郭继强；杨萍；宋向风
背景:自体富血小板血浆含有多种生长因子,可以克服外源性生长因子成分单一、来源有限、价格昂贵且存在一定的免疫排斥反应等不足.目的:观察富血小板血浆对体外培养骨髓间充质干细胞增殖的影响.设计、时间及地点:区组设计,开放实验,于2004-0912005-02在同济医学院医学实验公共实验室完成.材料:2月龄新西兰大耳白兔.方法:采用密度梯度离心结合贴壁筛选及传代方法提取、纯化骨髓间充质干细胞,取较纯和生长状态较好的第3代细胞.采用二次离心法提取兔富血小板血浆.在完全培养基加入体积分数为0.2,0.1.0.05富血小板血浆培养骨髓间充质干细胞,以未加入富血小板血浆的完全培养基为对照.主要观察指标:①骨髓间充质干细胞生长曲线.②以MTT比色法观察骨髓间充质干细胞的存活和增殖能力.结果:①加入富血小板血浆干预第2天,骨髓间充质干细胞出现较高的增殖活性,呈快速生长,曲线上升幅度大,细胞倍增时间短,约30 h.以体积分数为0.2富血小板血浆组明显.对照组细胞从第3天起呈快速生长,细胞倍增时间长,约46 h.②富血小板血浆体外培养骨髓间充质干细胞时间越长作用越明显,在培养第3天细胞牛长的剂量依赖不明显,培养第6天后较高剂量的富血小板血浆对细胞的增殖作用显著增强,与对照组比较差异有显著性意义(P＜0.05,P＜0.01).结论:富血小板血浆能明显促进体外培养骨髓间充质干细胞增殖,并使细胞产生剂量依赖性.
作者：张卫兵；洪光祥；康皓 刊期： 2008年第34期
背景:关于骨髓单个核细胞促使梗死心肌再生存在很大争议,早期研究均认为非常有效,甚至可以分化为心肌细胞,但近的文献却基本否认了这种说法,认为单个核细胞仅可以有限的促进血管生成.目的:比较体外培养的脂肪干细胞和骨髓单个核细胞自体移植后对促进心肌细胞再生、血管新生及心肌梗死后心功能改善之间的差别.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2004-01/2005-09在解放军总医院心内科实验室与沈阳军区总医院实验室完成.材料:清洁级4月龄雄性新西兰白兔55只,10只用于骨髓单个核细胞标记追踪,剩余兔随机分为脂肪干细胞组、骨髓单个核细胞组、空白对照组,15只,组.方法:各组兔均结扎冠状动脉前降支制作心肌梗死模型,造模同时取少量腹部脂肪组织分离培养脂肪干细胞,抽取髂骨骨髓分离培养骨髓单个核细胞,用于自体移植.3周后再次开胸,脂肪十细胞组、骨髓单个核细胞组分别于梗死心肌直接注射自体脂肪十细胞和骨髓单个核细胞,空白对照组注射磷酸盐缓冲液.继续培养5周.将专用于骨髓单个核细胞标记追踪的10只兔行DAPI和BrdLJ标记,脂肪干细胞组的移植细胞行BrdU标记.主要观察指标:移植细胞标记情况,移植后心功能变化.苏木精-伊红染色和免疫组织化学检测结果.结果:脂肪十细胞组心肌梗死区可见大量移植细胞存在,可分化为心肌细胞、内皮细胞、参与新血管形成:骨髓单个核细胞组DAPI及BrdU标记后均末于梗死心肌组织发现单个核细胞存在.细胞移植前3组动物心功能基本相似:细胞移植后5周与空白对照组比较,脂肪干细胞组超心动图及左心室压力曲线榆测均显示心功能显著改善(P＜0.05),骨髓单个核细胞组仅等容收缩期左心室压力大上升速率明显改善(p＜0.05).脂肪T细胞组、骨髓单个核细胞组的血管密度均大于空白对照组(p＜0.01,P＜0.05),但前者于心肌梗死中心和边缘均可见大量血管,而后者仅在梗死区边缘血管密度增高.结论:脂肪干细胞移植可以促进心肌再生和新血管形成,进而改善心功能;而骨髓单个核细胞移植仪能促进血管新生,对心功能改善效果有限.
作者：张端珍；盖鲁粤；刘宏伟；朱鲜阳 刊期： 2008年第34期
背景:近年来通过筛选不同细胞因子的诱导分化作用发现,某些特定的细胞因子配伍可明显诱导中脑神经干细胞体外定向分化成多巴胺能神经元,研究还发现神经干细胞体外诱导分化的多巴胺能神经元可以有效应用于移植治疗帕金森病,为提高其体内移植的疗效,目前迫切需要深入研究神经干细胞诱导分化的生物学特性.目的:探讨大鼠神经干细胞在分化液中诱导不同时间后,其体外分化成多巴胺能神经元的效应.设计:单一样本观察.单位:中山大学附属第一医院神经外科.材料:实验于2007-05/10在中山大学附属第一医院完成,选择清洁级孕14 d的健康SD大鼠6只,体质量350-400 g,由中山大学动物实验中心提供(许可证号码SCXK(粤)2007-0034).实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.方法:①在含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中培养胚胎大鼠中脑神经干细胞.②经传代扩增后,在含白细胞介素1α、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中向多巴胺能神经元分化.③诱导分化2,4,6,8,10 d后,流式细胞仪检测分化细胞中酪氨酸羟化酶阳性细胞的比值.主要观察指标:①大鼠神经干细胞诱导分化后细胞形态的变化.②诱导不同时间的大鼠神经干细胞分化成酪氨酸羟化酶阳性细胞的比值.结果:在诱导分化液中大鼠中脑神经干细胞球呈贴壁生长,球形结构开始塌陷,球内细胞从球体中央逐渐向四周分化扩展出较多形态各异的细胞,分化6 d后,多数细胞已生长出一两个长突起及多个短突起.免疫细胞化学显示分化的细胞中含有酪氨酸羟化酶染色阳性细胞,流式细胞仪检测诱导分化2,4,6,8,10 d的分化细胞中酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比例分别为(3.2±0,9)%,(6.8±1.6)%,(16.7±2.6)%.(14.8±1.8)%,(12.2±2.5)%,各组间差异有显著性意义(F=26.449.P＜0.05).结论:诱导时间对大鼠中脑神经干细胞体外分化成多巴胺能神经元的能力存在影响,诱导6 d的神经干细胞分化成多巴胺能神经元的比例高.
作者：柯春龙；陈白莉；金华伟；郭少雷 刊期： 2008年第34期
背景:目前研究主要是利用大鼠等动物模型来探讨如伺生成脂肪细胞,对于体外分离培养的人骨髓间充质干细胞向脂肪细胞表型转化的实验报道不多.目的:拟在体外建立人骨髓充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的实验方法.设计、时间及地点:细胞形态学体外观察,于2006-12/2007-11在山东省青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.材料:骨髓来源于青岛大学医学院附属医院行自体干细胞移植治疗糖尿病患者的骨髓血,IBMX,地塞米松,吲哚美辛,胰岛素等诱导剂为Sigma公司产品.方法:无菌条件下抽取骨髓血,联合应用密度梯度离心法及贴肇筛选法,以单克隆形式分离培养入骨髓间充质干细胞,当细胞汇合至90%时胰蛋白酶消化传代.取第3代骨髓间充质干细胞,加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素、1 μmol/L地寒米松、10mg/L胰岛索、O.5mmol/L IBMX、50 μmolL吲哚美辛的低糖DMEM培养基,作为体外特定微环境向脂肪细胞方向诱导分化,以单纯加入低糖DMEM培养基的细胞作为对照组.诱导3周后行油红O染色.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的形态变化及细胞表面标志鉴定,脂滴形成及脂肪细胞分化率.结果:接种后第2～3天骨髓间充质干细胞开始贴壁,两端有较长突起,呈克隆样生长,形成大小不一的集落;传代后骨髓间充质干细胞呈长梭形,漩涡样牛长;第3代细胞CD44呈阳性,不表达CD34:由克隆扩增出的骨髓间充质干细胞具有高度的同源性.诱导第3周油红O染色示胞核呈蓝色,脂滴呈橙红色,脂肪细胞分化率为(86.0+5.6)%,对照组未见脂滴形成.结论:含有地寒米松、IBMX及胰岛素等诱导剂的体外特定微环境对骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞具有诱导促进作用.
作者：贾秀娟；孙晓娟；徐丽丽 刊期： 2008年第34期
背景:国内外文献表明,催乳素可通过调节细胞内凋亡相关蛋白的表达促进免疫细胞增殖并抑制细胞凋亡.目的:拟验证催乳素是否能通过调节T细胞Bax和Bcl-2的表达来影响Jurkat细胞凋亡.设计、时间及地点:以细胞为对象的对比观察实验.于2006-07,2007-05在新乡医学院免疫学实验室完成.材料:人白血病T细胞株Jukat细胞为上海生工产品,人催乳素为sigma公司产品.方法:以10 Gy γ-射线照射Jurkat细胞建立细胞凋亡模型.在射线照射前30 min内,于模犁中分别加入20 μ g/L,300 μ g,L和1 000 μg/L的人催乳素进行干预,同时设不含人催乳素的对照组,以及不进行辐射处理且不加催乳素的正常组.于辐射后的0,24,48 h收集细胞.主要观察指标:以四甲基偶氮唑盐法检测Jurkat细胞的增殖情况;以流式技术检测细胞凋亡情况:以琼脂糖凝胶电泳检测Jurkat细胞凋亡DNA:以Western Blot法检测Jurkat细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达水平.结果: ①在γ-射线处理后24和48 h,与对照组比较,300 μg,L和1 000 μ g/L催乳素组和正常组的细胞数量明显增多(P＜0.01).②在细胞经γ-射线处理后48 h,与对照组比较,300 μ g/L和l 000 μ g/L催乳素组和正常组细胞凋亡率显著降低(P＜0.05).③在γ-射线处理后的24和48 h,与对照组比较,各质量浓度催乳素组Bci-2/β-actin灰度比值均明显升高(P＜0.01):300 μg/L和1 000 p g/L催乳素组Bax/β-actin灰度比值明显降低(P＜0.01).结论:在γ-射线诱导的Jurkat细胞凋亡过程中,催乳素可通过提高Bcl-2的表达并下凋Bax的表达,来抑制Jurkat细胞凋亡.
作者：郭继强；杨萍；宋向风 刊期： 2008年第34期
脑缺血性疾病致死、致残率高,可供选择的治疗方法少,效果欠佳.神经细胞替代治疗能够重建神经传导环路,恢复部分神经功能,机制可能在于:移植到宿主体内的十细胞能够分化成为功能性的神经胶质细胞、神经元,替代已死亡的神经元的部分功能:激活内源件神经干细胞;分泌细胞因子,改善缺血坏死区的局部微环境如炎症、组织坏死及神经胶质瘢痕等.动物实验研究中治疗脑缺血的干细胞来源主要有人胚胎干细胞、人脐带血细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质细胞等.目前细胞替代疗法尚处于研究的初级阶段,具体的机制仍不十分明确.关键问题在于两方面:移植细胞在缺血的环境下如何存活?移植细胞如何替代、挽救已损失的各种类型的神经细胞?
作者：陈宝智；刘朝晖；赵建农 刊期： 2008年第34期
背景:钙离子参与神经信号的传递和神经递质的释放,脑海马神经干细胞的增殖过程必然和钙离子关系紧密,同时这一过程也反应在膜电位的变化上.目的:探讨中药三七总皂苷对脑损伤新牛鼠海马神经干细胞Ca2+和膜电位的影响.设计、时间及地点:离子水平,体外细胞学电生理观察,于2007-03/05在北京中医药大学细胞培养室完成.材料:清洁级新牛24 h内Wistar鼠16只.三七总皂苷为内蒙古康源药业有限公司产品,批号ZZ-5802-内卫药准字(1999)1787号,规格350g/10L.钙离子荧光探针Fluo3-AM、亲脂性阴离子荧光探针DiBAC4(3)为Sigma产品.方法:取新生鼠脑海马组织,采用无血清培养法分离扩增神经干细胞.设立3组:正常组细胞加入含糖Earle氏液,并始终在正常气体条件下培养:模型组、用药组细胞采用糖氧剥离法体外模拟脑缺血再灌注损伤,即加入无糖Earle氏液,将培养板放入缺氧罐内模拟脑缺血状态.用药组在换液时及脑缺血4h后分别加入17.5 mg/L三七总皂苷1.75 μ g.细胞内钙离子和膜电位分别用Fluo3-AM、DiBAC4(3)荧光探针进行标记.主要观察指标:神经干细胞Ca2+、膜电位荧光值的变化.结果:缺血冉灌注后30 min～1 h,正常组神经干细胞内Ca2+浓度呈上升趋势,至再灌注2 h胞内Ca2+浓度达到高峰,再灌注3 h胞内Ca2+浓度开始降低:膜电位变化与Ca2+浓度变化完全相反.与正常组比较,模型组再灌注后30 min,1 h,2 h,3 h神经干细胞内Ca2+浓度均明显升高(P＜0.05～0.001),膜电位均明显下降(P＜0.001);经三七总皂苷处理町抑制Ca2+浓度升高(P＜0.05～0.01),并抑制膜电位下降(P＜0.05～0.001).结论:防止细胞内钙超载和细胞膜电位降低可能是三七总电苷保护损伤脑海马神经干细胞的作用机制之一.
作者：张建平；付银根；刘大全；司银楚 刊期： 2008年第34期
背景:作者前期工作已经证实,在人体的多种组织中均存在有-类分化潜能可与胚眙干细胞媲美的原始干细胞群体,其表型为CD105+.目的:验证人的动脉是否也存在原位干细胞,并观察其分化潜能.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2004-01/2007-01在河南省人民医院和中国医学科学院组织工程中心完成.材料:实验血管来源于流产胎儿,实验方案经河南省人民医院伦理委员会批准.方法:用MACS磁珠分选CD105+细胞,应用极限稀释法获得单细胞克隆,观察其表型,在特定的诱导培养基中培养,用免疫荧光法和免疫印迹等方法检测其分化.主要观察指标:①干细胞表面抗原鉴定.②血管内皮、平滑肌细胞和脂肪细胞特异性抗原表达.结果:细胞的表型是CD105+Flk1+CD31-α SMA-,可以向血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和脂肪细胞分化.结论:人的动脉中存在着可以向血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和脂肪细胞分化的干细胞.
作者：刘煜昊；高传玉；房佰俊；戴国友；史明霞；赵春华 刊期： 2008年第34期
背景:研究证明细胞的密度、细胞之间的相互作用、培养的体系、细胞因子等对骨髓基质干细胞的分化产生影响.目的:实验拟验证微球培养的人骨髓基质干细胞在特定诱导条件下向软骨细胞的分化情况.设计、时间及地点:以细胞为对象的观察实验,于2006-02/2007-10在青岛市城阳人民医院干细胞实验室完成.材料:骨髓标本取自股骨颈骨折或者髋关节炎症实施髋关节置换手术患者.方法:抽取入骨髓组织,采用密度梯度法分离培养骨髓基质干细胞.当培养的骨髓基质干细胞达到7×≧106个细胞时,将每500 000个细胞离心制成高密度细胞微球,在含有DMEM高糖、胰岛索、转铁蛋白、选择素、丙酮酸、脯氨酸、BSA、地塞米松、抗坏血酸的促软骨细胞分化培养液培养6周.主要观察指标:分析细胞外基质中蛋白聚糖含,并通过组织化学和免疫组织化学方法,以阿尔新蓝染色细胞外基质中的蛋白聚糖, 以胶原蛋白Ⅱ染色显现细胞外基质中的胶原蛋白Ⅱ,对成软骨方向分化的质量进行评价.结果:在微球培养的第3周就可以检测到细胞外基质中的蛋白聚糖,并且随着时间的增长其单位细胞的蛋白聚糖分泌量不断增加.通过阿尔新蓝和胶原蛋白Ⅱ染色,镜下观察在培养的第4周,细胞微球就可以形成细胞外特异性的软骨基质、蛋白多糖和Ⅱ型胶原:6周时,细胞外基质中蛋白聚糖和胶原蛋白Ⅱ形成更加明显.结论:在无血清软骨细胞分化培养液中,采用高密度微球培养方法可定向诱导骨髓基质干细胞分化为软骨细胞.
作者：崔中平；王小艳；于崇岗；王英振 刊期： 2008年第34期
目前,国内外尚无单倍型相合未去T细胞移植成熟的方案,对于难治和高危白血病患者,化疗预后是很差的,应不失时机进行异基因造血干细胞移植,如果能够跨越人类主要组织相容性抗原的限制,用人类主要组织相容性抗原半相合的亲属作为造血干细胞移植的供体,就可以彻底解决干细胞来源问题.采用诱导免疫耐受新方法可提高预防移植物抗宿主病疗效.国外通过使用抗胸腺细胞球蛋白、氟达拉滨、甲强龙和伞身照射使人类土要组织相容性抗原单倍型骨髓移植排斥率由40%降到0-5%,国内基本采用体外不去T和诱导免疫耐受的移植方式,结果优于国外报告,显著的疗效与国内未进行T细胞清除相关.
作者：陈惠仁 刊期： 2008年第34期
背景:造血干细胞是构筑免疫系统的早的细胞,能分化为多种细胞,其中具有包括免疫应答调控树突状细胞.树突状细胞的诱导培养因前体细胞来源不同,所采用的细胞因子,及佳的细胞因子配伍、应用顺序、实验室培养条件亦不相同,树突状细胞的发育、各种表犁的表达及成熟度也不尽相同.目的:观察肿瘤坏死因子α和白细胞介素4对脐血CD34+造血干细胞来源的树突状细胞诱导培养体系的影响,探寻该培养体系优化方法.设计、时间及地点:观察性实验,于2005-03/11在南京医科大学微生物与免疫学实验室完成.材料:健康新生儿脐血为南京市八一医院产妇同意捐赠.CD34单克隆抗体一磁珠分离系统为德国Miltenyi Biotec公司产品:重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、重组人白细胞介素4和重组人肿瘤坏死因子α为美国PeproTech公司产品.方法:淋巴细胞分离液分离获得脐血单个核细胞,免疫磁珠阳性分选CD34+造血干细胞,并用流式细胞术鉴定CD34+造血干细胞纯度:比较GT(GM-CSF+肿瘤坏死因子α)方案和GTI(GM-CSF+肿瘤坏死因子α+自细胞介素4)方案及GTI方案中肿瘤坏死因子α和白细胞介素4不同时段加入对诱导培养产生的树突状细胞成熟的影响;通过激光共聚焦显微镜观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞表型及3H-TdR检测树突状细胞激发异体T细胞增殖能力.结果:免疫磁珠阳性分选CD34+造血干细胞纯度町达90%以上.将CD34+造血干细胞按GT方案和GTI方案进行培养.均可诱导产生树突状细胞,CD34的阳性表达率逐渐下降,HLA-DR的表达下降(P＜0.05),树突状细胞的相关分化抗原CD80,CD86,CD83和CDla的表达均相应增加,培养13～15 d的细胞各表型表达较7～9 d,10～12 d充分.但经GT方案诱导的树突状细胞CD14表达较高,cD80,CDB6,CD83,CD1a表达不如经GTI方案诱导的高;而GTI方案中,以肿瘤坏死因子aoh、白细胞介素448 h加入诱导培养的树突状细胞各表型表达相对较佳,其细胞表达CD80,CD86均较其他组高,尤以CD86表达为著,并具有激发异体T细胞增殖能力.结论:CD34+造血干细胞经过合适的培养体系能够诱导分化为功能性树突状细胞,以GM-CSF与肿瘤坏死因子α O h加入、白细胞介素4 48 h加入的GM-CSF+肿瘤坏死因子α+白细胞介素4方案更为可取.
作者：顾镭；邢美芬；季晓辉；孙志达；杨晓帆；王慧娟；李明顺 刊期： 2008年第34期
背景:骨髓间充质干细胞在特定条件下可表达神经元表面标志物,提示其具有分化为神经细胞的潜能.目的:观察骨髓间充质十细胞移植后在脑梗死大鼠脑组织内的存活和分化情况,拟进一步验证骨髓间充质干细胞用于治疗脑梗死的可行性.设计、时间及地点:细胞学体内观察,于2004-12/2007-10在解放军第四军医大学基础部实验室完成.材料:清洁级健康16周龄雄性SD大鼠6只,1只用于制备骨髓间充质干细胞,5只建屯大脑中动脉栓塞模型.方法:取第2代人鼠骨髓间充质干细胞,移植前48 h行BrdU标记.脑梗死大鼠经尾静脉注射1mL细胞悬液,约含有3×106个骨髓间充质干细胞.主要观察指标:骨髓间充质干细胞移植后在脑内的存活情况及脑组织神经元特异性烯醇化晦的表达.结果:细胞移植后28 d,荧光显微镜下可见脑梗死灶(海马)边缘聚集大量BrdUJ阳性细胞,而健侧脑组织中BrdU阳性细胞数量相对较少.脑梗死灶边缘可见少草BrdU阳性细胞表达神经元特异性烯醇化酶.结论:骨髓间充质十细胞纤静脉移植入大脑中动脉栓塞大鼠体内后,可存活、移行至脑梗死灶周围,并分化为神经元样细胞.
作者：郭亮；麦晓燕；申晶；徐宁；杨静；李源 刊期： 2008年第34期
背景:鼠胚成纤维细胞经丝裂霉素C处理或Y射线照射阻断其有丝分裂后,铺层的细胞可保持活力但不增殖,并能够在生长过程中产生促进胚胎十细胞生长的因子和抑制胚胎干细胞分化的因子,但其生命期有限.目的:探讨分离小鼠胚胎成纤维细胞的适胚龄与培养条件,以及用其制备细胞饲养层的效果.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-11/2006-07在广东省计划生育专科医院实验室完成.材料:清洁级昆明系孕7.5,10.5,13.5,16.5,19.5 d雌鼠各5只.方法:无菌取上述各孕龄小鼠胚胎分离鼠胚成纤维细胞,调整细胞浓度为1×107L-1、1×109L-1 1×1011 L-1,胰酶消化传代.当胚胎成纤维细胞生长并相互接触时,加入丝裂霉素C作用2-4 h,用无钙无镁PBS配制的胰蛋白酶液消化2～5 min,终止后用吸管吹打皿底,使细胞充分分离,以含10%胎牛血清的DMEM液调整细胞浓度为5×108 L-1,将该悬液移入明胶处理的培养皿内常规培养,制备鼠胚成纤维细胞饲养层.主要观察指标:胎龄、细胞浓度、传代次数对鼠胚成纤维细胞生长增殖的影响.不同胎龄鼠胚成纤维细胞饲养层制备效果.结果:7.5～19.5 d鼠胚均可分离出成纤维细胞,但7.5 d.10.5 d鼠胚分离所得成纤维细胞数少,寿命短,且混有大量杂细胞:13.5d鼠胚分离所得成纤维细胞数量多,增殖快,所含杂细胞少:16.5～19.5 d鼠胚分离所得成纤维细胞生长状态不良,增殖缓慢,杂细胞较多.同等条件下与1x107 L-1、1×1011 L-1浓度比较,1×109 L-1浓度的鼠胚成纤维细胞生长状况良好,铺层时间适中,细胞寿命长(P＜0.05).以13.5 d鼠胚成纤维细胞经初代培养后传4代,成功建立了成纤维细胞株,相同条件下1～代细胞形态,体积、生长状况无明显差别.7.5～19.5 d鼠胚成纤维细胞制备的饲养层,铺层时间基本相似(P＜0.05),细胞寿命均可维持一二周.结论:分离小鼠胚胎原代成纤维细胞的适胎龄及细胞浓度分别为13.5d与1×109 L-1,4代以内传代次数不影响鼠胚成纤维细胞的生长增殖,且不同胎龄所制备的饲养层细胞寿命无差别.
作者：周结学；刘东；郑克立；邓春华；文任乾；唐立新；马春杰 刊期： 2008年第34期
背景:嗅鞘细胞和骨髓间充质干细胞均可修复脊髓损伤,两者联合能否发挥出更佳的修复效果还不太清楚.目的:观察嗅鞘细胞和骨髓间充质干细胞联合移植修复脊髓损伤的效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-06/2007-10在临沂市人民医院和昆明医学院完成.材料:健康清洁级成年SD大鼠,雌性,体质量220～280 g,分为:正常对照组(n=5)、嗅鞘细胞移植组(n=10)、骨髓间充质干细胞移植组(n=10)、联合细胞移植组(n=10)、手术对照组(n=10).方法:分离大鼠嗅球组织和股骨,分离培养嗅鞘细胞和骨髓间充质干细胞.暴露大鼠脊髓予以尖刀离断制备完伞脊髓损伤动物模型,正常对照组仅打开椎板未行脊髓离断,嗅鞘细胞移植组、骨髓间充质干细胞移植组、联合移植组分别在断端及远近端注射嗅鞘细胞、骨髓间充质干细胞及嗅鞘细胞+骨髓间充质干细胞悬液,采取3点注射,3点的注射深度分别为0.5 mm、1.0 mm和1.5mm.手术埘照组在脊髓离断后仅注射培养基.主要观察指标:将嗅鞘细胞和骨髓间充质干细胞制成细胞悬液后接种培养,并应用P75抗体和BrdU抗体对联合培养的细胞进行免疫荧光鉴定.移植后评定大鼠脊髓功能恢复情况,并观察病理学改变和细胞存活情况.结果:联合培养的细胞部分相互编织成网,部分呈条索状,荧光鉴定双标阳性者为嗅鞘细胞,只发红色荧光而不发绿色荧光者为骨髓间充质干细胞.移植嗅鞘细胞和骨髓间充质干细胞的大鼠脊髓功能均有改善,移植4周后,联合移植组脊髓功能恢复优于细胞移植组.病理学观察显示,手术对照组脊髓结构破坏严重,损伤处可见大量空洞及神经元胞体萎缩,周围存在较多的空洞及组织液化,细胞数目较少,神经纤维排列紊乱;移植鞘细胞及骨髓间充质干细胞后脊髓结构仍破坏严重,但是空洞面积较少,有较多细胞存在,神经纤维排列较为整齐,荧光显微镜下见脊髓损伤处有较多的细胞核发出红色荧光,在脊髓损伤处的远近端也见有较多阳性细胞存在,联合移植组可见两种细胞同时存在,但细胞分布乱,无明显的捧列方向,未见明显的迁徙现象.结论:嗅鞘细胞与骨髓间充质干细胞在体外可以很好的联合培养,修复脊髓损伤,并且联合移植的恢复效果较单一细胞移植更为理想.
作者：吴立生；吴仕峰 刊期： 2008年第34期
背景:突触索P38广泛存在于机体所有神经终末,与神经生长、修复、再生和突触重塑密切相关.目的:实验假设细胞移植及电刺激治疗对突触素P38具有调节作用,拟验证这种作用对局灶性脑缺血大鼠突触素P38表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验及细胞观察.于2005-08/2007-02在佳木斯大学神经科学研究所完成.材料:清洁级8周龄Wistar大鼠96只,随机分为神经干细胞组、电刺激+神经干细胞组、共移植体组、电刺激+共移植体组,24只/组.另取新生24 h内Wistar鼠和1～7 d龄Wistar鼠各2只,分别用于神经干细胞、脑微血管内皮细胞的分离培养.方法:将传代的脑微血管内皮细胞按3×107 L-1密度接种在培养瓶中,贴壁后吸出脑微血管内皮细胞培养液,涂一层层粘连蛋白后接种于神经干细胞上,密度为6×108 L-1,待神经干细胞贴壁后吸出培养液,再涂以一层层粘连蛋白,接种3×107 L-1密度的脑微血管内皮细胞,共培养12～24 h,将细胞从瓶壁上依次刮起,适力吹打成1～3个脑微血管内皮细胞与5～18个神经干细胞相互包绕的细胞团,过滤后筛网上的细胞团即为神经干细胞-脑微血管内皮细胞的共移植体.各组大鼠均采用线栓法建立大脑中动脉缺血模型,其中电刺激+神经干细胞组、电刺激+共移植体组大鼠于造模前1d行小脑顶核刺激,电流强度50 μ A,频率100 Hz.时程0.5 ms,连续刺激1h.造模后3 d将培养的神经干细胞、共移植体溶解于磷酸盐缓冲液中,调整浓度为2X 1010 L-1,各组均于右侧纹状体缺血半暗带区移植对应悬液10μL.主要观察指标:移植后3,7,14,60d 免疫组织化学法检测缺血区突触紊 P38 的表达.结果:光学显微镜下突触素 P38 阳性细胞染色呈棕黄色点状或颗粒状沉积,分布较密集,主要分布在神经毡内,部分围绕在神经元胞体周围.移植后各时间点电刺激+神经干细胞组、共移植体组、电刺激+共移植体组脑缺血区突触素 P38 的表达均明显高于神经干细胞组(P<0．05);且电刺激+共移植体组升高幅度显著大于前 2 组 (JP<0．05)，并随移植时间的延长突触素 P38 表达逐渐增加(P<0．05).结论:电刺激小脑项核与共移植体整体干预有助于脑缺血区突触素 P38 的表达,作用优于单纯神经十细胞、单纯共移植体或电刺激+神经干细胞等移植方式.
作者：吴盛华；李福军；金玉玲；朱晓峰 刊期： 2008年第34期
背景:骨骼肌卫星细胞心肌移植过程中,一些重要环节仍无法很好的解决,其中就包括骨骼肌卫星细胞移植后的死亡问题.促红细胞生成素从牛产到临床使用技术都很成熟,具有抗凋亡和减轻炎症反应的作用.目的:探讨促红细胞生成素对鼠骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响,从而为二者联合进行心肌移植的设想提供一些支持依据.设计、时间及地点:细胞生物学行为体外实验,于20O6-07/2007-10在暨南大学医学院中心实验室和深圳市人民医院中心实验室完成.材料:清洁级1～3 d龄SD乳鼠6只,促红细胞生成素为沈阳三生制药公司产品.方法:改良酶消化法分离培养鼠骨骼肌卫星细胞,传至第3代分别加入含0,10,20,40ulmL,促红细胞生成素的DMEM培养基.主要观察指标:倒置显微镜下观察骨骼肌卫星细胞分化能力,MTT法检测细胞活力,流式细胞仪分析细胞周期.结果:未加入促红细胞生成素组培养5 d,局部相邻的骨骼肌卫星细胞可以互相融合成长条状的肌管,随时间延长肌管数量逐渐增多,且能看见肌管跳动;10,20,40 u/mL促红细胞牛成素组均未见肌管形成,骨骼肌卫星细胞大量堆积在一起.与末加入促红细胞生成素组比较,作用48 h,72 h时各浓度促红细胞生成素组骨骼肌卫星细胞活力均明显升高(P＜0.05).随促红细胞生成素浓度的升高,G1期细胞所占百分率逐渐降低,而S+G2/M期细胞所占百分率逐渐升高.结论:促红细胞生成素呈剂量依赖性提高骨骼肌卫星细胞活力、促进骨骼肌卫星细胞增殖,并抑制其向肌管分化.
作者：陈科奇；董少红；罗林杰；张鹏；梁新剑；庞新利；李江华 刊期： 2008年第34期
背景:研究表明,骨髓间充质干细胞经骨形态发生蛋白诱导可分化为成骨细胞.目的:应用骨髓间充质干细胞、牛骨形态发生蛋白与纤维蛋白胶混合物作为骨移植材料,通过与单纯使用纤维蛋白胶、牛骨形态发生蛋白和骨髓间充质干细胞比较来评价这种移植材料的成骨效果.设计:对比观察实验.单位:广东省第二人民医院,中山大学附属第二医院.材料:实验于2004-01/2006-06在中山大学附属第二医院完成.健康新西兰大白兔由中山大学医学院动物实验中心提供.方法:白兔髂骨抽取骨髓,采用密度梯度离心法在体外培养扩增自体骨髓间充质干细胞.在纤维蛋白胶内加入骨形态发生蛋白制成复合物,再加入骨髓间充质干细胞制成另一种复合物.对12只新西兰大白兔经腹膜外行腰椎间盘切除脊柱融合术.每只动物取L3-6个椎间隙随机接受4种移植方法中的3种:骨髓间充质干细胞+骨形态发牛蛋白+纤维蛋白胶、骨髓间充质干细胞+纤维蛋白胶、骨形态发牛蛋白+纤维蛋白胶、纤维蛋白胶.术后3月利用放射学和组织学方法观察分析脊柱融合情况.主要观察指标:兔脊柱椎间隙骨痂形成情况.结果:①术后12周时,骨髓间充质干细胞+骨形态发生蛋白+纤维蛋白胶组椎间隙骨痂形成明显较其它组多,组织学上有连续的骨痂形成.骨髓间充质干细胞+纤维蛋白胶、骨形态发生蛋白+纤维蛋白胶组可见前纵韧带后方有编织骨形成,骨少,不连续.纤维蛋白胶组见纤维组织增生及少量成骨细胞,未见新骨形成.各组均未见纤维蛋白胶残留,椎间盘中有少量椎间盘髓核残余、中间有少量软骨组织形成.②12周时X射线检查显示,各组兔均未造成椎体后缘增生,无椎管狭窄.骨髓间充质干细胞+纤维蛋白胶组节段活动度与骨形态发生蛋白+纤维蛋白胶组、纤维蛋白胶组差异显著(P＜0.05);各组间椎体后缘高度丢失差异不显著.结论:自体骨髓间充质干细胞、纤维蛋白胶和骨形态发性蛋白复合体可在椎间关节形成骨性骨痂,融合效果好,组织学方面评价也较其他方法好.
作者：陈为坚；李贵涛；罗狄鑫；陈锡然；陈造宏；武光勤；叶伟；李晶 刊期： 2008年第34期
背景:间充质干细胞可支持造血,抑制或延缓异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的发生,延长异体移植器官的存活时间,具有免疫调节功能,然而其具体的免疫调节机制仍不清楚.目的:探讨SD大鼠骨髓间充质十细胞对脂多糖刺激活化后的BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞分泌因子的影响.设计、时间及地点:细胞对照观察,体外实验,于2006-12/2007-10在解放军兰州军区总医院血液病研究所完成.材料:清洁级20～22周龄雌性SD大鼠1只用于制备骨髓间充质干细胞,18～20周龄雄性BALB/c小鼠4只用于制备腹腔巨噬细胞,脂多糖为Sigma公司产品.方法:大鼠骨髓间充质十细胞以1×105/孔种植于24孔板,贴壁后作为支持层,再以相同密度加入用巯基乙酸钠腹腔注射刺激法收集的小鼠腹腔巨噬细胞,用终浓度1mg/L的脂多糖刺激活化18 h,收集培养上清待测,此为小鼠腹腔巨噬细胞+脂多糖+大鼠骨髓间充质干细胞组的干预措施.同时设立小鼠腹腔巨噬细胞组、小鼠腹腔巨噬细胞+脂多糖组作为对照.主要观察指标:培养上清中肿瘤坏死冈子α、转化生长因了β、一氧化鲺的含量.结果:与单纯巨噬细胞比较,加入脂多精刺激后培养卜清中肿瘤坏死因子α及一氧化氮含量明显升高(F=10.368,P＜0.05);而当骨髓间充质干细胞存在时,培养上清中肿瘤坏死因子α和一氧化氮含量均明显减少(F=0.017,P＜0.05).各组培养上清中转化生长因子β含鼍基本相似(P＞0.05).结论:实验首次发现SD大鼠骨髓间充质干细胞可抑制脂多糖刺激后BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞的活化.
作者：杨义武；白海；王存邦；林海；武令启 刊期： 2008年第34期
背景:BMI-1的表达对于维持干细胞特别是造血干细胞、神经干细胞、肿瘤干细胞的自我更新能力是不可缺少的.目的:以细菌内同源重组法构建携带BMI-1干扰基因的重组腺病毒载体,制备重组腺病毒pShuttle-H1-AdEasy-1-P1P2/P3P4.设计、时间及地点:开放性实验,于2006-02/2007-08在江苏大学医学技术研究所完成.材料:限制性内切酶由NewEngland BioLabs提供,腺病毒骨架质粒pAdEasy-1,大肠杆菌BJ5183、Ad293细胞由南京师范大学生科院分子医学生物技术江苏省重点实验室惠赠.方法:采用细菌内同源重组法构建RNA干扰腺病毒载体pShuttle-H1,Pme Ⅰ线性化质粒,通过同源重组腺病毒骨架蛋白pAdeasy-1,得到重组的腺病毒干扰质粒:经Pac Ⅰ线性化后片j脂质体转染方法转染293A细胞,收获腺病毒重组病毒子,以未转入小干扰RNA片段的重组质粒为对照,包装后收集细胞,反复裂解细胞获得腺病毒.主要观察指标:腺病毒质粒重组构建及鉴定情况.结果:经酶切鉴定,已成功构建siRNA的重组腺病毒表达载体pShuttle-H1AdEasy-1-P1/P2P3P4,获得了重组病毒子.结论:利用新型腺病毒载体pAdeasy-1系统口J在短期内制备BMI-1干扰基因的腺病毒表达载体,并制备出重组腺病毒PlP2/P3P4.
作者：朱伟；许文荣；乔纯；钱晖 刊期： 2008年第34期
背景:近年来通过细胞移植修复扩张型心肌病受损心肌、提高心功能已成为研究热点,但细胞移植后对心脏电生理的影响仍有待观察.目的:观察同种异体体内移植骨髓间充质干细胞移植后对扩张型心肌病模型兔心功能、结构及电生理的影响.设计,时间及地点:随机对照动物实验.于2004-01/2006-05存重庆医科大学附属儿科研究所电牛理实验室完成.材料:选用43只新西兰白兔,体质量3.0～3.5 kg,雌雄不拘.阿霉素为浙江海正医药公司产品,生产批号为050307.SSD-5000超声诊断仪为日本Aloka生产,RM6240多导电生理记录仪为成都仪器厂生产.方法:①摸球法将实验兔随机分为正常组(n=12),细胞移植组(n=13),模型组(n=13),后两组实验兔参考Amoda等的方法采用阿霉素诱导扩张型心肌病模型,每次lmg/kg,每周2次,连续8周.正常组不造模.获取剩余5只实验兔骨髓原液,用贴壁筛选法分离、扩增、纯化骨髓间充质干细胞.②细胞移植组及模型组模型建立成功后3周暴露心脏,将细胞分4点注射到左室前壁,模型组于相同条件下注射等体积DMEM/P12培养基.正常对照组在相同条件下不注射任何药品.主要观察指标:移植后4周,①采用超声诊断仪检测3组大鼠左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左室射血分数、左室短轴缩短率等心功能指标.②应用多导电生理记录仪检测大鼠心肌单相动作电位振幅、0相上升的大速率、单相动作电位时程从激动开始至复极完成50%及90%的时间,记为MAPD50及MAPD90.⑨取细胞移植组移植区心肌及模型组心肌标本,行透射电镜及光镜下组织学观察,同时进行植入细胞肌钙蛋白T和缝隙连接蛋白43的免疫荧光检测.结果:纳入实验兔43只,细胞移植组中各有9只因阿霉素急、慢性毒性作用以及手术后感染原因死亡,其余25只均进入结果分析.①心功能检测结果:细胞移植组实验兔左室收缩末期内径较模型组减小,左室射血分数,左室短轴缩短率均高于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05).②心电生理检测结果:细胞移植组实验兔MAPDS0、MAPD90短于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05).③心肌组织学观察:模型组可见心肌细胞旱广泛的水肿和显著的空泡变性改变,电镜示心肌细胞线粒体肿胀,增生,肌节长短不一,出现异常收缩带,可见局部心肌溶解,细胞移植组移植区组织与之相比,各种受损表现较轻,且移植细胞有肌钙蛋白T和缝隙连接蛋白43的表达.结论:同种异体体内移植骨髓间充质干细胞后在一定程度上可改善扩张型心肌病模型兔心功能,减轻病理损害,并可能抑制心电紊乱的进一步发展.
作者：余更生；沈兴；田杰；白永虹；朱静；刘官信；陈沅 刊期： 2008年第34期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
