宋清；张晓文；卢新政；侯麦花；王索安
目的:向大脑中动脉缺血大鼠植入神经干细胞,探讨电刺激小脑顶核与神经干细胞共移植体对其向神经元分化的影响.方法:实验于2005-08/2006-11在佳木斯大学神经科学研究所完成.①选取同一基因背景大鼠72只,随机数字表法分成3组:神经干细胞移植组、电刺激+神经干细胞组、电刺激+神经干细胞共移植体组,24只/组.②另选取出生24 h内的Wistar鼠1只用于神经干细胞的分离,制备单细胞悬液,调整细胞密度为5×108 L-1,置于10 mg/L的Brdu完全培养液中孵育72 h.神经干细胞共移植体由神经干细胞、层粘连蛋白和血管内皮细胞构成,由本实验室提供并鉴定.③各组大鼠于造模前1 d麻醉后行小脑顶核刺激,以前囟为零点、正中线向后11.6 mm、正中线向右1.2 mm.给予直角方波脉冲刺激,电流强度为50 μA,频率80 Hz,时程1 h.④各组大鼠均采用线栓法建立局灶性脑缺血动物模型.造模1 d后,分别将培养的神经干细胞及共移植体细胞浓度调整为2×1010 L-1,于缺血纹状体侧缺血半暗带区垂直进针,进入5.0 mm后缓慢推入细胞悬液,神经干细胞移植组、电刺激+神经干细胞组移植神经干细胞悬液10 μL,电刺激+神经干细胞共移植体组移植神经干细胞共移植体悬液10 μL,移植速度为0.5 μL/min,留针10 min后缓慢拔针.⑤各组分别于移植后3,7,14,60 d观察神经于细胞移入脑内后分化成神经元的情况.胞核呈绿色荧光、胞质呈红色荧光的为Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞,代表移植入的神经干细胞所分化的神经元.结果:72只同一基因背景大鼠均进入结果分析.①与神经干细胞移植组比较,移植后7,14,60 d电刺激+神经干细胞组、电刺激+神经干细胞共移植体组Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞百分率均明显升高(F=12.44～25.18,P均＜0.05).移植后3,7,14,60 d电刺激+神经干细胞共移植体组Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞百分率均明显高于电刺激+神经干细胞组(F=8.19～25.18,P均＜0.05).②随移植时间的延长,各组Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞形态均逐渐增大,至移植后60 d时细胞周边可见突起.结论:大脑中动脉缺血模型鼠移植入神经干细胞后,电刺激小脑顶核能够对神经干细胞向神经元的分化产生促进作用,且共移植体与电刺激小脑顶核具有协同效应.
作者：金玉玲；谢艳萍；朱晓峰 刊期： 2007年第24期
目的:观察成人外周血来源的单个核细胞在体外培养过程中形态、增殖能力和表面抗原的变化.方法:实验于2006-08/2007-02在广州南方医院完成.①实验材料:健康志愿者肘静脉血20份,年龄20～26岁,对本实验均知情同意.②实验方法:密度梯度离心健康成人肘静脉血得到单个核细胞,以(2～3)×106/cm2的密度接种于人纤维连接蛋白包被的6孔板,在含有人血管内皮细胞生长因子的M199培养基中进行培养,第4天首次换液,后每3 d换液一次.③实验评估:第3天起观察细胞的形态及数量,分别对培养至第7,21天的贴壁细胞行流式细胞学分析及免疫组化染色检查.结果:①培养细胞的形态学观察:外周血来源单个核细胞接种后约有1/20贴壁,第4天左右可形成从中心向外放射的典型细胞集落,第7天有大量长梭形、双极针样细胞生长.培养第2周长梭形细胞开始凋亡,数量减少,同时出现大量椭圆形鹅卵石样细胞.至第3周鹅卵石样细胞己占据生长优势且增殖旺盛,长梭形细胞基本消失.②内皮祖细胞表面标志的变化:原代培养第7天,贴壁细胞表达与单核巨噬细胞系相关的表面抗原CD44(96.3%)、CD45(83.9%)、CD11c(63.7%)、CD14(11.9%),弱表达内皮细胞相关抗原flk-1(18.2%)、CD31(6.7%)、vWF(3.6%);第21天CD44表达下降至57.6%,而内皮细胞相关抗原CD31表达增加至67.2%,vWF增加至14.2%;造血干细胞相关抗原CD34始终呈阴性表达.免疫组化染色结果与流式细胞分析结果一致.结论:成人外周血中存在两种不同类型的血管内皮前体细胞,单个核细胞贴壁培养4～7 d左右出现早期内皮祖细胞,2～3周时出现晚期内皮祖细胞.二者的外形、增殖潜能、表面抗原表达均不同.晚期内皮祖细胞是更好的种子细胞来源.
作者：李华；高建华；颜玲；鲁峰；朱茗 刊期： 2007年第24期
目的:由于造血干/祖细胞发生基因突变,子代细胞增殖失控等导致的恶性血液病.血管内皮生长因子和白细胞介素12参与这一发生发展过程,检测不同时期其在急性白血病患者静脉血中的水平,有利于认知与血管新生及体液免疫的相关性.方法:随机选择2005-06/2006-04在吉林市中心医院住院的急性白血病患者25例,均经FAB分型或免疫学分型确诊,患者知情同意,并经医院伦理委员会批准.将患者分为:①初诊未治组10例.②复发组5例.③完全缓解组10例.并设9名健康查体者为正常对照.应用定量酶联免疫吸附实验测定受试者血清中血管内皮生长因子和白细胞介素12的水平,在评定白细胞介素12水平时,将初诊未治组与复发组合并为初诊复发组:①两组的发病机制相似.②两组病例数较少,单独观察没有统计学意义.结果:25例患者和9名健康对照者均进入结果分析.①初诊未治组血管内皮生长因子含量高于完全缓解组及正常对照组(P均＜0.05).②正常对照组白细胞介素12水平与初诊复发组、完全缓解组之间差异均具有显著性意义(P均＜0.05).③正常对照组血管内皮生长因子含量与白细胞介素12之间存在负相关(r=-0.964 4 P＜0.05).④初诊复发组、完全缓解组血管内皮生长因子和白细胞介素12含量之间均无相关性(r=-0.088 3,-0.359 3,P均＞0.05).结论:急性白血病患者血清中血管内皮生长因子和白细胞介素12含量与临床病情变化有关,可以作为诊断和预测急性白血病发生和复发的指标.
作者：高丽君；杜冰洋；夏薇 刊期： 2007年第24期
目的:观察一种促凝血草药氯仿萃取水相提取物HB的止血作用.方法:实验于2003-12/2004-12在解放军第三军医大学西南医院全军烧伤研究所国家重点实验室完成.健康家兔18只,体质量2.5～3.0 kg;健康雄性Wistar大鼠70只,体质量(250±10)g;雄性昆明种小鼠78只,体质量(25±5)g.制备HB氯仿萃取-水相提取物后给动物腹腔注射.①将70只大鼠随机分为空白对照组(n=10,30mg/kg腹腔注射生理盐水)、阳性对照组(n=10,云南白药按2 mg/(kg·d)灌胃)、HB高剂量给药组(n=30,分别选取10只动物按5,10,20 mg/kg剂量腹腔注射)、HB低剂量给药组(n=20,分别选取10只动物按0.5,1 mg/kg剂量腹腔注射).观察给药10 d后实验动物的血生化指标(凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、纤维蛋白原含量、凝血酶时间)及血小板计数;②将39只小鼠随机分为空白对照组、云南白药对照组(云南白药0.5 mg/(kg·d)灌胃)和用药组(HB 0.5 mg/kg),每组13只.观察给药10 d后小鼠的出血时间、同样的分组和干预方法观察小鼠的凝血时间.③将待试药设氯仿萃取水相提取物用药组、云南白药阳性对照组、生理盐水阴性对照组.18只家兔各取6只分别用于观察体表、肝脏及股动脉创面的止血实验,观察局部创面(皮肤、肝脏、股动脉)止血时间.结果:纳入健康家兔18只、健康雄性Wistar大鼠70只、雄性昆明种小鼠78只,均进入结果分析.①氯仿萃取水相提取物对大鼠血凝四项及血小板计数的影响:与空白对照组相比,HB氯仿萃取水相提取物腹腔注射可显著提高大鼠的血小板计数;HB高剂量给药组大鼠的凝血酶原时间明显缩短.②对小鼠出血时间及凝血时间的影响:与云南白药对照组及空白对照组相比,HB氯仿萃取水相提取物可显著缩短小鼠的出血时间[(250.2±53.3),(234.5±61.3),(100.2±27.9)s,P＜0.01]及凝血时间[(202.5±50.2),(255.5±27.8),(141.8±37.6)s,P＜0.01].③对家兔局部创面的止血作用:家兔创面止血时间显著短于生理盐水阴性对照组及云南白药阳性对照组[皮肤:(41.20±6.21),(84.10±5.32),(74.80±4.73)s;肝脏:(50.20±3.39),(87.60±6.24),(74.50±5.19)s;股动脉:(62.60±4.50),(103.60±4.35),(98.20±6.07)s;P＜0.01).结论:HB氯仿萃取水相提取物具有良好的体内、外促凝血及创面止血作用.
作者：王秀琴；罗向东；伍素华 刊期： 2007年第24期
背景:在一定条件下,胚胎干细胞可诱导分化成为神经前体细胞,当移植到健全或损伤的中枢神经系统后,可以与宿主细胞有效整合,修复重建损伤的神经组织.目的:观察胚胎干细胞诱导的神经前体细胞移植对小鼠脊髓损伤神经功能恢复的影响.设计:随机对照动物实验.单位:上海第二医科大学发育生物学研究中心.材料:选用28只6～8周龄C57/BL6J小鼠,雌雄不限.小鼠胚胎干细胞株S8及携带LacZ标记基因由上海市发育生物学研究中心提供.高糖DMEM、2-巯基乙醇、小鼠白血病抑制因子、丝裂霉素C均来自GIBCO贴壁诱导培养液由上海市发育生物学研究中心提供.方法:实验于2003-04/2004-04在上海第二医科大学发育生物学研究中心实验室完成.采用贴壁诱导法将ES细胞培养诱导分化为神经前体细胞,将小鼠麻醉,在9～10椎骨平面制成脊髓半横断模型,随机摸球法将大鼠分为3组,假手术组(n=9):仅剪除T9-10棘突和椎板后,逐层缝合.干细胞移植组(n=10):脊髓半横断后,行距损伤区域以远约1 cm的椎管内注射细胞.模型组(n=9):脊髓半横断后在损伤邻近区注射DMEM.各组分别于实验后第1,2,4,6,8周采用BBB评分观察各组小鼠神经功能恢复情况,实验后第8周(BBB评分后)利用x-gal染色观察各组脊髓损伤区胚胎干细胞存活和分化情况.X-gal染色干细胞移植组阳性的损伤脊髓部位切片进行荧光免疫组化检测.主要观察指标:①各组小鼠神经功能恢复情况.②各组脊髓损伤区胚胎干细胞存活和分化情况.③荧光免疫组化检测结果.结果:①干细胞移植组第1,2,4周BBB得分,高于模型组(P＜0.01).②脊髓损伤区胚胎干细胞存活和分化情况:干细胞移植组中小鼠的脊髓损伤处组织切片可以发现x-gal染色阳性的细胞,胞浆呈现蓝色,即胚胎干细胞来源的衍生细胞,而假手术组和模型组的脊髓均未见该现象.干细胞移植组损伤脊髓部位植入的胚胎干细胞来源的衍生细胞分布损伤区周围并与周围组织整合,与周边细胞在形态上类似.③干细胞移植组损伤脊髓部位,X-gal染色阳性细胞可表达神经元特异性标志NF,但没有表达GFAP标志.结论:将ES细胞的培养诱导分化为神经前体细胞移植后,能够存活、迁移、并分化为神经元,但改善神经功能情况不明显.
作者：杨建华；王凤华；李长德；王裕；马杰 刊期： 2007年第24期
目的:观察不同质量浓度转化生长因子β1作用于体外培养小鼠失神经骨骼肌肌源性干细胞后,细胞内结缔组织生长因子生成的变化.方法:实验于2006-03/06在武汉协和医院中心实验室完成.实验材料:清洁级3周龄昆明种小鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供(动物使用许可证:syxk(鄂)2004-0028).实验方法:采用差速贴壁法分离培养并鉴定小鼠失神经骨骼肌肌源性干细胞.取第2代肌源性干细胞,均匀加入6孔培养板中,每孔细胞数为104,置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养2 d后,更换培养液.A～F组每孔加入含有质量浓度0,1,5,10,20,40 μg/L重组人转化生长因子β1的含体积分数为0.2胎牛血清的DMEM培养基后,置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养3 d.G～L组每孔分别加入含有质量浓度为10 μg/L重组人转化生长因子β1的含体积分数为0.2胎牛血清的DMEM培养基后,同样条件培养箱中培养0,3,6,12,24,48 h.实时荧光定量RT-PCR检测结缔组织生长因子mRNA水平,应用Western blot检测结缔组织生长因子蛋白表达变化.结果:①Western blot检测结缔组织生长因子蛋白:可见阳性条带.A～D组平均吸光度比值随转化生长因子β1质量浓度增加而上升,组间差异具有显著性意义(0.854±0.157,1.203±0.144,2.471±0.141,3.652±0.202,P＜0.05),D～F组上升曲线趋于平缓,组间差异无显著性意义(3.652±0.202,3.736±0.216,3.919±0.226,P＞0.05).G～J组平均吸光度比值随转化生长因子β1质量浓度增加而上升,组间差异具有显著性意义(0.788±0.123,1.063±0.143,2.154±0.153,2.997±0.136,P＜0.05),J～L组上升曲线趋于平缓,组间差异无显著性意义.②RT-PCR检测结缔组织生长因子mRNA水平:A～D组结缔组织生长因子mRNA扩增量明显随转化生长因子β1质量浓度升高而上升,差异具有显著性意义(1.713±0.123,1.992+0.143,2.237±0.153,2.859±0.136,P＜0.05),E、F组间差异无显著性意义.G～J组结缔组织生长因子m RNA扩增量明显随转化生长因子β1质量浓度升高而上升,差异具有显著性意义(1.659±0.215,1.897±0.134,2.188±0.259,2.814±0.263,P＜0.05),J～L组间差异无显著性意义(P＞0.05).结论:转化生长因子β1能够促进体外培养小鼠肌源性干细胞生成结缔组织生长因子,在1～10 μg/L质量浓度范围内呈剂量依赖关系,在3～12 h范围内呈时间依赖关系.
作者：聂铭博；陈振兵；洪光祥 刊期： 2007年第24期
目的:完善眼外肌成肌细胞体外培养、鉴定的方法及观察其生物学特性.方法:实验于2005-02/08在青岛大学医学院附院中心实验室(省级实验室)完成.取出生后3～7 d的大鼠,通过大鼠眼外肌细胞的取材、分离、消化、培养等技术,观察细胞的形态、生长曲线、细胞融合率,观察大鼠眼外肌卫星细胞的增殖与分化能力,利用成肌细胞标记物α-横纹肌肌动蛋白、中间丝结蛋白免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定.结果:①成肌细胞的生长情况:在生长培养基作用下,细胞增殖旺盛;在分化培养基条件下,细胞分化良好,可融合成肌管.②成肌细胞融合率:在24 h和48 h融合率提高明显,72 h达高峰,之后不再变化.③细胞免疫化学检测结果:α-横纹肌肌动蛋白和中间丝结蛋白免疫细胞化学染色阳性.结论:体外培养的大鼠眼外肌卫星细胞具有良好的增殖与分化能力,其生物学特征同骨骼肌卫星细胞.
作者：张立贵；王传富；黄晓辉 刊期： 2007年第24期
对本院门诊及住院复发性翼状胬肉患者36例(45眼)行翼状胬肉切除加角膜缘干细胞移植术,并对患者术后疗效进行随访观察.结果随访6个月至3年,仅3例复发,占6.67%,复发率较传统手术方法明显降低,并具有术后创面愈合快、刺激症状轻、并发症少等优点.说明角膜缘干细胞移植术治疗复发性翼状胬肉疗效可靠,可以明显降低手术复发率,适合临床应用.
作者：许和；王丽华；李晓慧；候丽萍 刊期： 2007年第24期
目的:评价亲缘异基因造血干细胞移植与酪氨酸激酶抑制剂STI571治疗非慢性期慢性粒细胞白血病的有效性及安全性.方法:①对象:所有患者在治疗前均经骨髓细胞学、细胞遗传学和/或分子遗传学检查确诊为加速或急变期慢性粒细胞白血病.实验经医学伦理委员会批准,患者均知情同意.STI571治疗组23例患者,男13例,女10例,平均年龄32岁,2002-04/2006-06陆续开始应用STI571,观察截止时间为2006-10,平均用药17.5个月.造血干细胞移植组7例患者,1999-07/2006-04收治,男6例,女1例,平均年龄35.4岁;健康亲缘性异基因造血干细胞供者7例,均与受者经HLA配型证实为全相合.②STI571治疗:23例患者每日口服STI571 600 mg,此过程未给予其他治疗慢性粒细胞白血病的药物.出现以下任一情况药量增至800 mg:治疗3个月仍未达到血液学完全缓解;达到血液学缓解后复发;达到主要遗传学缓解后复发.出现以下任一情况给予停药或减量:中性粒细胞＜1×109 L-1或血小板＜50×109 L-1;出现≥Ⅱ级非血液学不良反应.每周复查血常规,根据血象和骨髓象凋整剂量,每3个月进行骨髓象及细胞遗传学检查.③干细胞移植的相关干预方案:7例患者均采用经典/改良BuCy2方案进行预处理,再给予短程甲氨蝶呤联合环孢菌素A方案预防移植物抗宿主病,其中部分患者加用抗淋巴细胞球蛋白预防移植物抗宿主病.环孢菌素A于移植前1 d以10 mg/(kg·d)分2次口服,并逐渐调整其血浓度至200～400 μg/L;移植后1 d静脉注射甲氨蝶呤15 mg/m2,移植后3,6,11 d静脉注射甲氨蝶呤10 mg/m2.④有效性评估:包括血液学效应(血液学完全缓解、部分缓解、未缓解)、血液学复发及疾病进展、细胞遗传学反应(根据Ph+细胞所占比例分为完全缓解、大部分缓解、小部分缓解、微缓解、不缓解、主要遗传学反应、遗传学复发).⑤安全性评估:按WHO不良反应分度标准分为0～4度.结果:30例患者均进入结果分析.①血液学和细胞遗传学效应:STI571治疗组23例患者均可评价血液学和细胞遗传学效应,12例(52.2%)保持血液学完全缓解,5例(21.7%)发生主要遗传学效应,其中4例(17.4%)为遗传学完全缓解.造血干细胞移植组7例患者于移植后3～6个月均可评价血液学和细胞遗传学效应,且获得血液学和细胞遗传学完全缓解,与STI571治疗组比较差异有显著性意义(P＜0.05).②两组患者的生存情况:两组患者的总体存活率行Kaplan-Meier法比较,差异无显著性意义(x2=0.04,P=0.85).③不良事件与副反应:STI571治疗组在治疗期间,没有患者因药物不良副作用而停药、死亡,7例(30.4%)患者发生Ⅲ/Ⅳ级白细胞和/或血小板减少.造血干细胞移植组2例(28.6%)发生Ⅲ～Ⅳ度急性移植物抗宿主病,3例(42.9%)发生慢性移植物抗宿主病,给予相应治疗后3例无效死亡;移植60 d内发生细菌或真菌感染4例,监测出巨细胞病毒血症2例,经治疗后均得到控制;2例患者发生出血性膀胱炎,经治疗后病情缓解.结论:亲缘异基因造血干细胞移植后血液学完全缓解率、细胞遗传学完全缓解率显著优于STI571治疗,但两种方法终的患者生存率基本相似.
作者：黎纬明；夏凌辉；游泳；刘新月；仲照东；邹萍 刊期： 2007年第24期
目的:采用不同方法对白血病HL60细胞株进行冻存和复苏,观察生物学特性改变,筛选佳冻存复苏方案.方法:实验于2006-04/06在吉林医药学院临床检验实验室(国家三级标准)进行.①HL60细胞株由中国科学院上海生物细胞研究所提供.将欲冷冻保存的HL60细胞调整到良好的生长状态(对数生长期),随机数字表法分成4组,离心收集后在含体积分数为0.1小牛血清的RPMI-1640培养基中分别加入二甲基亚砜,使其终浓度依次为50,100,150,200 g/L.冻存15 d后,每组取1支冻存管复苏并接种于细胞培养板,培养12 h后用锥虫蓝拒染法计算细胞复苏率.②选择冻存条件和冻存细胞密度相同的两支冻存管,按不同方法进行HL60细胞复苏.37 ℃水浴传统复苏法:立即将冻存管置于37 ℃水浴中,待融化后800 r/min离心5 min,吸去上清液,加入含体积分数为0.1小牛血清的RPMI-1640培养基,混匀后接种于细胞培养板,1 mL/孔,9孔/组,置于体积分数为0.05的CO2培养箱37 ℃继续培养.40 ℃溶解后再37 ℃恒温改良复苏法:将冻存细胞于40 ℃水浴中迅速溶解,转入37 ℃水浴箱,融化后离心、加培养基等操作同传统复苏法.复苏细胞培养12 h后采用锥虫蓝染色计算细胞存活率.③用无血清RPMI-1640培养基制备HL60细胞悬液,按3×107 L-1密度接种于细胞培养板中,1 mL/孔,然后分别加入体积分数为0.05,0.1,0.12,0.15,0.2的灭活小牛血清,每种血清浓度设置8个试验孔,并分别于培养12,24,36,48,60,72,84,96 h后计数每孔细胞数量,并绘制细胞生长曲线.结果:①不同浓度二甲基亚砜冻存后HL60细胞复苏率的比较:二甲基亚砜200 g/L组的细胞复苏率明显低于二甲基亚砜50,100,150 g/L组[(64.6±2.8)%,(87.0±1.4)%,(86.4±2.1)%,(85.7±2.8)%;t=25.44,P＜0.01],二甲基亚砜50,100,150 g/L组间差异无显著性意义(t=0.82～1.44,P＞0.05).②不同复苏方法HL60细胞存活率的比较:与37 ℃水浴传统复苏法比较,40 ℃溶解后再37 ℃恒温改良复苏法的细胞存活率显著升高[(69.5±1.5)%,(87.4±1.8)%,t=23.24,P＜0.01].③RPMI-1640培养基不同血清含量对HL60细胞生长情况的影响:在体积分数为0.05的血清含量培养基中,HL60细胞基本不生长,且有逐渐死亡的趋势;在体积分数为0.1的血清含量培养基中,HL60细胞生长趋势明显,但生长速度相对较慢;在体积分数为0.12,0.15,0.2的血清含量培养基中,HL60细胞生长迅速,3种血清浓度间细胞生长趋势无明显差异.结论:以50 g/L二甲基亚砜作为HL60细胞冻存保护剂、联合40 ℃溶解后再37 ℃恒温改良复苏法可使细胞保持佳生物学特性,体积分数为0.12的血清含量为HL60细胞常规培养的适浓度.
作者：侯毅鞠；袁忠海；李艳；郭素红 刊期： 2007年第24期
目的:为寻找采集外周血造血干细胞更合适的手段,探讨间断流动式血细胞分离机采集外周血造血干细胞的效果.方法:选择中山大学第五附属医院血液风湿科2004-2006年12例行外周血造血干细胞移植住院患者.①实验对象:供者5例,男1例,女4例,一般状况良好,与患者关系为同胞妹妹3例,同胞弟弟1例,同胞姐姐1例;患者7例,男3例,女4例,23～62岁,7例为自体移植,5例为异基因移植.血液系统疾病患者9例(非霍奇淋巴瘤3例,急性淋巴细胞白血病2例,急性髓细胞白血病2例,慢性粒细胞白血病1例,骨髓增生异常综合征1例);自身免疫性疾病3例(重型系统性红斑狼疮2例,难治复发性类风湿关节炎合并干燥综合征1例).②实验过程:每位供/患者均知情同意并签署知情同意书.对于自体患者,根据患者的疾病类型采取不同的干细胞动员化疗方案,联合化疗后7～10 d,待白细胞下降至低点,一般为≤1.0×109 L-1时,给予粒细胞集落刺激因子5 μg/kg皮下注射,白细胞升至3.0×109 L-1时开始采集;对于allo-PBSCT供者直接给予粒细胞集落刺激因子5μg/kg,皮下注射,1次/d,共5 d,同时应用流式细胞仪检测CD34+细胞数,至白细胞升至≥20.0×109 L-1或当CD34+细胞升高＞20个/μL时采用增强型多功能血细胞分离机PBSC程序卡采集健康供者和患者外周血造血干细胞.③实验评估:分析采集效率、血液学参数、不良事件发生率、以及供、受者ABO血型不合的患者回输干细胞溶血反应等情况.结果:12例供者、患者均进入结果分析.①共进行了24次采集,其中1次采集1例,2次采集7例,3次采集3例,平均循环次数(25±5)次,采集时间(228±32)min,处理血量(723 4±120 5)mL,复方枸橼酸钠溶液用量为(623±96)mL,干细胞收集量为(102±21)mL,CD34+细胞采集效率为(54.3±30.7)%,细胞计数示白细胞为(156±34)×109 L-1,单个核细胞为(79.7±13.2)×109 L-1,流式细胞仪检测CD34+细胞为(10.30±4.38)×106/kg受者体质量.②不良反应轻微,24次采集过程中出现不良反应6次均为枸橼酸盐所致低钙血症反应.血红蛋白和血小板与采集前相比分别下降9.36%和11.10%.供、受者ABO血型不合的3例患者在输注造血干细胞悬液后均未出现溶血反应.③12例均获造血功能重建,无移植相关死亡.结论:用间断流动式血细胞分离机采集外周血造血干细胞效果良好,不良反应轻微,能有效的减少被采集者红细胞、血小板的丢失,对供、受者ABO血型不合者不需去除造血干细胞悬液中的红细胞,值得临床应用.
作者：何志国；侯丽君；李碧香；徐景勃；曾林涓 刊期： 2007年第24期
外周血造血干细胞移植已越来越多的应用于临床,在干细胞移植治疗过程中,动员和采集足够的造血干细胞是移植成功的关键.重组人粒细胞集落刺激因子是当前外周血造血干细胞动员的主要方法.
作者：吴金艳 刊期： 2007年第24期
目的:采用客观的电生理检查手段评价胚胎嗅鞘细胞移植治疗晚期脊髓损伤的有效性.方法:①对象:选择2003-02/2005-01北京市西山医院暨北京康复中心神经外科收治的接受人胚胎嗅鞘细胞移植治疗的晚期完全性脊髓损伤患者199例,男164例,女35例,平均年龄(34.7±11.3)岁,平均病程(4.7±5.5)年;受伤节段:颈段99例,胸段89例,胸腰段11例;受伤原因:车祸、摔伤、医源性损伤、机器挤压伤等.4个月流产胚胎由北京市虹天济神经科学研究院协作医院提供,产妇及其家属均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②方法:取人胚胎嗅球,消化成单个嗅鞘细胞后培养2周.199例晚期完全性脊髓损伤患者均接受人胚胎嗅鞘细胞移植治疗,在全麻下行脊髓损伤节段后方入路,切开硬膜,显露出病变脊髓.分上下两点各注入50 μL嗅鞘细胞悬液,细胞数共约1×106个.术后给予止血、抗感染等处理,未使用任何免疫抑制剂.③评估:移植前后分别采用肌电/诱发电位仪检查肌电图和椎旁躯体感觉诱发电位,每例患者检查2次,时间一致,且由同一医生操作.肌电图即检查患者大力收缩时的肌肉情况,以观察运动单位电位的数量、波幅及持续放电能力.椎旁躯体感觉诱发电位是于中线旁开2 cm处两侧同时给予刺激,刺激强度以引起可见的肌肉抽动为准,在头皮上记录电位.方波刺激频率3 Hz,强度20～40 mA,时限0.2 ms,观察感觉平面下降情况.结果:199例晚期完全性脊髓损伤患者均进入结果分析.①术后肌电图检查:93例(46.7%)显示部分受累肌肉大力收缩时募集波型改善,运动单位电位数量增加;105例(52.8%)无变化,1例(0.5%)比术前差.②椎旁躯体感觉诱发电位检查:90例(45.2%)显示感觉平面下降,其中左侧平均下降(1.9±1.2)个节段,右侧平均下降(2.0±1.2)个节段;107例(53.8%)无变化,2例(1.0%)双侧感觉平面上升.结论:对于胚胎嗅鞘细胞移植治疗晚期脊髓损伤患者,肌电图和椎旁躯体感觉诱发电位这两种电生理检查能较为客观的反映脊髓术后感觉和运动功能恢复情况.
作者：陈琳；黄红云；王援朝；张峰；郗海涛；张健；刘彦铖 刊期： 2007年第24期
目的:比较脐静脉、成人骨髓及胎儿骨髓3种不同来源的间充质干细胞体外生长特性及分化潜能.方法:①实验于2004-01/2006-06在苏州大学附属第二医院中心实验室完成.孕39～40周健康产妇正常分娩2 h的脐带以及3～4月龄流产胎儿均由苏州大学附属第二医院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意.正常成人骨髓由苏州大学附属第二医院血液科研究生捐献.本实验经医学伦理委员会批准.②脐带用含青、链霉素的磷酸盐缓冲液冲净静脉腔内残血,夹闭两端,经37 ℃预热的1.5 g/L胶原酶消化,重悬于DMEM-LG(含体积分数为0.1的新生牛血清、20 mmol/L HEPES、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1 mmol/L 丙酮酸钠),以108 L-1密度接种于25 cm2培养瓶常规培养,48 h后弃上清,以后每两三天半量换液,3周后用5 g/L胰酶消化传代.③抽取正常成人骨髓5～10 mL,ficoll分离单个核细胞,收取白雾层及以上部分细胞,采用上述培养基按相同条件进行培养,约14～18 d胰酶消化传代.④取流产胎儿,无菌条件下分离股骨,冲洗干净后采用两种方法分离间充质干细胞:直接将胎骨剪成约1 mm3大小的碎片,磷酸盐缓冲液洗涤后加入少量上述培养基,置10 cm培养皿培养;剪去股骨两端后,用上述培养基冲出骨髓腔内细胞,直接培养.⑤观察连续传代对3种不同来源间充质干细胞增殖的影响;免疫荧光及免疫组化分析所得细胞的表型;观察3种不同来源间充质干细胞在诱导培养条件下向成骨及成脂细胞分化的潜能.结果:①不同来源间充质干细胞的体外增殖特性:脐带、成人及胎儿骨髓内均存在间充质干细胞,且细胞形态相似.成人骨髓间充质干细胞的体外增殖能力较差,传至10～12代基本失去增殖能力.脐静脉间充质干细胞的增殖能力强于成人骨髓间充质干细胞,可体外连续传代15～18次.而胎儿来源的间充质干细胞增殖能力及体外传代更新能力均明显强于其他两种间充质干细胞,传至20代时基本保持原有的特性.②不同来源间充质干细胞免疫表型:3种间充质干细胞均高表达CD29、CD44、CD54及HLA-ABC分子,成人骨髓源间充质干细胞还表达中等量的CD106及少量HLA-DR.3种间充质干细胞均不表达造血细胞标志CD34和CD45,其中脐静脉来源的间充质干细胞αSMA呈阳性,vWF呈阴性.③不同来源间充质干细胞的分化潜能:在成脂或成骨条件培养基中,3种间充质干细胞均可向脂肪及成骨细胞分化,油红O及von Kossa染色呈阳性.结论:①脐带、成人及胎儿骨髓内均存在数量不等的间充质干细胞,其形态、生长特性及表面标志具有相似性.②脐静脉源间充质干细胞的增殖能力优于骨髓间充质干细胞,尽管略弱于胎源性间充质干细胞,但其来源广泛、分离方便、间充质干细胞得率高,且没有伦理限制,是一种较好的间充质干细胞来源.
作者：傅晋翔；张晓惠；张建华；张阳敏；孙谕 刊期： 2007年第24期
目的:对比观察骨髓间充质干细胞移植前后脑梗死大鼠脑电图的变化.方法:实验于2002-09/12在解放军第三军医大学中心实验室及西南医院神经内科肌电图室完成.①实验分组:选取清洁级健康成年Wistar大鼠15只,随机数字表法分为干细胞移植组、模型对照组、假手术组,5只/组.②实验方法:另取2只健康幼年Wistar大鼠用于骨髓间充质干细胞的提取,联合采用密度梯度离心及贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,选取生长良好的1～3代细胞用于移植实验.干细胞移植组、模型对照组大鼠建立大脑中动脉栓塞模型.假手术组仅分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉,不予结扎和放置线栓.造模后1周,干细胞移植组、假手术组大鼠行细胞移植,在立体定向仪定位下于脑梗死区(壳核)直接注射骨髓间充质干细胞悬液5 μL,细胞浓度1×104 μL-1,移植坐标为前囟前1.0 mm,右旁开3.0 mm,硬膜下5.0 mm.模型对照组大鼠于相同部位注射等量不含细胞的磷酸盐缓冲液.③实验评估:采用脑电图机分别于造模前、造模后1周(移植前)、细胞移植后4周对各组大鼠进行脑电图检测.结果:15只大鼠均进入结果分析.①造模前基本节律为8～11 Hz、15～30 μV的α波,间或少量θ波,双侧对称.②造模后1周,假手术组异常率为0;模型对照组20%(1/5)轻度异常,80%(4/5)中度异常;干细胞移植组20%(1/5)轻度异常,60%(3/5)中度异常,20%(1/5)重度异常.③细胞移植后4周,假手术组脑电图恢复正常;模型对照组随术后时间的延长慢波有所减少,但仍可见到δ波、棘波、棘慢波的发放,至细胞移植后4周60%(3/5)轻度异常,40%(2/5)中度异常;干细胞移植组术后局限性慢波逐渐减少,基本节律全部恢复为α波,不对称的情况明显好转,至细胞移植后4周60%(3/5)轻度异常,以病灶侧局限性θ波较多为主,另外40%(2/5)基本正常.结论:动物实验显示骨髓间充质干细胞移植对脑梗死大鼠的脑电图背景节律有改善作用,一定程度上促进了神经系统功能的恢复.
作者：桂莉；范文辉；李露斯；王惠玉；陈康宁 刊期： 2007年第24期
目的:采用骨髓间充质干细胞体外向软骨方向诱导分化并和两种载体(胶原海绵和聚乳酸/聚羟乙酸共聚物)混合形成立体培养,对两种不同生物材料的生物相容性进行观察.方法:实验于2005-03/2006-05在华北煤炭医学院中心实验室完成.①实验材料:清洁级成年SD大鼠1只,雌雄不限;聚乳酸/聚羟乙酸共聚物(山东医疗器械研究所高分子室),胶原海绵(上海其胜公司).②实验分组:实验分为3组,即聚乳酸/聚羟乙酸共聚物组、胶原海绵组和平面培养组.③实验干预:取成年大鼠骨髓以密度梯度离心加贴壁分离法纯化分离骨髓间充质干细胞,传至第3代.将细胞以1.5×104/孔定量接种于各组的培养板内,加全培养诱导液[转化生长因子β1 10 μg、碱性成纤维生长因子10 μg、地塞米松100 nmol、维生素C 50 mg、β-甘油磷酸钠10 mmol和ITS 50 mL(牛血清白蛋白,牛转铁蛋白,牛胰岛素及微量元素)].④实验评估:培养1周后,随机取样使用甲苯氨蓝染色和特异性Ⅱ型胶原单克隆抗体免疫组织化学染色后进行检测.培养4周后使用扫描电镜观察细胞在载体上附着和生长的情况.结果:①骨髓间充质干细胞生长情况及形态:3周后倒置相差显微镜观察,可见细胞围绕在材料周边生长,随培养时间的延长,细胞形成均一的椭圆形,各载体组的细胞与平面对照组相似,无细胞衰老及异常分裂现象.②软骨细胞特异性检测:3组间甲苯氨蓝染色和特异性Ⅱ型胶原单克隆抗体免疫组织化学染色差异无显著性.③载体材料扫描电镜观察结果:在两种载体表面,分别有部分细胞黏附在载体表面生长,并在其表面连接成片.结论:胶原海绵和聚乳酸/聚羟乙酸共聚物对大鼠骨髓间充质干细胞在向软骨诱导过程中的细胞功能、细胞生长增殖无影响,两种生物材料具有良好的生物相容性,可作为软骨组织工程的载体材料应用.
作者：张翼；宋敬锋；白俊清；程爱国；张迪 刊期： 2007年第24期
背景:表皮干细胞的研究有相当的成绩,但皮肤移植成活过程中表皮干细胞数量及在皮肤各层中的分布动态变化规律尚需探讨.目的:观察自体全层皮肤移植成活过程中表皮干细胞随其所处微环境的改变及其变化规律.设计:对比观察的前瞻性动物实验.单位:南华大学第一附属医院烧伤整形外科.材料:选用南华大学实验动物中心提供的Wistar大鼠42只,2～3月龄,清洁级,雌雄不拘,体质量200～250 g.饲养1周后按观察时间随机分为7组,术后24 h组,3 d组,5 d组,7 d组,14 d组,21 d组和30 d组,每组6只.抗体:一抗:兔抗鼠整合素β1多克隆抗体(武汉博士德生物公司)小鼠抗大鼠p63单克隆抗体(santa cruz公司);二抗:山羊抗兔lgG(北京中杉生物公司),山羊抗小鼠lgG(北京中杉生物公司);S-P免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒(北京中杉生物公司).方法:实验于2006-05在南华大学动物实验室完成.①所有大鼠背部制作(1.5×1.5)cm2面积的自体全层皮肤移植模型,在不同时间点观察移植皮片的颜色改变,移植皮片下是否有积血、积液,皮片是否与创面粘合.②每只大鼠手术时切取少许皮片立即放入100 g/L中性甲醛中固定并标记为空白对照组.③术后24 h组,3 d组,5 d组,7 d组,14 d组动物分别在相应时间拆开移植皮片固定包,在各创面中央切取皮肤组织固定并标记;术后21 d组和30 d组术后14 d拆包,继续喂养至术后21 d和30 d在移植皮片中央切取皮肤组织.④制作HE染色和免疫组织化学染色病理切片.主要观察指标:①切片中炎症细胞的数量、上皮化程度、纤维细胞的含量.②整合素β1和基因物质p63阳性细胞率.结果:纳入Wistar大鼠42只全部进入结果分析.①创面大体观察:术后一二天颜色苍白、水肿;术后3 d皮片颜色未见有明显的好转,但皮片与创面贴附较紧密;术后7 d皮片颜色明显好转,表皮颜色接近正常,皮片与创面粘连紧密,创面有部分毛根长出;术后14 d皮片创周已经和创面完全愈合;术后30 d皮片颜色较正常稍微深,毛发生长同正常皮肤.②苏木精-伊红染色病理切片观察结果:前4组见皮片内细胞水肿,有少量炎性细胞浸润,术后5 d发现皮片部分角质细胞坏死脱落.③阳性细胞的分布和数量变化规律:整合素β1和基因物质P63阳性细胞在术前主要分布于表皮的基底层和毛囊隆突部,从术后24 h阳性细胞开始在表皮的各层出现,且数量逐渐增多,术后14和21 d在表皮的各层均见到较多的阳性细胞,术后30 d阳性细胞主要分布在表皮的基底层,但在其它各层仍然有少量的阳性细胞出现.免疫组化切片中基因物质P63的阳性细胞数均高于同时限点β1整合素的阳性细胞数,从术后24 h开始减少,到术后3 d达到低点,然后逐渐增加,到术后7 d阳性细胞的比例达到或接近术前,继续增加.术后21 d时阳性细胞比例达到高点,然后又逐渐减低,术后30 d时阳性细胞比例仍高于术前.结论:①表皮干细胞在自体全层皮片移植成活过程中先减少,然后逐渐增加至超过正常皮肤.②自体全层皮肤移植成活过程中,表皮干细胞在皮肤中的排列紊乱,几乎在表皮各层均能见到表皮干细胞;而后又逐渐集中于表皮的基底层和毛囊隆突部.
作者：陶克奇；李利平 刊期： 2007年第24期
目的:观察急性髓性白血病经混合造血干细胞移植后,应用供者淋巴细胞输注+白细胞介素2治疗的效果,并与移植后未经特殊治疗的效果进行比较.方法:①选取2000-01/2004-07解放军兰州军区兰州总医院全军血液病中心收治的19例急性髓性白血病患者,实验经医院伦理委员会批准,患者均知情同意.随机数字表法分为两组:观察组8例,年龄17～40岁,M2a 4例,M4 1例,M5a 3例;对照组11例,年龄19～39岁,M2a 2例,M3a 2例,M4 3例,M5a 4例.②两组患者采用化疗联合重组人粒细胞集落刺激因子的方法动员自体外周血造血干细胞,采集后液氮中保存5 d备用.③术前采用直线加速器对患者全身及肺部照射,预处理完毕后实施混合造血干细胞移植.首先回输自体单个核细胞中位数为4×108/kg,CD34+细胞中位数为6.2×106/kg,粒-巨噬祖细胞集落形成单位中位数为5.8×104/kg.间隔1～6 h后,采集人类白细胞抗原半相合异体骨髓,按回输自体单个核细胞数的1/6～1/10输注给患者.④两组患者移植期间均住无菌层流病房,给予相应并发症的防治及支持治疗.在粒细胞降至0时注射重组人粒细胞集落刺激因子150 μg/12 h,促进造血恢复.观察组给予供者淋巴细胞输注+白细胞介素2治疗,每次采集的供者淋巴细胞中,CD3+淋巴细胞中位数为1.43×108/kg,CD4+细胞中位数为0.97×108/kg,CD8+细胞中位数为0.41×108/kg,中位治疗次数4(1～7)次,回输后即开始应用100 wu/d重组人白细胞介素2,共10 d.对照组混合造血干细胞移植后未给予特殊治疗.结果:19例急性髓性白血病患者均进入结果分析.①造血恢复:两组患者均获得造血重建,术后4～9 d粒细胞均降至0,12～17 d粒细胞达0.5×109 L-1,16～21 d白细胞达4.0×108 L-1,19～23 d血小板达20×108 L-1.16～21 d骨髓检查示恢复期骨髓象.②术后并发症:两组患者不同程度地出现口腔溃疡,随着造血恢复,7～10 d溃疡消失.观察组1例患者出现出血性膀胱炎,两组各2例患者出现发热.无肝静脉闭塞病和移植物抗宿主病发生.③嵌合体形成:观察组中1例M4患者形成嵌合体,对照组中2例M4患者与1例M5患者形成嵌合体,嵌合体持续存在3～12个月.④供者淋巴细胞输注+白细胞介素2疗效:观察组中有1例M2a患者在接受2次特殊治疗后7个月复发死亡;1例M2a患者接受2次特殊治疗后1年出现骨髓增生异常综合征,脑出血死亡,1例M5a患者应用特殊治疗1次后出现不明原因高热、抽搐,死于癫痫持续状态,其余5例患者随访2年均健康存活,长期生存率为62.5%(5/8).对照组有2例M2a患者、2例M4患者、1例M5患者于移植后1～7个月复发死亡,1例M3患者于移植后25 d死于脑出血,其余2例M3患者、2例M4患者、1例M5患者随访2年均健康存活,长期生存率为45.4%(5/11).结论:混合造血干细胞移植后应用供者淋巴细胞输注+白细胞介素2治疗,急性髓性白血病患者均获得造血重建且无移植物抗宿主病发生,其长期生存率有效提高.
作者：王存邦；白海；欧英贤；潘耀柱；张茜；葸瑞 刊期： 2007年第24期
背景:如何抑制或减少神经干细胞凋亡的发生,促进缺氧后神经干细胞的存活,成为脑梗死神经干细胞移植治疗的研究热点.目地:观察在缺氧状态下转染人类persephin基因对神经干细胞凋亡的作用.设计:完全随机分组,对照实验.单位:中山大学附属第二医院神经内科.材料:实验于2006-07/2006-12在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成,重组腺病毒pAd persephin由本实验室构建保存,C17.2神经干细胞由美国哈佛大学医学院Snyder教授惠赠.胰蛋白酶、DMEM/F12购自Gibco公司;胎牛血清来自杭州四季青生物工程公司;多聚赖氨酸购自美国Sigma公司;TUNEL检测试剂盒,阳离子脂质体FuGENE购自瑞士Roche公司;S-P免疫组化试剂盒及DAB显色剂购自福建迈新生物工程公司;鼠抗人Nestin单抗,Persephin兔抗人多抗购自美国Santa Crus公司,persephin反义寡核脱氧苷酸由上海生工合成.方法:①实验干预:将携带人类Persephin基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞,分为4组,A组:正常对照组,C17.2神经干细胞不作缺氧处理.B组:缺氧处理组,即置于37 ℃、体积分数0.95 N2,体积分数0.05 CO2厌氧培养箱培养.C组:缺氧+pAdpersiphin转染组,即:将携带人类Persephin基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞,pAdpersiphin转染48 h后的细胞置同B组条件的厌氧培养箱培养.D组:缺氧+pAdpersiphin转染组+persiphin反义寡核脱氧苷酸,即pAdpersiphin+persiphin反义寡核脱氧苷酸转染.②实验评估:Western-blotting法分析Persephin蛋白的表达;TUNEL法检测凋亡指数;流式细胞术测定细胞凋亡率的变化.主要观察指标:Persephin蛋白的表达、细胞凋亡指数和凋亡率.结果:①Persephin蛋白表达:C组细胞经Western blot检测可见一特异性蛋白条带存在,Mr约为24 000,符合预期结果,说明persiphin成功表达,D组亦可见一M(1) 24 000的条带,但条带较单纯pAdpersiphin感染组明显为淡,说明反义persiphin反义寡核脱氧苷酸可成功抑制pAdCMVpersiphin的表达.②细胞凋亡指数:C组凋亡细胞明显减少,凋亡指数低于B、D组(P＜0.01),但高于A组(P＜0.01),表明细胞凋亡未完全避免.③细胞凋亡率:B、D组凋亡率明显高于A组(P＜0.01),C组明显较B组、D组低(P＜0.01).结论:腺病毒介导的Persephin基因能高效表达Persephin;外源性Persephin对C17.2神经干细胞具有抗凋亡作用,能够提高C17.2神经干细胞对缺氧的耐受性.
作者：沈庆煜；肖颂华；黎祥喷；叶剑虹；王艺东 刊期： 2007年第24期
目的:在已成功分离培养皮质神经干细胞的基础上,体外分离培养鼠胚中脑区的神经干细胞,并进行鉴定,为中脑神经干细胞的基础与应用研究建立细胞培养平台.方法:实验于2005-11/2006-07在武汉工业学院完成.①选取孕12～13 d昆明小鼠1只,处死后无菌条件下分离胚胎腹侧中脑,胰酶消化和机械吹打制成单细胞悬液,在碱性成纤维生长因子和B27存在的无血清培养基中培养扩增,机械分离法传代,观察细胞生长状况.②将传至第2代的神经球以20～30个/cm2接种于置有预先经左旋多聚赖氨酸包被盖玻片的24孔培养板中,加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM/F12(不加任何生长因子)诱导分化.③采用免疫细胞化学染色方法鉴定神经干细胞及其传代细胞的分化方向.结果:①孕12～13 d的鼠胚中脑细胞体外培养36 h后,可见2～5个细胞的团块;48 h后有明显球状团块产生,胞间界限不很清楚,出现神经细胞球;培养6 d后传代,少部分单细胞于传代2 d后出现分裂相,随后渐形成细胞团及神经球,生长性状基本同原代.②将培养的神经细胞球转入有血清培养时,约1周球体可完全分化为神经细胞和胶质细胞.免疫荧光染色显示神经球细胞表达巢蛋白,且神经元特异性烯醇化酶染色和胶质纤维酸性蛋白染色均呈阳性.结论:孕12～13 d鼠胚胎腹侧中脑区存在神经干细胞,这些细胞在B27和碱性成纤维生长因子存在的无血清培养基中能够成功的在体外培养和传代.
作者：刘立；彭超华；梁鹏；戴冀斌 刊期： 2007年第24期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
