAT-MAR载体已经稳定整合到基因组上.结论:β-干扰素核基质附着区能提高转基因在CHO细胞的表达水平,并且可降低不同转化细胞株之间转基因表达的差异性.
作者：昝玉玺；王天云；张俊河；王俐 刊期： 2008年第29期
应用计算机检索Pubmed数据库1999-01/2008-01期间及万方数据库、维普数据库2001-01/2008-01期间与胚胎干细胞分化的调控因子相关的44篇文章显示:胚胎干细胞分化的调控是一个极其复杂的过程,是由多个因素组成的一个庞大的维持胚胎干细胞自我更新能力的调控网络,其中特异分子和各种转录因子的终表达量是决定胚胎干细胞是否分化的关键因素.当各种因子分泌量达到相互平衡状态时,胚胎干细胞维持自我更新,但是如果其中一个或几个因子的表达量发生改变时.就会促使胚胎干细胞向某一特定方向分化.目前研究主要集中在八聚体结合蛋白4、Nanog、SOX基因、白血病抑制因子等几条既平行又相互交错的通路所决定胚胎干细胞的自我更新.
作者：朱向情；陈强；丁亚楠；马丹；潘兴华 刊期： 2008年第29期
背景:动物实验已经证实,来源于骨髓或外周血干细胞能够在血管损伤部位分化形成新生血管,进而改善肢体血液供应.目的:观察自体骨髓干细胞移植治疗慢性下肢缺血的临床疗效.设计、时间及地点:自身对照加非随机对照的双盲试验,于2004-09/2007-09在山东大学附属省立医院血管外科及科研中心完成.对象:受试对象为下肢血管缺血性病变失去外科手术或介入治疗适应症,并愿意接受自体干细胞移植的患者60例,男36例,女24例,年龄33～83岁,平均65岁.方法:实验采用干细胞分离液,利用梯度密度法分离患者自体骨髓干细胞,制备干细胞悬液.根据缺血范围选取缺血肢体肌肉多点穿刺注射.主要观察指标:以治疗后6个月患者下肢疼痛症状、行走能力、皮肤溃疡、踝肱指数、足坏疽评分的变化来评价临床疗效.结果:治疗后6个月,患肢疼痛、麻木感和冷感觉改善率为78.33%,47例患者静息痛消失或明显减轻,5例患者跛行距离由不足50 m提高到大于100 m.10例伴有溃疡的患者,溃疡愈合或面积逐渐减小.11例踝肱指数增加大于0.1,4例足趾坏疽患者中1例症状明显缓解,静息痛消失,行坏疽足趾切除,愈合良好;2例疼痛消失,睡眠改善,坏疽组织有脱落迹象:1例于膝下截肢.结论:自体骨髓干细胞移植对肢体疼痛、冷感、麻木疗效确切,对创面愈合有促进作用.
作者：吕晓霞；尹至；金星；吴学君；侯向前；宋颖博；李建峰 刊期： 2008年第29期
随机对照动物实验,于2006-11/2007-02在辽宁医学院SPF级动物实验室完成.应用60Co对Balb/C nu+裸鼠进行移植前放射.照射后脐血移植组输入新鲜人脐血单个核细胞,对照组输入生理盐水.结果移植组小鼠存活率及存活时间均明显高于对照组.骨髓中人CD45+细胞2周时就已出现,随后迅速上升,4～8周维持较高水平,8周时达高,8周后明显下降,至12周时仍可检测出.脐血移植后2周,在小鼠的骨髓、外周血中出现了人类特异性Cart-1基因.并继续存在至12周.对照组未检测到人DNA.证实人脐血干细胞移植能在免疫缺陷BALB/cnu+裸鼠体内成功植入,使免疫缺陷小鼠获得造血和免疫重建.
作者：李梅君；李哲；李斌；王亮；张爽；苏玉虹；巴彩凤；闵长青；陈清华 刊期： 2008年第29期
目的:有研究表明,针刺足三里穴能够提高衰老机体的免疫系统功能,关于足三里穴适宜的针刺深度及对健康机体影响的研究较少.实验观察不同深度针刺足三里穴对健康大鼠免疫功能的影响.方法:实验于2006-09/10在北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室完成.实验选用健康清洁级雄性Wistar大鼠24只,按随机数字表法分为3组:空白组、皮下组、肌肉组,每组8只.皮F组将毫针沿15.角斜向上平刺入足三里穴皮下,肌肉组将毫针直刺入足三里穴肌肉层,留针20 min,1次/d,共14次,空白组不做针刺处理.测定针刺前后各组大鼠体质量的变化、大鼠胸腺指数、脾脏淋巴细胞增殖能力及外周血细胞计数等变化.结果:针刺作用后,肌肉组大鼠胸腺指数及淋巴细胞增殖能力均较空白组明显升高(P<0.05),皮下组和空白组大鼠胸腺指数及淋巴细胞增殖能力无统计学差异(P>0.05).肌肉组与皮下组大鼠白细胞总数、红细胞计数、血红蛋白含量及血小板总数与空白组比较,差异均不显著(P>0.05).针刺一二周后,肌肉组与皮下组大鼠体重质量均明显低于空白组(P<0.01).结论:肌肉层深层针刺足三里穴可提高健康大鼠胸腺指数及淋巴细胞增殖能力,增强大鼠机体免疫能力,同时对于机体外周血细胞无明显影响.
作者：田阳春；郑玲；袁英；石玥 刊期： 2008年第29期
实验将DAPI染色方法运用到小鼠微核检测中.选取20只小鼠随机分为实验组和对照组,每组10只.2组均往小鼠腹腔注射环磷酰胺60 mg/kg,1次/d,连续注射3 d.实验组采用DAPI染色;对照组采用10%的Giemsa染色.结果显示,实验小鼠骨髓组织细胞微核DAPI染色特异性强,易判断,对照组Giemsa染色结果特异性差,且不能排除染色过程中Giemsa染液中的染色颗粒沉淀的干扰,这样就使Giemsa染色后,对微核的判断造成困难.本实验建立了小鼠骨髓组织细胞微核DAPI染色方法,检测效果好,特异性强.
作者：张艳芬；许重洁；杨保胜；刘小学 刊期： 2008年第29期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
