张立贵；王传富；黄晓辉
对本院门诊及住院复发性翼状胬肉患者36例(45眼)行翼状胬肉切除加角膜缘干细胞移植术,并对患者术后疗效进行随访观察.结果随访6个月至3年,仅3例复发,占6.67%,复发率较传统手术方法明显降低,并具有术后创面愈合快、刺激症状轻、并发症少等优点.说明角膜缘干细胞移植术治疗复发性翼状胬肉疗效可靠,可以明显降低手术复发率,适合临床应用.
作者：许和；王丽华；李晓慧；候丽萍 刊期： 2007年第24期
目的:观察对比野生型小鼠和成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体突变型小鼠骨髓基质细胞体外培养的生长情况以及成骨潜能,探讨成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体功能持续增强对小鼠骨髓基质细胞发育的影响.方法:实验于2005-09/2006-02在解放军第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所创伤中心实验室,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成.①实验动物:将雄性成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体S252W突变小鼠(由陈林教授在美国国立卫生研究院建立后引入本实验室)和雌性C57BL/6J小鼠(由解放军第三军医大学大坪医院实验动物中心提供)交配,经过基因型鉴定的雄性F1代8周龄小鼠按照基因型分为野生型组和突变型组,12只/组.②实验方法:将两组小鼠脱臼处死后分离胫、股骨,用DMEM培养液冲出骨髓,离心后弃上清,加入DMEM低糖培养液制成细胞悬液,贴壁法分离培养骨髓基质细胞,以1×108 L-1密度传代.③实验评估:倒置相差显微镜下观察细胞形态及贴壁生长情况.采用MTT法检测两组骨髓基质细胞的增殖情况.检测体外成骨诱导条件下两组骨髓基质细胞的碱性磷酸酶活性.采用Van kossa染色检测体外成骨诱导条件下两组骨髓基质细胞的钙结节形成能力.结果:①形态学观察:倒置相差显微镜下两组骨髓基质细胞形态变化相似.第3代骨髓基质细胞在体外诱导成骨条件下增殖速度明显减慢,多数细胞由梭形变成长方形,并逐渐成为立方形,细胞体积增大.②生长曲线:野生型组骨髓基质细胞的吸光度值在接种后2 d内变化不大,细胞处于潜伏期,第4天显著增加,第6天达高峰,进入平台期.与野生型组比较,突变型组骨髓基质细胞生长曲线出现右移和平台期滞后.③碱性磷酸酶活性:在体外诱导成骨条件下,野生型组骨髓基质细胞随培养时间延长碱性磷酸酶活性逐渐上升,第9～15天达高峰,然后随细胞老化而下降.与野生型组相比较,突变型组骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性增高出现滞后现象,并且其高峰数值显著低于野生型组(P＜0.05).④钙结节形成:经过21 d的成骨诱导培养,野生型组骨髓基质细胞可见较多的钙结节形成,突变型组有分散的钙结节形成,但较细小.结论:成纤维细胞生长因子及其受体信号对细胞发育的调控效应是复杂多面的,持续的成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体功能增强可能引起体外培养的小鼠骨髓基质细胞增生减缓,并可能阻抑其向成骨细胞的分化.
作者：尹良军；杜晓兰；刘志君；鲁秀敏；张宜华；杨京；赵玲；陈林 刊期： 2007年第24期
背景:外周血单核细胞预激活是动脉粥样硬化形成的重要早期事件和促进因素之一,丹参酮是从传统中药丹参中提取的一种脂溶性成分,具有确切的抗动脉粥样硬化作用.目的:通过检测外周血单核细胞的黏附活性与分泌活性,分析原发性高血压患者病程早期是否存在外周血单核细胞预激活,并探讨丹参酮对体外培养条件下外周血单核细胞激活的抑制作用.设计:病例对照分析.单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊科与中医药研究室.对象:选取2003-01/2004-10华中科技大学同济医学院附属同济医院心血管内科收治的未经治疗或已停用降压药物2周以上的原发性高血压患者30例,男16例,女14例;平均年龄(44.6±7.4)岁;体质量指数(26.2±4.5) kg/m2;平均病程(38.5±16.9)个月;对本实验均知情同意.根据1999年WHO/ISH的高血压诊断标准,均为高血压Ⅰ～Ⅱ级.排除继发性高血压、器质性心脏病、高脂血症、糖尿病、肝肾功能障碍、感染等临床情况以及高血压所致的心、脑、肾、血管等靶器官损害.另选择30例血压正常的健康体检者作为正常对照组.人脐静脉内皮细胞(武汉大学物种保存中心);丹参酮注射液(雅安三九药业有限公司,批号020724).方法:①入选者均抽取静脉血4.0～5.0 mL,采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法和塑料吸附法分离单个核细胞,37 ℃孵育40～60 min后收集贴壁细胞即为外周血单核细胞.瑞氏染色后镜下观察细胞形态符合单核细胞特征,锥虫蓝拒染试验测定活细胞数＞95%.将新鲜分离的外周血单核细胞重悬,按4×107 L-1接种到24孔培养板上,每份标本设3孔:第1孔为基础分泌孔,第2孔为血管紧张素Ⅱ刺激孔,第3孔为丹参酮预处理孔.在血管紧张素Ⅱ刺激前先将外周血单核细胞与丹参酮共同孵育30 min.血管紧张素Ⅱ、丹参酮终浓度分别为1×10-8 mol/L和1×10-8 g/L,外周血单核细胞终浓度为2×107 L-1.37 ℃下置于体积分数为0.05的CO2培养箱内24 h,分别收集培养上清和细胞成分.②制备外周血单核细胞悬液,密度调整至2.5×109 L-1.在24孔培养板上用含体积分数为0.1小牛血清的M199培养基培养人脐静脉内皮细胞,待细胞生长至对数增长期后,铺板汇成单层,每孔加入100 μL外周血单核细胞悬液,37 ℃下分别孵育2,4 h,去除未黏附细胞,戊二醛固定后计数黏附细胞,高倍镜下每孔计数40个视野,取其平均值.③采用双抗体夹心ELISA法和反转录-聚合酶链技术检测外周血单核细胞培养上清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6的浓度及其mRNA的表达水平.主要观察指标:①外周血单核细胞黏附活性的变化.②外周血单核细胞培养上清中细胞因子浓度及其mRNA的表达.结果:①孵育2,4 h时外周血单核细胞与内皮细胞的黏附数,在基础状态下高血压组和正常对照组基本相似(t=1.153～1.577,P均＞0.05);血管紧张素Ⅱ刺激后高血压组明显多于正常对照组(t=3.842～4.536,P均＜0.01);丹参酮预处理后两组又降至同一水平(f=0.855～1.702,P均＞0.05).②基础状态时,两组培养上清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6的浓度均较低(t=0.981～1.829,P均＞0.05);血管紧张素Ⅱ刺激后,高血压组各细胞因子浓度均明显高于正常对照组(t=2.442～5.075,P＜0.01,0.01,0.05);丹参酮预处理后两组各细胞因子浓度均有不同程度降低,但差异无显著性意义(f=1.227～1.940,P均＞0.05).两组外周血单核细胞中各细胞因子mRNA的表达与浓度变化基本相似.结论:①基础状态下原发性高血压患者外周血单核细胞与内皮细胞的黏附数及各炎性细胞因子浓度和mRNA表达处于正常人群水平,经血管紧张素Ⅱ刺激后显著升高,提示原发性高血压患者病程早期外周血单核细胞处于预激活状态.②丹参酮干预可使原发性高血压患者外周血单核细胞的黏附活性与分泌活性降至正常水平,证明丹参酮能够抑制预激活的外周血单核细胞进一步激活,一定程度上可防止动脉粥样硬化的发生.
作者：占成业；陶秀良；周代星；郑智 刊期： 2007年第24期
背景:一些研究提示,胎盘可以作为一种新的间充质干细胞来源.胎盘组织中分离出的贴壁细胞与骨髓间充质干细胞有相似形态和细胞表面标志,具有分化为成骨细胞以及神经细胞的能力.目的:探索一种新的获取间充质干细胞的来源及方法.设计:观察性实验.单位:无锡市第三人民医院.材料:胎盘(我院妇产科剖腹产手术中胎盘,经家属同意并经院伦理委员会通过签署知情同意书).培养基;sABC试剂盒、DAB显色试剂盒;羊抗鼠-FITC;重组人碱性成纤维细胞生长因子;兔抗人神经元特异性烯醇化酶;兔抗人胶质纤维酸性蛋白.方法:实验于2005-05/2006-08在无锡第三人民医院细胞与分子生物学研究室完成.消化胎盘实体组织,贴壁培养细胞,观测形态,绘制出各代PDMCs的生长曲线.取原代培养细胞1和7 d时的上清液,用化学发光法测定β-HCG含量.检测细胞表面抗原表达以及分化潜能.培养细胞在诱导分化24 h(神经细胞),2周(成骨细胞)后采用常规方法免疫细胞化学染色.显色后在常规显微镜或荧光显微镜下观察.主要观察指标:①形态学以及生长曲线的观察;②多分化潜能细胞培养上清液β-HCG测定、流式细胞仪检测多分化潜能细胞抗原表达;③多分化潜能细胞诱导分化和诱导分化后细胞免疫组织化学分析.结果:①多分化潜能细胞的原代培养情况:胎盘组织消化后获得细胞中仅有少量的贴壁细胞,经两周后逐渐形成扁平单层细胞,呈漩涡状生长或成簇生长,随着细胞密度的增加,胞体变得细长,形态类似成纤维细胞.②多分化潜能细胞的生长曲线分析结果:细胞在接种后的2～8 d为生长的潜伏期,细胞逐渐开始出现贴壁,无明显扩增;8 d以后细胞进入对数生长期,此时细胞增殖活跃,相差显微镜下观察细胞突起向周围伸展,出现两个核细胞分裂相的间充质干细胞多见,细胞密度增大,彼此相连;11～14 d,生长曲线逐渐进入平台期,MSCs铺满瓶底,细胞扩增趋缓,原代培养结束.③β-HCG测定结果:两个时间点培养上清液中均未检测到β-HCG表达.④多分化潜能细胞的表面抗原特性:多分化潜能细胞表达CD29,CD44和CD105,不表达CD34,CD45,CD19和CD106.⑤多分化潜能细胞的诱导分化结果:向神经细胞诱导24 h后,细胞形态明显改变,胞体回缩,胞核部分折光性增强,出现类似于树突及轴突样结构,染色可见神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性.结论:胎盘组织中含有的多分化潜能细胞与骨髓间充质干细胞形态功能相似,胎盘可以作为获取间充质干细胞的一种有效来源.
作者：王玲；徐秋岚；苗宗宁；祝建中；黄伟 刊期： 2007年第24期
目的:观察成人外周血来源的单个核细胞在体外培养过程中形态、增殖能力和表面抗原的变化.方法:实验于2006-08/2007-02在广州南方医院完成.①实验材料:健康志愿者肘静脉血20份,年龄20～26岁,对本实验均知情同意.②实验方法:密度梯度离心健康成人肘静脉血得到单个核细胞,以(2～3)×106/cm2的密度接种于人纤维连接蛋白包被的6孔板,在含有人血管内皮细胞生长因子的M199培养基中进行培养,第4天首次换液,后每3 d换液一次.③实验评估:第3天起观察细胞的形态及数量,分别对培养至第7,21天的贴壁细胞行流式细胞学分析及免疫组化染色检查.结果:①培养细胞的形态学观察:外周血来源单个核细胞接种后约有1/20贴壁,第4天左右可形成从中心向外放射的典型细胞集落,第7天有大量长梭形、双极针样细胞生长.培养第2周长梭形细胞开始凋亡,数量减少,同时出现大量椭圆形鹅卵石样细胞.至第3周鹅卵石样细胞己占据生长优势且增殖旺盛,长梭形细胞基本消失.②内皮祖细胞表面标志的变化:原代培养第7天,贴壁细胞表达与单核巨噬细胞系相关的表面抗原CD44(96.3%)、CD45(83.9%)、CD11c(63.7%)、CD14(11.9%),弱表达内皮细胞相关抗原flk-1(18.2%)、CD31(6.7%)、vWF(3.6%);第21天CD44表达下降至57.6%,而内皮细胞相关抗原CD31表达增加至67.2%,vWF增加至14.2%;造血干细胞相关抗原CD34始终呈阴性表达.免疫组化染色结果与流式细胞分析结果一致.结论:成人外周血中存在两种不同类型的血管内皮前体细胞,单个核细胞贴壁培养4～7 d左右出现早期内皮祖细胞,2～3周时出现晚期内皮祖细胞.二者的外形、增殖潜能、表面抗原表达均不同.晚期内皮祖细胞是更好的种子细胞来源.
作者：李华；高建华；颜玲；鲁峰；朱茗 刊期： 2007年第24期
目的:比较脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖的抑制作用.方法:实验于2005-07/2006-03在南昌大学第二附属医院血液病研究所及江西省医学分子重点实验室完成.①实验材料:脐带血9份,由南昌大学第二附属医院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意.正常骨髓9份,由南昌大学第二附属医院血液科门诊及住院患者提供,均附有捐赠同意书.外周血9份,取自正常自愿者.本实验经医学伦理委员会批准.②实验方法:无菌条件下采集脐血、骨髓和正常人外周血,分离单个核细胞.脐血及骨髓单个核细胞以1×109 L-1接种于培养瓶中,加入含体积分数为0.1的小牛血清、1×10-3 mol/L氢化可的松的IMDM培养液,7 d后换液,去除悬浮细胞,以后每3～4 d换液1次,待细胞90%融合后,胰蛋白酶+乙二胺四乙酸混合消化,传代培养,取第3代细胞用于实验.正常人外周血单个核细胞以1×109 L-1接种于培养瓶中,加入含体积分数为0.1的小牛血清、10 mg/L植物血凝素的IMDM液,培养3 d后收集细胞用于实验.③实验评估:采用流式细胞术检测脐血间充质干细胞及淋巴细胞表面分子.取第3代的脐血和骨髓间充质干细胞,体外诱导培养后以脂肪染色液鉴定其向脂肪细胞的分化情况.将不同细胞浓度的脐血和骨髓间充质干细胞分别加入到植物血凝素诱导的外周血淋巴细胞增殖体系中,比较两种不同来源的间充质干细胞对淋巴细胞增殖的调控作用.结果:①脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的培养及鉴定:第3代脐血间充质干细胞表面分子标记率CD29为85.18%,CD166为72.52%,CD54为33.70%,CD45为6.70%,CD13为1.51%,CD34为0.23%.正常人外周血单个核细胞中的CD3+T细胞为60%～70%,CD20+B细胞为3.5%～4.5%.脐血间充质干细胞诱导培养3周,可见呈桔黄色的脂肪细胞.②脐血间充质干细胞及骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制:淋巴细胞:间充质干细胞为1∶1,1∶0.5,1∶0.1,1∶0.05,1∶0.02,1∶0.01时,脐血间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制率分别为(49.5±4.8)%,(58.4±6.0)%,(38.1±4.0)%,(31.4±3.2)%,(24.3±3.2)%,(12.6±6.7)%,而骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制率分别为(52.4±8.4)%,(65.1±9.7)%,(34.7±4.5)%,(13.0±6.4)%,(-10.7±12.6)%,(-43.9±9.4)%.后3种细胞浓度比例脐血间充质干细胞对淋巴细胞的抑制作用明显强于骨髓间充质干细胞(t=7.72,8.14,14.68,P均＜0.05).结论:脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞一样,也具有抑制植物血凝素诱导淋巴细胞增殖的作用,抑制效果与间充质干细胞数量有关.低浓度的脐血间充质干细胞对淋巴细胞的抑制作用明显强于骨髓间充质干细胞.
作者：贺文凤；石庆之；华建媛；李剑；李洁；吴琼 刊期： 2007年第24期
目的:用药物预适应方法进行干细胞诱导已有报道,本实验观察中药参三七皂苷Rg1对5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞转化中的作用.方法:实验于2003-01/05在南京医科大学药理教研室完成.①实验材料:清洁级SD大鼠8只.参三七皂苷Rg18 mg,批号20021017,由云南省长春花生物制剂公司提供,加入不含胎牛血清的IMDM培养液10 mL,调配成10-4 mol/L溶液,4 ℃保存.5-氮胞苷(Sigma公司,批号021209).②实验方法:贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞.设立4组:空白对照组常规培养后进行无血清处理,每3 d换液1次;5-氮胞苷单用组单纯以10μmol/L的5-氮胞苷进行处理,其终浓度为1×10-8 moL/L,连续诱导15 d;5-氮胞苷+参三七皂苷Rg1预适应组分别加入0.1,1 μmol/L参三七皂苷Rg1培养液处理24 h,再各以10 μmol/L的5-氮胞苷进行诱导,其终浓度为1×10-8 moL/L,连续诱导15 d.③实验评估:取第2代骨髓间充质干细胞,绘制生长曲线并计算群体倍增时间.观察诱导后骨髓间充质干细胞的生长形态学特征和细胞超微结构变化.激光共聚焦显微镜测定细胞表面积变化和细胞内钙离子浓度.结果:①5-氮胞苷诱导后骨髓间充质干细胞的生长形态学特征和细胞超微结构变化:骨髓间质干细胞胞体逐渐增大并伸出细长突起,在突起末端出现分支,部分相邻细胞的突起连接成网,形态学上表现出向心肌细胞方向转化的特征.其超微结构呈梭形,有明显的肌丝,细胞核呈单椭圆形,位于细胞中央,间质干细胞形似心肌细胞.②参三七皂苷Rg1预适应对5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞增殖特性的影响:与5-氮胞苷单用组比较,5-氮胞苷+参三七皂苷Rg1预适应组从第3天开始细胞数明显增加,细胞生长曲线均无明显的生长平台期,达到高峰后细胞数开始减少.③参三七皂苷Rg1预适应对5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞表面积的影响:与空白对照组骨髓间充质干细胞表面积比较,5-氮胞苷单用组明显降低,0.1,1 μmol/L参三七皂苷Rg1预适应则能显著升高5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞表面积(P＜0.01).④参三七皂苷Rg1对5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞内游离钙水平的影响:与空白对照组比较,5-氮胞苷诱导4周后骨髓间充质干细胞内游离Ca2+相对荧光强度均明显升高(t=6.72,P＜0.01),且5-氮胞苷+1 μmol/L参三七皂苷Rg1预适应组升高幅度大于5-氮胞苷单用组(t=3.13,P＜0.05).结论:①参三七皂苷Rg1预适应在体外可显著刺激5-氮胞苷诱导的鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞转化和增殖,改善细胞形态,刺激细胞内钙离子增加.②参三七皂苷Rg1与5-氮胞苷对骨髓间充质干细胞向心肌细胞定向分化产生协同效应.
作者：宋清；张晓文；卢新政；侯麦花；王索安 刊期： 2007年第24期
目的:评价亲缘异基因造血干细胞移植与酪氨酸激酶抑制剂STI571治疗非慢性期慢性粒细胞白血病的有效性及安全性.方法:①对象:所有患者在治疗前均经骨髓细胞学、细胞遗传学和/或分子遗传学检查确诊为加速或急变期慢性粒细胞白血病.实验经医学伦理委员会批准,患者均知情同意.STI571治疗组23例患者,男13例,女10例,平均年龄32岁,2002-04/2006-06陆续开始应用STI571,观察截止时间为2006-10,平均用药17.5个月.造血干细胞移植组7例患者,1999-07/2006-04收治,男6例,女1例,平均年龄35.4岁;健康亲缘性异基因造血干细胞供者7例,均与受者经HLA配型证实为全相合.②STI571治疗:23例患者每日口服STI571 600 mg,此过程未给予其他治疗慢性粒细胞白血病的药物.出现以下任一情况药量增至800 mg:治疗3个月仍未达到血液学完全缓解;达到血液学缓解后复发;达到主要遗传学缓解后复发.出现以下任一情况给予停药或减量:中性粒细胞＜1×109 L-1或血小板＜50×109 L-1;出现≥Ⅱ级非血液学不良反应.每周复查血常规,根据血象和骨髓象凋整剂量,每3个月进行骨髓象及细胞遗传学检查.③干细胞移植的相关干预方案:7例患者均采用经典/改良BuCy2方案进行预处理,再给予短程甲氨蝶呤联合环孢菌素A方案预防移植物抗宿主病,其中部分患者加用抗淋巴细胞球蛋白预防移植物抗宿主病.环孢菌素A于移植前1 d以10 mg/(kg·d)分2次口服,并逐渐调整其血浓度至200～400 μg/L;移植后1 d静脉注射甲氨蝶呤15 mg/m2,移植后3,6,11 d静脉注射甲氨蝶呤10 mg/m2.④有效性评估:包括血液学效应(血液学完全缓解、部分缓解、未缓解)、血液学复发及疾病进展、细胞遗传学反应(根据Ph+细胞所占比例分为完全缓解、大部分缓解、小部分缓解、微缓解、不缓解、主要遗传学反应、遗传学复发).⑤安全性评估:按WHO不良反应分度标准分为0～4度.结果:30例患者均进入结果分析.①血液学和细胞遗传学效应:STI571治疗组23例患者均可评价血液学和细胞遗传学效应,12例(52.2%)保持血液学完全缓解,5例(21.7%)发生主要遗传学效应,其中4例(17.4%)为遗传学完全缓解.造血干细胞移植组7例患者于移植后3～6个月均可评价血液学和细胞遗传学效应,且获得血液学和细胞遗传学完全缓解,与STI571治疗组比较差异有显著性意义(P＜0.05).②两组患者的生存情况:两组患者的总体存活率行Kaplan-Meier法比较,差异无显著性意义(x2=0.04,P=0.85).③不良事件与副反应:STI571治疗组在治疗期间,没有患者因药物不良副作用而停药、死亡,7例(30.4%)患者发生Ⅲ/Ⅳ级白细胞和/或血小板减少.造血干细胞移植组2例(28.6%)发生Ⅲ～Ⅳ度急性移植物抗宿主病,3例(42.9%)发生慢性移植物抗宿主病,给予相应治疗后3例无效死亡;移植60 d内发生细菌或真菌感染4例,监测出巨细胞病毒血症2例,经治疗后均得到控制;2例患者发生出血性膀胱炎,经治疗后病情缓解.结论:亲缘异基因造血干细胞移植后血液学完全缓解率、细胞遗传学完全缓解率显著优于STI571治疗,但两种方法终的患者生存率基本相似.
作者：黎纬明；夏凌辉；游泳；刘新月；仲照东；邹萍 刊期： 2007年第24期
外周血造血干细胞移植已越来越多的应用于临床,在干细胞移植治疗过程中,动员和采集足够的造血干细胞是移植成功的关键.重组人粒细胞集落刺激因子是当前外周血造血干细胞动员的主要方法.
作者：吴金艳 刊期： 2007年第24期
目的:采用客观的电生理检查手段评价胚胎嗅鞘细胞移植治疗晚期脊髓损伤的有效性.方法:①对象:选择2003-02/2005-01北京市西山医院暨北京康复中心神经外科收治的接受人胚胎嗅鞘细胞移植治疗的晚期完全性脊髓损伤患者199例,男164例,女35例,平均年龄(34.7±11.3)岁,平均病程(4.7±5.5)年;受伤节段:颈段99例,胸段89例,胸腰段11例;受伤原因:车祸、摔伤、医源性损伤、机器挤压伤等.4个月流产胚胎由北京市虹天济神经科学研究院协作医院提供,产妇及其家属均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②方法:取人胚胎嗅球,消化成单个嗅鞘细胞后培养2周.199例晚期完全性脊髓损伤患者均接受人胚胎嗅鞘细胞移植治疗,在全麻下行脊髓损伤节段后方入路,切开硬膜,显露出病变脊髓.分上下两点各注入50 μL嗅鞘细胞悬液,细胞数共约1×106个.术后给予止血、抗感染等处理,未使用任何免疫抑制剂.③评估:移植前后分别采用肌电/诱发电位仪检查肌电图和椎旁躯体感觉诱发电位,每例患者检查2次,时间一致,且由同一医生操作.肌电图即检查患者大力收缩时的肌肉情况,以观察运动单位电位的数量、波幅及持续放电能力.椎旁躯体感觉诱发电位是于中线旁开2 cm处两侧同时给予刺激,刺激强度以引起可见的肌肉抽动为准,在头皮上记录电位.方波刺激频率3 Hz,强度20～40 mA,时限0.2 ms,观察感觉平面下降情况.结果:199例晚期完全性脊髓损伤患者均进入结果分析.①术后肌电图检查:93例(46.7%)显示部分受累肌肉大力收缩时募集波型改善,运动单位电位数量增加;105例(52.8%)无变化,1例(0.5%)比术前差.②椎旁躯体感觉诱发电位检查:90例(45.2%)显示感觉平面下降,其中左侧平均下降(1.9±1.2)个节段,右侧平均下降(2.0±1.2)个节段;107例(53.8%)无变化,2例(1.0%)双侧感觉平面上升.结论:对于胚胎嗅鞘细胞移植治疗晚期脊髓损伤患者,肌电图和椎旁躯体感觉诱发电位这两种电生理检查能较为客观的反映脊髓术后感觉和运动功能恢复情况.
作者：陈琳；黄红云；王援朝；张峰；郗海涛；张健；刘彦铖 刊期： 2007年第24期
目的:克隆人血小板源性生长因子B基因于腺相关病毒载体中,以获得高感染滴度的重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒.方法:实验于2005-10/2006-11在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.①健康足月产妇胎盘组织由青岛大学医学院附属医院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意.DH5α宿主菌由青岛大学医学院附属医院中心实验室制备保存.②Trizol试剂提取健康足月产妇胎盘组织总RNA,反转录-聚合酶链反应一步法克隆人血小板源性生长因子B基因全长开放读框.聚合酶链反应产物定向克隆于腺相关病毒载体,重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体进行双酶切和测序鉴定.③采用磷酸钙转染法将重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体、腺相关病毒包装载体,腺相关病毒辅助载体共转染腺相关病毒293细胞,包装得到重组腺相关病毒并回收病毒原液,显微镜下观察细胞及培养基的变化.④以携带β-半乳糖苷酶基因的腺相关病毒作为报告基因同重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体一样共转染相关病毒293细胞,对报告基因行X-Gal染色,通过蓝染的细胞计算病毒滴度.结果:①重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体酶切鉴定及序列分析:聚合酶链反应产物经电泳证明大小正确,重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体酶经双酶切和测序鉴定证实将血小板源性生长因子B基因正确插入.②腺相关病毒293细胞转染过程中病毒颗粒的产生:腺相关病毒293细胞转染6 h后培养基底部出现无数小黑色颗粒,为加入的转染复合物颗粒.24 h后腺相关病毒293细胞部分变圆,随着病毒增殖,细胞成串浮起,出现细胞病理效应.48 h后细胞变形,逐渐从壁上脱落.72 h后培养基的颜色从红色变化为橙色或黄色.③病毒滴度检测:通过携带β-半乳糖苷酶基因的腺相关病毒感染细胞后X-gal染色计数,测定重组腺相关病毒滴度为1×1010 L-1.结论:成功构建表达人血小板源性生长因子B基因的重组腺相关病毒载体,为进一步研究血小板源性生长因子B基因治疗角膜病和相关细胞系与组织的增殖提供实验基础.
作者：刘相萍；罗文娟；隋爱华；杨堃；吕振华；王传富 刊期： 2007年第24期
目的:观察胰岛素生长因子对骨髓基质细胞向成骨细胞分化的调节作用.方法:实验于2005-11/2006-04在广东医学院附院中心实验室进行.①实验材料:重组胰岛素生长因子(GIBCO),DEME培养基(GIBCO),胰蛋白酶(GIBCO),胎牛血清(杭州四季青),二甲基亚砜(sigma),四甲基偶氮噻唑盐(sigma),碱性磷酸酶试剂盒(长城临床试剂公司),骨钙素试剂盒(天津九鼎).SD大鼠由广东医学院动物部提供.②实验方法:骨髓基质细胞的分离:将SD大鼠处死后,无菌条件下取出动物的双侧股骨和胫骨,分离培养骨髓基质细胞.骨髓基质细胞成骨诱导条件:取第2代骨髓基质细胞,用含体积分数为0.1胎牛血清、50 mg/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、10-8 mol/L地塞米松、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素成骨诱导培养液培养,置37 ℃、体积分数为0.05 CO2饱和湿度培养箱内孵育.倒置显微镜观察细胞生长状况.③实验分组:将第3代骨髓基质细胞随机分为对照组和实验组.细胞增殖实验:取第3代生长良好的骨髓基质细胞,密度调整至4×106 L-1.实验组加入含1,10,20 μg/L胰岛素生长因子诱导培养液,对照组加不含胰岛素生长因子诱导培养液.培养1,3,5,7 d后采用MTT法检测细胞增殖水平.用碱性磷酸酶试剂盒在全自动生化分析仪上测定细胞内碱性磷酸酶活性.④实验评估:采用RI测定上清液中骨钙素含量.观察胰岛素生长因子对骨髓基质细胞增殖和向成骨细胞方向分化的调节作用.结果:①MTT法测骨髓基质细胞增殖情况:与对照组相比,实验组具有明显促进骨髓基质细胞增殖作用(吸光度值:1 d,0.442±0.002,0.498±0.009,0.546±0.004,0.553±0.005;3 d,0.571±0.008,0.604±0.007,0.682±0.006,0.694±0.009;5 d,0.623±0.003,0.659±0.004,0.793±0.008,0.807±0.007;7 d,0.792±0.008,0.810+0.006,0.912±0.003,0.923±0.004,P＜0.05).20 μg/L胰岛素生长因子与10 μg/L胰岛素生长因子组的作用效果差异无显著性意义(P＞0.05).实验组随时间延长,对骨髓基质细胞均有明显促进作用.②骨髓基质细胞内碱性磷酸酶、骨钙素合成的变化:实验组细胞胞浆内碱性磷酸酶明显高于对照组,差异有显著性意义(t=3.08,P＜0.05).实验组细胞胞浆内骨钙素明显升高,是对照组的1.8倍,差异有显著性意义(t=2.82,P＜0.05).结论:适当质量浓度胰岛素生长因子能促进经诱导分化骨髓基质细胞的增殖和向成骨细胞方向的分化.
作者：魏波；陈日景 刊期： 2007年第24期
目的:观察阳离子脂质体Lipofectamine介导的蛋白激酶Cγ AsODN对原代培养大鼠脑神经元蛋白激酶Cγ mRNA表达及生长的影响.方法:实验于2004-03/08在华中科技大学同济医学院附属同济医院完成.①实验分组:取新生50只SD乳鼠大脑皮质及海马神经元进行原代培养,分为正常对照组,空脂质体转染组,300 nmol/L Lipofectamine-SODN转染组,100 nmol/LLipofectamine-AsODN转染组,300 nmol/L Lipofectamine-AsODN转染组,每组10瓶.②实验方法:培养第4～5天采用脂质体或脂质体包裹的不同浓度的AsODN或SODN蛋白激酶Cγ转染培养神经元.③实验评估:采用倒置显微镜对神经元的生长进行动态观察;免疫组化ABC法进行蛋白激酶Cγ阳性神经元的鉴定;MTT法检测神经元的增殖率;RT-PCR方法检测转染后神经元的蛋白激酶Cγ mRNA的表达变化.结果:①蛋白激酶Cγ阳性神经元呈胞浆内棕褐色染色,胞核不显色.②蛋白激酶Cγ AsODN转染早期呈现促进神经元突起生长,胞体分化的作用.随着反义浓度增加,相对生长指数值升高.而在转染晚期,ASODN蛋白激酶Cγ转染组凋亡率均明显增加.③AsODN蛋白激酶Cγ可降低神经元蛋白激酶Cγ mRNA的表达.结论:蛋白激酶Cγ AsODN可减少神经元蛋白激酶Cγ mRNA的表达,并刺激皮质及海马神经元的增殖及神经突起的生长,这可能与蛋白激酶Cγ对神经元的生长起负性调控作用有关.
作者：万丽；罗爱林；田玉科 刊期： 2007年第24期
目的:观察急性髓性白血病经混合造血干细胞移植后,应用供者淋巴细胞输注+白细胞介素2治疗的效果,并与移植后未经特殊治疗的效果进行比较.方法:①选取2000-01/2004-07解放军兰州军区兰州总医院全军血液病中心收治的19例急性髓性白血病患者,实验经医院伦理委员会批准,患者均知情同意.随机数字表法分为两组:观察组8例,年龄17～40岁,M2a 4例,M4 1例,M5a 3例;对照组11例,年龄19～39岁,M2a 2例,M3a 2例,M4 3例,M5a 4例.②两组患者采用化疗联合重组人粒细胞集落刺激因子的方法动员自体外周血造血干细胞,采集后液氮中保存5 d备用.③术前采用直线加速器对患者全身及肺部照射,预处理完毕后实施混合造血干细胞移植.首先回输自体单个核细胞中位数为4×108/kg,CD34+细胞中位数为6.2×106/kg,粒-巨噬祖细胞集落形成单位中位数为5.8×104/kg.间隔1～6 h后,采集人类白细胞抗原半相合异体骨髓,按回输自体单个核细胞数的1/6～1/10输注给患者.④两组患者移植期间均住无菌层流病房,给予相应并发症的防治及支持治疗.在粒细胞降至0时注射重组人粒细胞集落刺激因子150 μg/12 h,促进造血恢复.观察组给予供者淋巴细胞输注+白细胞介素2治疗,每次采集的供者淋巴细胞中,CD3+淋巴细胞中位数为1.43×108/kg,CD4+细胞中位数为0.97×108/kg,CD8+细胞中位数为0.41×108/kg,中位治疗次数4(1～7)次,回输后即开始应用100 wu/d重组人白细胞介素2,共10 d.对照组混合造血干细胞移植后未给予特殊治疗.结果:19例急性髓性白血病患者均进入结果分析.①造血恢复:两组患者均获得造血重建,术后4～9 d粒细胞均降至0,12～17 d粒细胞达0.5×109 L-1,16～21 d白细胞达4.0×108 L-1,19～23 d血小板达20×108 L-1.16～21 d骨髓检查示恢复期骨髓象.②术后并发症:两组患者不同程度地出现口腔溃疡,随着造血恢复,7～10 d溃疡消失.观察组1例患者出现出血性膀胱炎,两组各2例患者出现发热.无肝静脉闭塞病和移植物抗宿主病发生.③嵌合体形成:观察组中1例M4患者形成嵌合体,对照组中2例M4患者与1例M5患者形成嵌合体,嵌合体持续存在3～12个月.④供者淋巴细胞输注+白细胞介素2疗效:观察组中有1例M2a患者在接受2次特殊治疗后7个月复发死亡;1例M2a患者接受2次特殊治疗后1年出现骨髓增生异常综合征,脑出血死亡,1例M5a患者应用特殊治疗1次后出现不明原因高热、抽搐,死于癫痫持续状态,其余5例患者随访2年均健康存活,长期生存率为62.5%(5/8).对照组有2例M2a患者、2例M4患者、1例M5患者于移植后1～7个月复发死亡,1例M3患者于移植后25 d死于脑出血,其余2例M3患者、2例M4患者、1例M5患者随访2年均健康存活,长期生存率为45.4%(5/11).结论:混合造血干细胞移植后应用供者淋巴细胞输注+白细胞介素2治疗,急性髓性白血病患者均获得造血重建且无移植物抗宿主病发生,其长期生存率有效提高.
作者：王存邦；白海；欧英贤；潘耀柱；张茜；葸瑞 刊期： 2007年第24期
目的:对比观察骨髓间充质干细胞移植前后脑梗死大鼠脑电图的变化.方法:实验于2002-09/12在解放军第三军医大学中心实验室及西南医院神经内科肌电图室完成.①实验分组:选取清洁级健康成年Wistar大鼠15只,随机数字表法分为干细胞移植组、模型对照组、假手术组,5只/组.②实验方法:另取2只健康幼年Wistar大鼠用于骨髓间充质干细胞的提取,联合采用密度梯度离心及贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,选取生长良好的1～3代细胞用于移植实验.干细胞移植组、模型对照组大鼠建立大脑中动脉栓塞模型.假手术组仅分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉,不予结扎和放置线栓.造模后1周,干细胞移植组、假手术组大鼠行细胞移植,在立体定向仪定位下于脑梗死区(壳核)直接注射骨髓间充质干细胞悬液5 μL,细胞浓度1×104 μL-1,移植坐标为前囟前1.0 mm,右旁开3.0 mm,硬膜下5.0 mm.模型对照组大鼠于相同部位注射等量不含细胞的磷酸盐缓冲液.③实验评估:采用脑电图机分别于造模前、造模后1周(移植前)、细胞移植后4周对各组大鼠进行脑电图检测.结果:15只大鼠均进入结果分析.①造模前基本节律为8～11 Hz、15～30 μV的α波,间或少量θ波,双侧对称.②造模后1周,假手术组异常率为0;模型对照组20%(1/5)轻度异常,80%(4/5)中度异常;干细胞移植组20%(1/5)轻度异常,60%(3/5)中度异常,20%(1/5)重度异常.③细胞移植后4周,假手术组脑电图恢复正常;模型对照组随术后时间的延长慢波有所减少,但仍可见到δ波、棘波、棘慢波的发放,至细胞移植后4周60%(3/5)轻度异常,40%(2/5)中度异常;干细胞移植组术后局限性慢波逐渐减少,基本节律全部恢复为α波,不对称的情况明显好转,至细胞移植后4周60%(3/5)轻度异常,以病灶侧局限性θ波较多为主,另外40%(2/5)基本正常.结论:动物实验显示骨髓间充质干细胞移植对脑梗死大鼠的脑电图背景节律有改善作用,一定程度上促进了神经系统功能的恢复.
作者：桂莉；范文辉；李露斯；王惠玉；陈康宁 刊期： 2007年第24期
目的:选择合适的细胞外基质,利用脑微血管内皮细胞、细胞外基质与神经干神胞构建神经干细胞共移植体,以提高移植神经干神胞向神经元的分化率.方法:实验于2005-11/2006-10在佳木斯大学神经病研究所免疫组织化学研究实验室完成.①实验材料:同一基因背景出生2 h～7 d清洁级Wistar大鼠由哈尔滨医科大学实验动物学部提供.取出生24 h内Wistar大鼠大脑制备神经干细胞,采用免疫组织化学法和免疫荧光法做nestin染色鉴定;取出生1～7 d Wistar大鼠大脑制备脑微血管内皮细胞,采用免疫细胞化学方法鉴定.②实验方法:不同细胞外基质的筛选:将多聚赖氨酸、层黏连蛋白和Matrigel分别与神经干细胞和脑微血管内皮细胞混合培养,接种于铺有盖玻片的6孔板中,并加入神经干细胞完全培养液,每3 d换半量液,7 d换全液.采用免疫组织化学观察抗微管相关蛋白阳性细胞.进行神经干细胞共移植体构建及检测.③实验评估:利用免疫荧光方法,以Ⅷ因子标记物标记脑微血管内皮细胞,用nestin标记神经干细胞,检测共移植体.结果:①神经干细胞和脑微血管内皮细胞形态学观察及鉴定:原代分离的单神经干细胞4 d增生为神经细胞球,传代后,经nestin免疫荧光染色,细胞球呈阳性;原代培养脑微血管内皮细胞6～8 d长满瓶壁,细胞呈多角形或扁平梭形,核卵圆形,Ⅷ因子相关抗原阳性.②3种细胞外基质对神经干细胞分化的影响:层黏连蛋白与两种细胞共培养,抗微管相关蛋白阳性细胞数明显高于Matrigel组和多聚赖氨酸组(P＜0.01).③共移植体活细胞镜下及免疫荧光结果所见:镜下可见共移植体细胞团不规则,神经干细胞被脑微血管内皮细胞包绕或相互连贴,脑微血管内皮细胞核大,胞体不规则,明显大于神经干细胞,神经干细胞折光性强.在200倍视野下,随机选取100个共移植体进行细胞计数,可见平均细胞数为8～15个,其中脑微血管内皮细胞数平均2.8个.免疫荧光可见红色Ⅷ因子阳性脑微血管内皮细胞包被绿色nestin阳性神经干细胞,或相互粘贴.结论:以脑微血管内皮细胞为支持细胞,用层黏连蛋白为细胞外基质可以成功构建神经干细胞共移植体.
作者：朱晓峰；齐志国；张晓梅 刊期： 2007年第24期
目的:采用不同方法对白血病HL60细胞株进行冻存和复苏,观察生物学特性改变,筛选佳冻存复苏方案.方法:实验于2006-04/06在吉林医药学院临床检验实验室(国家三级标准)进行.①HL60细胞株由中国科学院上海生物细胞研究所提供.将欲冷冻保存的HL60细胞调整到良好的生长状态(对数生长期),随机数字表法分成4组,离心收集后在含体积分数为0.1小牛血清的RPMI-1640培养基中分别加入二甲基亚砜,使其终浓度依次为50,100,150,200 g/L.冻存15 d后,每组取1支冻存管复苏并接种于细胞培养板,培养12 h后用锥虫蓝拒染法计算细胞复苏率.②选择冻存条件和冻存细胞密度相同的两支冻存管,按不同方法进行HL60细胞复苏.37 ℃水浴传统复苏法:立即将冻存管置于37 ℃水浴中,待融化后800 r/min离心5 min,吸去上清液,加入含体积分数为0.1小牛血清的RPMI-1640培养基,混匀后接种于细胞培养板,1 mL/孔,9孔/组,置于体积分数为0.05的CO2培养箱37 ℃继续培养.40 ℃溶解后再37 ℃恒温改良复苏法:将冻存细胞于40 ℃水浴中迅速溶解,转入37 ℃水浴箱,融化后离心、加培养基等操作同传统复苏法.复苏细胞培养12 h后采用锥虫蓝染色计算细胞存活率.③用无血清RPMI-1640培养基制备HL60细胞悬液,按3×107 L-1密度接种于细胞培养板中,1 mL/孔,然后分别加入体积分数为0.05,0.1,0.12,0.15,0.2的灭活小牛血清,每种血清浓度设置8个试验孔,并分别于培养12,24,36,48,60,72,84,96 h后计数每孔细胞数量,并绘制细胞生长曲线.结果:①不同浓度二甲基亚砜冻存后HL60细胞复苏率的比较:二甲基亚砜200 g/L组的细胞复苏率明显低于二甲基亚砜50,100,150 g/L组[(64.6±2.8)%,(87.0±1.4)%,(86.4±2.1)%,(85.7±2.8)%;t=25.44,P＜0.01],二甲基亚砜50,100,150 g/L组间差异无显著性意义(t=0.82～1.44,P＞0.05).②不同复苏方法HL60细胞存活率的比较:与37 ℃水浴传统复苏法比较,40 ℃溶解后再37 ℃恒温改良复苏法的细胞存活率显著升高[(69.5±1.5)%,(87.4±1.8)%,t=23.24,P＜0.01].③RPMI-1640培养基不同血清含量对HL60细胞生长情况的影响:在体积分数为0.05的血清含量培养基中,HL60细胞基本不生长,且有逐渐死亡的趋势;在体积分数为0.1的血清含量培养基中,HL60细胞生长趋势明显,但生长速度相对较慢;在体积分数为0.12,0.15,0.2的血清含量培养基中,HL60细胞生长迅速,3种血清浓度间细胞生长趋势无明显差异.结论:以50 g/L二甲基亚砜作为HL60细胞冻存保护剂、联合40 ℃溶解后再37 ℃恒温改良复苏法可使细胞保持佳生物学特性,体积分数为0.12的血清含量为HL60细胞常规培养的适浓度.
作者：侯毅鞠；袁忠海；李艳；郭素红 刊期： 2007年第24期
目的:分析人脐带血间质干细胞分离培养方法及临床应用的安全性.方法:实验于2005-04/12在河南省红十字血液中心和郑州市第二人民医院完成.实验方法:①无菌条件下将脐带血液采集到无菌采血袋内,产妇及其家属均知情同意,并经医院伦理委员会批准.随机抽查62份样本,单份采集量80～160 mL,计数有核细胞.②以1∶1体积比将Ficoll-Hypaque混合溶液加入四联袋主袋内,将四联袋与脐带血收集袋相连,再将样本血液沿袋壁缓慢加入四联袋主袋内的液面上.离心后将四联袋主袋放在分浆夹上,袋内液体自上而下分为血浆血小板层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层、多核细胞层、红细胞层5层.将血浆血小板层上2/3液体挤压入四联袋一空袋内,将剩余的血浆血小板层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层上部挤压入四联袋另一空袋内,即为富含有核细胞液体.③随机选择本院2005-04/12收治脑卒中后遗症患者10例.男9例,女1例,35～75岁,病程3个月～7年.诊断均由CT、MRI检查证实,符合第四届全国脑血管病学术会议修订的脑卒中诊断标准,患者均对治疗方案知情同意.将脐带血间充质于细胞经静脉输注入患者体内,每次输注1份,每例患者平均输注6份,每份间隔时间平均4 d.于治疗前和治疗3个月后评价患者神经功能状态、肢体运动功能及日常生活活动能力.采用脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准评估神经功能,分数越低,神经功能状态越好;采用Fugl-Meyer评估患侧肢体运动功能,分数越高,肢体运动功能越好;采用Barthel指数评估日常生活活动能力,分数越高,日常生活活动能力越高.结果:①分离的62份脐血间质干细胞,每份含有有核细胞(3.62±2.39)×109,红细胞残余量为(1.64±1.25)×109,CD34+细胞的比率为(2.31±0.93)%,CD133±的比率为(1.36±1.23)%.培养7 d后贴壁细胞为(3.27+1.85)×107,CD133+比率为(8.21±2.46)%.②患者治疗前与治疗3个月后相比,神经功能状态、肢体运动功能及日常生活活动能力评分均明显升高(治疗前:25.40±6.09,31.90±21.85,36.20±19.41;治疗后:1.90±5.09,80.9±25.00,81.10±15.93,P＜0.01).未发现免疫排斥及不良反应.结论:①利用多联袋无菌制备脐血间质干细胞分离效果良好,分离过程在密闭系统进行,单个核细胞和间质干细胞能满足临床需要,适合患者静脉输注和局部直接应用,方法简便安全可靠.②经静脉输注后,疗效确切,能明显改善脑卒中后遗症作用.
作者：李建斌；满勇；单泓；赵林娜；段艳丽 刊期： 2007年第24期
目的:为寻找采集外周血造血干细胞更合适的手段,探讨间断流动式血细胞分离机采集外周血造血干细胞的效果.方法:选择中山大学第五附属医院血液风湿科2004-2006年12例行外周血造血干细胞移植住院患者.①实验对象:供者5例,男1例,女4例,一般状况良好,与患者关系为同胞妹妹3例,同胞弟弟1例,同胞姐姐1例;患者7例,男3例,女4例,23～62岁,7例为自体移植,5例为异基因移植.血液系统疾病患者9例(非霍奇淋巴瘤3例,急性淋巴细胞白血病2例,急性髓细胞白血病2例,慢性粒细胞白血病1例,骨髓增生异常综合征1例);自身免疫性疾病3例(重型系统性红斑狼疮2例,难治复发性类风湿关节炎合并干燥综合征1例).②实验过程:每位供/患者均知情同意并签署知情同意书.对于自体患者,根据患者的疾病类型采取不同的干细胞动员化疗方案,联合化疗后7～10 d,待白细胞下降至低点,一般为≤1.0×109 L-1时,给予粒细胞集落刺激因子5 μg/kg皮下注射,白细胞升至3.0×109 L-1时开始采集;对于allo-PBSCT供者直接给予粒细胞集落刺激因子5μg/kg,皮下注射,1次/d,共5 d,同时应用流式细胞仪检测CD34+细胞数,至白细胞升至≥20.0×109 L-1或当CD34+细胞升高＞20个/μL时采用增强型多功能血细胞分离机PBSC程序卡采集健康供者和患者外周血造血干细胞.③实验评估:分析采集效率、血液学参数、不良事件发生率、以及供、受者ABO血型不合的患者回输干细胞溶血反应等情况.结果:12例供者、患者均进入结果分析.①共进行了24次采集,其中1次采集1例,2次采集7例,3次采集3例,平均循环次数(25±5)次,采集时间(228±32)min,处理血量(723 4±120 5)mL,复方枸橼酸钠溶液用量为(623±96)mL,干细胞收集量为(102±21)mL,CD34+细胞采集效率为(54.3±30.7)%,细胞计数示白细胞为(156±34)×109 L-1,单个核细胞为(79.7±13.2)×109 L-1,流式细胞仪检测CD34+细胞为(10.30±4.38)×106/kg受者体质量.②不良反应轻微,24次采集过程中出现不良反应6次均为枸橼酸盐所致低钙血症反应.血红蛋白和血小板与采集前相比分别下降9.36%和11.10%.供、受者ABO血型不合的3例患者在输注造血干细胞悬液后均未出现溶血反应.③12例均获造血功能重建,无移植相关死亡.结论:用间断流动式血细胞分离机采集外周血造血干细胞效果良好,不良反应轻微,能有效的减少被采集者红细胞、血小板的丢失,对供、受者ABO血型不合者不需去除造血干细胞悬液中的红细胞,值得临床应用.
作者：何志国；侯丽君；李碧香；徐景勃；曾林涓 刊期： 2007年第24期
目的:采用无血清培养法从人骨肉瘤细胞株U2-OS中分离肿瘤干细胞,检测肿瘤干细胞特异性标志物Stro-1的表达.方法:实验于2006-02/2007-02在兰州大学第二医院骨科研究所完成.①实验材料:人骨肉瘤细胞株U2-OS由中国科学院细胞库提供;DMEM/F12(1∶1)培养基(Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青公司);PCR引物由上海生物工程公司合成.②实验方法:取原代培养的骨肉瘤细胞经胰蛋白酶消化制备单细胞悬液,用含表皮生长因子20 μg/L、碱性成纤维细胞生长因子20 μg/L、L-谷氨酰胺2 mmol/L、胰岛素4 U/L、青霉素100 U/mL和链霉素100 U/mL,pH 7.2～7.5的无血清DMEM/F12培养基重悬细胞,常规培养5～7 d,待培养基中悬浮的肉瘤细胞球体积较大后,用无血清培养基重新吹打成单细胞悬液,按1∶2或1∶3比例传代.③实验评估:从上述骨肉瘤细胞株中分离出的肿瘤细胞球,用MTT法检测其增殖能力,免疫磁珠分选Stro-1阳性细胞,反转录-聚合酶链法检测Stro-1阳性细胞中Stro-1 mRNA的表达,免疫细胞化学染色的方法检测分化后成骨细胞特异性抗原的表达.结果:①肿瘤干细胞增殖活性:增殖潜伏期约为24 h,传代后1～2 d即可见肿瘤干细胞形成,以后体积逐渐增大.第7天吸光度值高,与0 d吸光度值比较差异有显著性意义(P＜0.01).②免疫磁珠法分选Stro-1阳性细胞:分选的Stro-1+细胞接种于无血清培养基后,24～48 h即可形成和原代肿瘤干细胞球形态一样的干细胞球,而Stro-1-细胞却不能形成肿瘤细胞球.③骨肉瘤干细胞中Stro-1 mRNA的表达:Stro-1+细胞和Stro-1-细胞mRNA扩增产物的吸光度值二者比较差异有显著性意义(P＜0.05).④肿瘤干细胞分化:分化2周的肿瘤干细胞骨形态蛋白及Ⅰ型胶原酶均呈阳性表达.结论:骨肉瘤细胞株中存在骨肉瘤干细胞,并具有自我更新和多向分化的能力.
作者：欧阳振；王栓科；康学文；王翠芳；汪静；郭洪章 刊期： 2007年第24期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
