占成业；陶秀良；周代星；郑智
胚胎干细胞的研究在细胞治疗、组织器官移植、基因治疗、药物筛选、发育生物学等领域产生极其重要的影响,然而有关胚胎干细胞的来源及胚胎克隆等研究触及到的伦理道德问题,成为胚胎干细胞研究争论的焦点.
作者：张欣 刊期： 2007年第24期
目的:应用高分辨率荧光显微成像系统采集细胞器探针图像,并与激光共聚焦显微成像系统进行对比.方法:实验于2003-05/2004-01在解放军总医院完成.①实验材料:鼠肺毛细血管内皮细胞株(1H11)由上海复旦张江生物公司提供;荧光探针Rhodamine-123,Lucifer Yellow,DiOC6[3],BODIPY(美国Sigma公司).②细胞培养及荧光探针染色:细胞培养采用含体积分数为0.2胎牛血清的低糖DMEM培养基,密度5×107 L-1.选择Rhodamine-123作为细胞线粒体特异性荧光探针,选择DiOC6[3]作为细胞内质网特异性荧光探针,选择BODIPY作为细胞高尔基体特异性荧光探针,选择Lucifer Yellow作为细胞溶酶体探针.前3个探针在完全避光条件下与培养的细胞共同孵育0.5 h,后者则共同孵育15 h.③高分辨率荧光成像系统的图像采集:线粒体荧光图像采集,选取经Rhodamine-123共孵育完成的细胞,选择激发滤色镜为BP460-490,吸收滤色镜为BA515,分光镜为DM500,另加一绿通道液晶滤光片,激发出Rhodamine-123的荧光.电荷耦合器件采集图像并送入计算机.重复上述步骤,采用DiOC6[3]标记内质网,BODIPY标记高尔基体,Lucifer Yellow标记细胞溶酶体,激发条件同Rhodamine-123.分别采集同一视野靶细胞DiOC6[3]、BODIPY或Lucifer Yellow的荧光图像,完成全部图像采集并储存在计算机中.④激光共聚焦显微成像系统的图像采集:选择经4种探针染色的靶细胞,使用氩离子激光器在488 nm激发Rhodamine-123,Rhodamine-123荧光通过配置有530/60-G发射滤光片的通道1探测.重复上述步骤,在488 nm激发DiOC6[3]和BODIPY,在457 nm激发Lucifer yellow,3种荧光均由通道1探测,后2个探针的发射滤光片的配置为515/30-G,DiOC6[3]选择530/60-G.由光电倍增管接收信号并传输入计算机成像.结果:①高分辨率荧光成像系统所采集图像,靶细胞中由荧光探针Rhodamine-123染色的线粒体呈多个典型的小棒状或卵圆状,聚集在核周;Lucifer yellow染色的溶酶体呈多个非对称球型,在胞浆内随机分布,颗粒尺寸通常大于线粒体;荧光探针DiOC6[3]着色的内质网占据胞浆的很大空间,以囊状聚集为特征;BODIPY特异性地结合在高尔基体上,荧光图像显示围绕在细胞核周围呈条索状.②与高分辨率荧光成像系统比较,激光共聚焦显微成像系统所采集的图像其荧光强度基本相同,但分辨率低、细节显示模糊、胞浆中细胞器的准确分布信息和形态特征显示效果欠佳.结论:两种荧光显微成像系统均可采集到细胞器探针的荧光图像.但高分辨率荧光成像系统采集的荧光图像具有细节清晰、分辨度高、准确显示胞浆中细胞器的分布信息和形态特征等优点.
作者：戴维德；李晓松；曾晶；刘凡光；顾瑛 刊期： 2007年第24期
目的:观察胰岛素生长因子对骨髓基质细胞向成骨细胞分化的调节作用.方法:实验于2005-11/2006-04在广东医学院附院中心实验室进行.①实验材料:重组胰岛素生长因子(GIBCO),DEME培养基(GIBCO),胰蛋白酶(GIBCO),胎牛血清(杭州四季青),二甲基亚砜(sigma),四甲基偶氮噻唑盐(sigma),碱性磷酸酶试剂盒(长城临床试剂公司),骨钙素试剂盒(天津九鼎).SD大鼠由广东医学院动物部提供.②实验方法:骨髓基质细胞的分离:将SD大鼠处死后,无菌条件下取出动物的双侧股骨和胫骨,分离培养骨髓基质细胞.骨髓基质细胞成骨诱导条件:取第2代骨髓基质细胞,用含体积分数为0.1胎牛血清、50 mg/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、10-8 mol/L地塞米松、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素成骨诱导培养液培养,置37 ℃、体积分数为0.05 CO2饱和湿度培养箱内孵育.倒置显微镜观察细胞生长状况.③实验分组:将第3代骨髓基质细胞随机分为对照组和实验组.细胞增殖实验:取第3代生长良好的骨髓基质细胞,密度调整至4×106 L-1.实验组加入含1,10,20 μg/L胰岛素生长因子诱导培养液,对照组加不含胰岛素生长因子诱导培养液.培养1,3,5,7 d后采用MTT法检测细胞增殖水平.用碱性磷酸酶试剂盒在全自动生化分析仪上测定细胞内碱性磷酸酶活性.④实验评估:采用RI测定上清液中骨钙素含量.观察胰岛素生长因子对骨髓基质细胞增殖和向成骨细胞方向分化的调节作用.结果:①MTT法测骨髓基质细胞增殖情况:与对照组相比,实验组具有明显促进骨髓基质细胞增殖作用(吸光度值:1 d,0.442±0.002,0.498±0.009,0.546±0.004,0.553±0.005;3 d,0.571±0.008,0.604±0.007,0.682±0.006,0.694±0.009;5 d,0.623±0.003,0.659±0.004,0.793±0.008,0.807±0.007;7 d,0.792±0.008,0.810+0.006,0.912±0.003,0.923±0.004,P＜0.05).20 μg/L胰岛素生长因子与10 μg/L胰岛素生长因子组的作用效果差异无显著性意义(P＞0.05).实验组随时间延长,对骨髓基质细胞均有明显促进作用.②骨髓基质细胞内碱性磷酸酶、骨钙素合成的变化:实验组细胞胞浆内碱性磷酸酶明显高于对照组,差异有显著性意义(t=3.08,P＜0.05).实验组细胞胞浆内骨钙素明显升高,是对照组的1.8倍,差异有显著性意义(t=2.82,P＜0.05).结论:适当质量浓度胰岛素生长因子能促进经诱导分化骨髓基质细胞的增殖和向成骨细胞方向的分化.
作者：魏波；陈日景 刊期： 2007年第24期
目的:观察阳离子脂质体Lipofectamine介导的蛋白激酶Cγ AsODN对原代培养大鼠脑神经元蛋白激酶Cγ mRNA表达及生长的影响.方法:实验于2004-03/08在华中科技大学同济医学院附属同济医院完成.①实验分组:取新生50只SD乳鼠大脑皮质及海马神经元进行原代培养,分为正常对照组,空脂质体转染组,300 nmol/L Lipofectamine-SODN转染组,100 nmol/LLipofectamine-AsODN转染组,300 nmol/L Lipofectamine-AsODN转染组,每组10瓶.②实验方法:培养第4～5天采用脂质体或脂质体包裹的不同浓度的AsODN或SODN蛋白激酶Cγ转染培养神经元.③实验评估:采用倒置显微镜对神经元的生长进行动态观察;免疫组化ABC法进行蛋白激酶Cγ阳性神经元的鉴定;MTT法检测神经元的增殖率;RT-PCR方法检测转染后神经元的蛋白激酶Cγ mRNA的表达变化.结果:①蛋白激酶Cγ阳性神经元呈胞浆内棕褐色染色,胞核不显色.②蛋白激酶Cγ AsODN转染早期呈现促进神经元突起生长,胞体分化的作用.随着反义浓度增加,相对生长指数值升高.而在转染晚期,ASODN蛋白激酶Cγ转染组凋亡率均明显增加.③AsODN蛋白激酶Cγ可降低神经元蛋白激酶Cγ mRNA的表达.结论:蛋白激酶Cγ AsODN可减少神经元蛋白激酶Cγ mRNA的表达,并刺激皮质及海马神经元的增殖及神经突起的生长,这可能与蛋白激酶Cγ对神经元的生长起负性调控作用有关.
作者：万丽；罗爱林；田玉科 刊期： 2007年第24期
目的:以Hs683、3T3成纤维细胞作为对照,探讨人胚胎神经干细胞在体外条件下对SHG44、C6胶质瘤细胞的趋向性.方法:①来源于怀孕子宫肌瘤切除术或流产的10～14周胚胎(西安市中心医院妇产科、西安交大二院妇产科、北方医院妇产科提供),产妇及其家属均签署知情同意书.Hs683成纤维细胞系由田晓峰博士馈赠,SHG44胶质瘤细胞系、C6胶质瘤细胞系、3T3成纤维细胞系均为本研究所冻藏.②将原代培养8 d的人胚胎神经干细胞悬液离心、收集备用,终神经球浓度达8×104 L-1.③将预先消毒的盖玻片(24 mm×24 mm)放置于培养皿内,将SHG44胶质瘤细胞系、C6胶质瘤细胞系、Hs683成纤维细胞系、3T3成纤维细胞系的4组细胞复苏后,加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养基.当各组细胞爬片上的细胞贴壁达75%～85%时,取出盖玻片,与上述制备的人胚神经球悬浮液共同培养.④将预先制备好的SHG44胶质瘤细胞、C6胶质瘤细胞、Hs683成纤维细胞、3T3成纤维细胞爬片(各10张)从培养瓶取出,置于新的培养皿,分别与神经干细胞克隆球在含体积分数为0.01～0.02胎牛血清的DMEM培养液中共培养72 h,观察并统计各细胞系每张爬片的克隆球数.上述4种细胞爬片周边3 mm以外相同面积、无胶质瘤/成纤维细胞区域作为其各自空白对照.⑤分别将神经干细胞克隆球+C6胶质瘤细胞+3T3成纤维细胞、神经干细胞克隆球+SHG44胶质瘤细胞+Hs683成纤维细胞同法共培养72 h,观察人胚神经干细胞在SHG44、Hs683、C6、3T3细胞爬片上的分布情况.结果:①人胚神经干细胞对SHG44、C6胶质瘤细胞的趋向作用:SHG44/C6胶质瘤细胞+人胚神经干细胞克隆球共培养72 h后,胶质瘤细胞爬片上的神经克隆球体积均有所增大,且数量均明显高于外周无胶质瘤细胞的空白对照区(P均＜0.05).②人胚神经干细胞对Hs683、3T3成纤维细胞的趋向作用:Hs683/3T3成纤维细胞+人胚神经干细胞克隆球共培养72 h后,成纤维细胞爬片上的神经克隆球数量与周围无成纤维细胞区基本相似(P均＞0.05).③人胚神经干细胞+SHG44/C6胶质瘤细胞+Hs683/3T3成纤维细胞共培养下的体外趋向作用:SHG44胶质瘤细胞+Hs683成纤维细胞+人胚神经干细胞共培养72 h后,SHG44胶质瘤细胞爬片上的神经球数量明显多于Hs683成纤维细胞爬片(P＜0.05).C6胶质瘤细胞+3T3成纤维细胞+人胚神经干细胞共培养72 h后,C6胶质瘤细胞爬片上的神经球数量明显多于3T3成纤维细胞爬片(P＜0.05).结论:人胚胎神经干细胞与胶质瘤细胞体外共培养后,神经球出现向胶质瘤细胞周围集聚的趋势,提示胶质瘤细胞可能分泌某种对神经干细胞有一定作用的活性因子.
作者：姬西团；章翔；费舟；张剑宁；刘卫平；蒋晓帆；宋少军；宋蕾；梁景文 刊期： 2007年第24期
目的:采用客观的电生理检查手段评价胚胎嗅鞘细胞移植治疗晚期脊髓损伤的有效性.方法:①对象:选择2003-02/2005-01北京市西山医院暨北京康复中心神经外科收治的接受人胚胎嗅鞘细胞移植治疗的晚期完全性脊髓损伤患者199例,男164例,女35例,平均年龄(34.7±11.3)岁,平均病程(4.7±5.5)年;受伤节段:颈段99例,胸段89例,胸腰段11例;受伤原因:车祸、摔伤、医源性损伤、机器挤压伤等.4个月流产胚胎由北京市虹天济神经科学研究院协作医院提供,产妇及其家属均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②方法:取人胚胎嗅球,消化成单个嗅鞘细胞后培养2周.199例晚期完全性脊髓损伤患者均接受人胚胎嗅鞘细胞移植治疗,在全麻下行脊髓损伤节段后方入路,切开硬膜,显露出病变脊髓.分上下两点各注入50 μL嗅鞘细胞悬液,细胞数共约1×106个.术后给予止血、抗感染等处理,未使用任何免疫抑制剂.③评估:移植前后分别采用肌电/诱发电位仪检查肌电图和椎旁躯体感觉诱发电位,每例患者检查2次,时间一致,且由同一医生操作.肌电图即检查患者大力收缩时的肌肉情况,以观察运动单位电位的数量、波幅及持续放电能力.椎旁躯体感觉诱发电位是于中线旁开2 cm处两侧同时给予刺激,刺激强度以引起可见的肌肉抽动为准,在头皮上记录电位.方波刺激频率3 Hz,强度20～40 mA,时限0.2 ms,观察感觉平面下降情况.结果:199例晚期完全性脊髓损伤患者均进入结果分析.①术后肌电图检查:93例(46.7%)显示部分受累肌肉大力收缩时募集波型改善,运动单位电位数量增加;105例(52.8%)无变化,1例(0.5%)比术前差.②椎旁躯体感觉诱发电位检查:90例(45.2%)显示感觉平面下降,其中左侧平均下降(1.9±1.2)个节段,右侧平均下降(2.0±1.2)个节段;107例(53.8%)无变化,2例(1.0%)双侧感觉平面上升.结论:对于胚胎嗅鞘细胞移植治疗晚期脊髓损伤患者,肌电图和椎旁躯体感觉诱发电位这两种电生理检查能较为客观的反映脊髓术后感觉和运动功能恢复情况.
作者：陈琳；黄红云；王援朝；张峰；郗海涛；张健；刘彦铖 刊期： 2007年第24期
对本院门诊及住院复发性翼状胬肉患者36例(45眼)行翼状胬肉切除加角膜缘干细胞移植术,并对患者术后疗效进行随访观察.结果随访6个月至3年,仅3例复发,占6.67%,复发率较传统手术方法明显降低,并具有术后创面愈合快、刺激症状轻、并发症少等优点.说明角膜缘干细胞移植术治疗复发性翼状胬肉疗效可靠,可以明显降低手术复发率,适合临床应用.
作者：许和；王丽华；李晓慧；候丽萍 刊期： 2007年第24期
目的:评价亲缘异基因造血干细胞移植与酪氨酸激酶抑制剂STI571治疗非慢性期慢性粒细胞白血病的有效性及安全性.方法:①对象:所有患者在治疗前均经骨髓细胞学、细胞遗传学和/或分子遗传学检查确诊为加速或急变期慢性粒细胞白血病.实验经医学伦理委员会批准,患者均知情同意.STI571治疗组23例患者,男13例,女10例,平均年龄32岁,2002-04/2006-06陆续开始应用STI571,观察截止时间为2006-10,平均用药17.5个月.造血干细胞移植组7例患者,1999-07/2006-04收治,男6例,女1例,平均年龄35.4岁;健康亲缘性异基因造血干细胞供者7例,均与受者经HLA配型证实为全相合.②STI571治疗:23例患者每日口服STI571 600 mg,此过程未给予其他治疗慢性粒细胞白血病的药物.出现以下任一情况药量增至800 mg:治疗3个月仍未达到血液学完全缓解;达到血液学缓解后复发;达到主要遗传学缓解后复发.出现以下任一情况给予停药或减量:中性粒细胞＜1×109 L-1或血小板＜50×109 L-1;出现≥Ⅱ级非血液学不良反应.每周复查血常规,根据血象和骨髓象凋整剂量,每3个月进行骨髓象及细胞遗传学检查.③干细胞移植的相关干预方案:7例患者均采用经典/改良BuCy2方案进行预处理,再给予短程甲氨蝶呤联合环孢菌素A方案预防移植物抗宿主病,其中部分患者加用抗淋巴细胞球蛋白预防移植物抗宿主病.环孢菌素A于移植前1 d以10 mg/(kg·d)分2次口服,并逐渐调整其血浓度至200～400 μg/L;移植后1 d静脉注射甲氨蝶呤15 mg/m2,移植后3,6,11 d静脉注射甲氨蝶呤10 mg/m2.④有效性评估:包括血液学效应(血液学完全缓解、部分缓解、未缓解)、血液学复发及疾病进展、细胞遗传学反应(根据Ph+细胞所占比例分为完全缓解、大部分缓解、小部分缓解、微缓解、不缓解、主要遗传学反应、遗传学复发).⑤安全性评估:按WHO不良反应分度标准分为0～4度.结果:30例患者均进入结果分析.①血液学和细胞遗传学效应:STI571治疗组23例患者均可评价血液学和细胞遗传学效应,12例(52.2%)保持血液学完全缓解,5例(21.7%)发生主要遗传学效应,其中4例(17.4%)为遗传学完全缓解.造血干细胞移植组7例患者于移植后3～6个月均可评价血液学和细胞遗传学效应,且获得血液学和细胞遗传学完全缓解,与STI571治疗组比较差异有显著性意义(P＜0.05).②两组患者的生存情况:两组患者的总体存活率行Kaplan-Meier法比较,差异无显著性意义(x2=0.04,P=0.85).③不良事件与副反应:STI571治疗组在治疗期间,没有患者因药物不良副作用而停药、死亡,7例(30.4%)患者发生Ⅲ/Ⅳ级白细胞和/或血小板减少.造血干细胞移植组2例(28.6%)发生Ⅲ～Ⅳ度急性移植物抗宿主病,3例(42.9%)发生慢性移植物抗宿主病,给予相应治疗后3例无效死亡;移植60 d内发生细菌或真菌感染4例,监测出巨细胞病毒血症2例,经治疗后均得到控制;2例患者发生出血性膀胱炎,经治疗后病情缓解.结论:亲缘异基因造血干细胞移植后血液学完全缓解率、细胞遗传学完全缓解率显著优于STI571治疗,但两种方法终的患者生存率基本相似.
作者：黎纬明；夏凌辉；游泳；刘新月；仲照东；邹萍 刊期： 2007年第24期
目的:观察对比野生型小鼠和成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体突变型小鼠骨髓基质细胞体外培养的生长情况以及成骨潜能,探讨成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体功能持续增强对小鼠骨髓基质细胞发育的影响.方法:实验于2005-09/2006-02在解放军第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所创伤中心实验室,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成.①实验动物:将雄性成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体S252W突变小鼠(由陈林教授在美国国立卫生研究院建立后引入本实验室)和雌性C57BL/6J小鼠(由解放军第三军医大学大坪医院实验动物中心提供)交配,经过基因型鉴定的雄性F1代8周龄小鼠按照基因型分为野生型组和突变型组,12只/组.②实验方法:将两组小鼠脱臼处死后分离胫、股骨,用DMEM培养液冲出骨髓,离心后弃上清,加入DMEM低糖培养液制成细胞悬液,贴壁法分离培养骨髓基质细胞,以1×108 L-1密度传代.③实验评估:倒置相差显微镜下观察细胞形态及贴壁生长情况.采用MTT法检测两组骨髓基质细胞的增殖情况.检测体外成骨诱导条件下两组骨髓基质细胞的碱性磷酸酶活性.采用Van kossa染色检测体外成骨诱导条件下两组骨髓基质细胞的钙结节形成能力.结果:①形态学观察:倒置相差显微镜下两组骨髓基质细胞形态变化相似.第3代骨髓基质细胞在体外诱导成骨条件下增殖速度明显减慢,多数细胞由梭形变成长方形,并逐渐成为立方形,细胞体积增大.②生长曲线:野生型组骨髓基质细胞的吸光度值在接种后2 d内变化不大,细胞处于潜伏期,第4天显著增加,第6天达高峰,进入平台期.与野生型组比较,突变型组骨髓基质细胞生长曲线出现右移和平台期滞后.③碱性磷酸酶活性:在体外诱导成骨条件下,野生型组骨髓基质细胞随培养时间延长碱性磷酸酶活性逐渐上升,第9～15天达高峰,然后随细胞老化而下降.与野生型组相比较,突变型组骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性增高出现滞后现象,并且其高峰数值显著低于野生型组(P＜0.05).④钙结节形成:经过21 d的成骨诱导培养,野生型组骨髓基质细胞可见较多的钙结节形成,突变型组有分散的钙结节形成,但较细小.结论:成纤维细胞生长因子及其受体信号对细胞发育的调控效应是复杂多面的,持续的成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体功能增强可能引起体外培养的小鼠骨髓基质细胞增生减缓,并可能阻抑其向成骨细胞的分化.
作者：尹良军；杜晓兰；刘志君；鲁秀敏；张宜华；杨京；赵玲；陈林 刊期： 2007年第24期
背景:一些研究提示,胎盘可以作为一种新的间充质干细胞来源.胎盘组织中分离出的贴壁细胞与骨髓间充质干细胞有相似形态和细胞表面标志,具有分化为成骨细胞以及神经细胞的能力.目的:探索一种新的获取间充质干细胞的来源及方法.设计:观察性实验.单位:无锡市第三人民医院.材料:胎盘(我院妇产科剖腹产手术中胎盘,经家属同意并经院伦理委员会通过签署知情同意书).培养基;sABC试剂盒、DAB显色试剂盒;羊抗鼠-FITC;重组人碱性成纤维细胞生长因子;兔抗人神经元特异性烯醇化酶;兔抗人胶质纤维酸性蛋白.方法:实验于2005-05/2006-08在无锡第三人民医院细胞与分子生物学研究室完成.消化胎盘实体组织,贴壁培养细胞,观测形态,绘制出各代PDMCs的生长曲线.取原代培养细胞1和7 d时的上清液,用化学发光法测定β-HCG含量.检测细胞表面抗原表达以及分化潜能.培养细胞在诱导分化24 h(神经细胞),2周(成骨细胞)后采用常规方法免疫细胞化学染色.显色后在常规显微镜或荧光显微镜下观察.主要观察指标:①形态学以及生长曲线的观察;②多分化潜能细胞培养上清液β-HCG测定、流式细胞仪检测多分化潜能细胞抗原表达;③多分化潜能细胞诱导分化和诱导分化后细胞免疫组织化学分析.结果:①多分化潜能细胞的原代培养情况:胎盘组织消化后获得细胞中仅有少量的贴壁细胞,经两周后逐渐形成扁平单层细胞,呈漩涡状生长或成簇生长,随着细胞密度的增加,胞体变得细长,形态类似成纤维细胞.②多分化潜能细胞的生长曲线分析结果:细胞在接种后的2～8 d为生长的潜伏期,细胞逐渐开始出现贴壁,无明显扩增;8 d以后细胞进入对数生长期,此时细胞增殖活跃,相差显微镜下观察细胞突起向周围伸展,出现两个核细胞分裂相的间充质干细胞多见,细胞密度增大,彼此相连;11～14 d,生长曲线逐渐进入平台期,MSCs铺满瓶底,细胞扩增趋缓,原代培养结束.③β-HCG测定结果:两个时间点培养上清液中均未检测到β-HCG表达.④多分化潜能细胞的表面抗原特性:多分化潜能细胞表达CD29,CD44和CD105,不表达CD34,CD45,CD19和CD106.⑤多分化潜能细胞的诱导分化结果:向神经细胞诱导24 h后,细胞形态明显改变,胞体回缩,胞核部分折光性增强,出现类似于树突及轴突样结构,染色可见神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性.结论:胎盘组织中含有的多分化潜能细胞与骨髓间充质干细胞形态功能相似,胎盘可以作为获取间充质干细胞的一种有效来源.
作者：王玲；徐秋岚；苗宗宁；祝建中；黄伟 刊期： 2007年第24期
目的:采用骨髓间充质干细胞体外向软骨方向诱导分化并和两种载体(胶原海绵和聚乳酸/聚羟乙酸共聚物)混合形成立体培养,对两种不同生物材料的生物相容性进行观察.方法:实验于2005-03/2006-05在华北煤炭医学院中心实验室完成.①实验材料:清洁级成年SD大鼠1只,雌雄不限;聚乳酸/聚羟乙酸共聚物(山东医疗器械研究所高分子室),胶原海绵(上海其胜公司).②实验分组:实验分为3组,即聚乳酸/聚羟乙酸共聚物组、胶原海绵组和平面培养组.③实验干预:取成年大鼠骨髓以密度梯度离心加贴壁分离法纯化分离骨髓间充质干细胞,传至第3代.将细胞以1.5×104/孔定量接种于各组的培养板内,加全培养诱导液[转化生长因子β1 10 μg、碱性成纤维生长因子10 μg、地塞米松100 nmol、维生素C 50 mg、β-甘油磷酸钠10 mmol和ITS 50 mL(牛血清白蛋白,牛转铁蛋白,牛胰岛素及微量元素)].④实验评估:培养1周后,随机取样使用甲苯氨蓝染色和特异性Ⅱ型胶原单克隆抗体免疫组织化学染色后进行检测.培养4周后使用扫描电镜观察细胞在载体上附着和生长的情况.结果:①骨髓间充质干细胞生长情况及形态:3周后倒置相差显微镜观察,可见细胞围绕在材料周边生长,随培养时间的延长,细胞形成均一的椭圆形,各载体组的细胞与平面对照组相似,无细胞衰老及异常分裂现象.②软骨细胞特异性检测:3组间甲苯氨蓝染色和特异性Ⅱ型胶原单克隆抗体免疫组织化学染色差异无显著性.③载体材料扫描电镜观察结果:在两种载体表面,分别有部分细胞黏附在载体表面生长,并在其表面连接成片.结论:胶原海绵和聚乳酸/聚羟乙酸共聚物对大鼠骨髓间充质干细胞在向软骨诱导过程中的细胞功能、细胞生长增殖无影响,两种生物材料具有良好的生物相容性,可作为软骨组织工程的载体材料应用.
作者：张翼；宋敬锋；白俊清；程爱国；张迪 刊期： 2007年第24期
目的:克隆人血小板源性生长因子B基因于腺相关病毒载体中,以获得高感染滴度的重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒.方法:实验于2005-10/2006-11在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.①健康足月产妇胎盘组织由青岛大学医学院附属医院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意.DH5α宿主菌由青岛大学医学院附属医院中心实验室制备保存.②Trizol试剂提取健康足月产妇胎盘组织总RNA,反转录-聚合酶链反应一步法克隆人血小板源性生长因子B基因全长开放读框.聚合酶链反应产物定向克隆于腺相关病毒载体,重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体进行双酶切和测序鉴定.③采用磷酸钙转染法将重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体、腺相关病毒包装载体,腺相关病毒辅助载体共转染腺相关病毒293细胞,包装得到重组腺相关病毒并回收病毒原液,显微镜下观察细胞及培养基的变化.④以携带β-半乳糖苷酶基因的腺相关病毒作为报告基因同重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体一样共转染相关病毒293细胞,对报告基因行X-Gal染色,通过蓝染的细胞计算病毒滴度.结果:①重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体酶切鉴定及序列分析:聚合酶链反应产物经电泳证明大小正确,重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体酶经双酶切和测序鉴定证实将血小板源性生长因子B基因正确插入.②腺相关病毒293细胞转染过程中病毒颗粒的产生:腺相关病毒293细胞转染6 h后培养基底部出现无数小黑色颗粒,为加入的转染复合物颗粒.24 h后腺相关病毒293细胞部分变圆,随着病毒增殖,细胞成串浮起,出现细胞病理效应.48 h后细胞变形,逐渐从壁上脱落.72 h后培养基的颜色从红色变化为橙色或黄色.③病毒滴度检测:通过携带β-半乳糖苷酶基因的腺相关病毒感染细胞后X-gal染色计数,测定重组腺相关病毒滴度为1×1010 L-1.结论:成功构建表达人血小板源性生长因子B基因的重组腺相关病毒载体,为进一步研究血小板源性生长因子B基因治疗角膜病和相关细胞系与组织的增殖提供实验基础.
作者：刘相萍；罗文娟；隋爱华；杨堃；吕振华；王传富 刊期： 2007年第24期
背景:在一定条件下,胚胎干细胞可诱导分化成为神经前体细胞,当移植到健全或损伤的中枢神经系统后,可以与宿主细胞有效整合,修复重建损伤的神经组织.目的:观察胚胎干细胞诱导的神经前体细胞移植对小鼠脊髓损伤神经功能恢复的影响.设计:随机对照动物实验.单位:上海第二医科大学发育生物学研究中心.材料:选用28只6～8周龄C57/BL6J小鼠,雌雄不限.小鼠胚胎干细胞株S8及携带LacZ标记基因由上海市发育生物学研究中心提供.高糖DMEM、2-巯基乙醇、小鼠白血病抑制因子、丝裂霉素C均来自GIBCO贴壁诱导培养液由上海市发育生物学研究中心提供.方法:实验于2003-04/2004-04在上海第二医科大学发育生物学研究中心实验室完成.采用贴壁诱导法将ES细胞培养诱导分化为神经前体细胞,将小鼠麻醉,在9～10椎骨平面制成脊髓半横断模型,随机摸球法将大鼠分为3组,假手术组(n=9):仅剪除T9-10棘突和椎板后,逐层缝合.干细胞移植组(n=10):脊髓半横断后,行距损伤区域以远约1 cm的椎管内注射细胞.模型组(n=9):脊髓半横断后在损伤邻近区注射DMEM.各组分别于实验后第1,2,4,6,8周采用BBB评分观察各组小鼠神经功能恢复情况,实验后第8周(BBB评分后)利用x-gal染色观察各组脊髓损伤区胚胎干细胞存活和分化情况.X-gal染色干细胞移植组阳性的损伤脊髓部位切片进行荧光免疫组化检测.主要观察指标:①各组小鼠神经功能恢复情况.②各组脊髓损伤区胚胎干细胞存活和分化情况.③荧光免疫组化检测结果.结果:①干细胞移植组第1,2,4周BBB得分,高于模型组(P＜0.01).②脊髓损伤区胚胎干细胞存活和分化情况:干细胞移植组中小鼠的脊髓损伤处组织切片可以发现x-gal染色阳性的细胞,胞浆呈现蓝色,即胚胎干细胞来源的衍生细胞,而假手术组和模型组的脊髓均未见该现象.干细胞移植组损伤脊髓部位植入的胚胎干细胞来源的衍生细胞分布损伤区周围并与周围组织整合,与周边细胞在形态上类似.③干细胞移植组损伤脊髓部位,X-gal染色阳性细胞可表达神经元特异性标志NF,但没有表达GFAP标志.结论:将ES细胞的培养诱导分化为神经前体细胞移植后,能够存活、迁移、并分化为神经元,但改善神经功能情况不明显.
作者：杨建华；王凤华；李长德；王裕；马杰 刊期： 2007年第24期
目的:选择合适的细胞外基质,利用脑微血管内皮细胞、细胞外基质与神经干神胞构建神经干细胞共移植体,以提高移植神经干神胞向神经元的分化率.方法:实验于2005-11/2006-10在佳木斯大学神经病研究所免疫组织化学研究实验室完成.①实验材料:同一基因背景出生2 h～7 d清洁级Wistar大鼠由哈尔滨医科大学实验动物学部提供.取出生24 h内Wistar大鼠大脑制备神经干细胞,采用免疫组织化学法和免疫荧光法做nestin染色鉴定;取出生1～7 d Wistar大鼠大脑制备脑微血管内皮细胞,采用免疫细胞化学方法鉴定.②实验方法:不同细胞外基质的筛选:将多聚赖氨酸、层黏连蛋白和Matrigel分别与神经干细胞和脑微血管内皮细胞混合培养,接种于铺有盖玻片的6孔板中,并加入神经干细胞完全培养液,每3 d换半量液,7 d换全液.采用免疫组织化学观察抗微管相关蛋白阳性细胞.进行神经干细胞共移植体构建及检测.③实验评估:利用免疫荧光方法,以Ⅷ因子标记物标记脑微血管内皮细胞,用nestin标记神经干细胞,检测共移植体.结果:①神经干细胞和脑微血管内皮细胞形态学观察及鉴定:原代分离的单神经干细胞4 d增生为神经细胞球,传代后,经nestin免疫荧光染色,细胞球呈阳性;原代培养脑微血管内皮细胞6～8 d长满瓶壁,细胞呈多角形或扁平梭形,核卵圆形,Ⅷ因子相关抗原阳性.②3种细胞外基质对神经干细胞分化的影响:层黏连蛋白与两种细胞共培养,抗微管相关蛋白阳性细胞数明显高于Matrigel组和多聚赖氨酸组(P＜0.01).③共移植体活细胞镜下及免疫荧光结果所见:镜下可见共移植体细胞团不规则,神经干细胞被脑微血管内皮细胞包绕或相互连贴,脑微血管内皮细胞核大,胞体不规则,明显大于神经干细胞,神经干细胞折光性强.在200倍视野下,随机选取100个共移植体进行细胞计数,可见平均细胞数为8～15个,其中脑微血管内皮细胞数平均2.8个.免疫荧光可见红色Ⅷ因子阳性脑微血管内皮细胞包被绿色nestin阳性神经干细胞,或相互粘贴.结论:以脑微血管内皮细胞为支持细胞,用层黏连蛋白为细胞外基质可以成功构建神经干细胞共移植体.
作者：朱晓峰；齐志国；张晓梅 刊期： 2007年第24期
目的:分析人脐带血间质干细胞分离培养方法及临床应用的安全性.方法:实验于2005-04/12在河南省红十字血液中心和郑州市第二人民医院完成.实验方法:①无菌条件下将脐带血液采集到无菌采血袋内,产妇及其家属均知情同意,并经医院伦理委员会批准.随机抽查62份样本,单份采集量80～160 mL,计数有核细胞.②以1∶1体积比将Ficoll-Hypaque混合溶液加入四联袋主袋内,将四联袋与脐带血收集袋相连,再将样本血液沿袋壁缓慢加入四联袋主袋内的液面上.离心后将四联袋主袋放在分浆夹上,袋内液体自上而下分为血浆血小板层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层、多核细胞层、红细胞层5层.将血浆血小板层上2/3液体挤压入四联袋一空袋内,将剩余的血浆血小板层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层上部挤压入四联袋另一空袋内,即为富含有核细胞液体.③随机选择本院2005-04/12收治脑卒中后遗症患者10例.男9例,女1例,35～75岁,病程3个月～7年.诊断均由CT、MRI检查证实,符合第四届全国脑血管病学术会议修订的脑卒中诊断标准,患者均对治疗方案知情同意.将脐带血间充质于细胞经静脉输注入患者体内,每次输注1份,每例患者平均输注6份,每份间隔时间平均4 d.于治疗前和治疗3个月后评价患者神经功能状态、肢体运动功能及日常生活活动能力.采用脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准评估神经功能,分数越低,神经功能状态越好;采用Fugl-Meyer评估患侧肢体运动功能,分数越高,肢体运动功能越好;采用Barthel指数评估日常生活活动能力,分数越高,日常生活活动能力越高.结果:①分离的62份脐血间质干细胞,每份含有有核细胞(3.62±2.39)×109,红细胞残余量为(1.64±1.25)×109,CD34+细胞的比率为(2.31±0.93)%,CD133±的比率为(1.36±1.23)%.培养7 d后贴壁细胞为(3.27+1.85)×107,CD133+比率为(8.21±2.46)%.②患者治疗前与治疗3个月后相比,神经功能状态、肢体运动功能及日常生活活动能力评分均明显升高(治疗前:25.40±6.09,31.90±21.85,36.20±19.41;治疗后:1.90±5.09,80.9±25.00,81.10±15.93,P＜0.01).未发现免疫排斥及不良反应.结论:①利用多联袋无菌制备脐血间质干细胞分离效果良好,分离过程在密闭系统进行,单个核细胞和间质干细胞能满足临床需要,适合患者静脉输注和局部直接应用,方法简便安全可靠.②经静脉输注后,疗效确切,能明显改善脑卒中后遗症作用.
作者：李建斌；满勇；单泓；赵林娜；段艳丽 刊期： 2007年第24期
目的:比较脐静脉、成人骨髓及胎儿骨髓3种不同来源的间充质干细胞体外生长特性及分化潜能.方法:①实验于2004-01/2006-06在苏州大学附属第二医院中心实验室完成.孕39～40周健康产妇正常分娩2 h的脐带以及3～4月龄流产胎儿均由苏州大学附属第二医院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意.正常成人骨髓由苏州大学附属第二医院血液科研究生捐献.本实验经医学伦理委员会批准.②脐带用含青、链霉素的磷酸盐缓冲液冲净静脉腔内残血,夹闭两端,经37 ℃预热的1.5 g/L胶原酶消化,重悬于DMEM-LG(含体积分数为0.1的新生牛血清、20 mmol/L HEPES、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1 mmol/L 丙酮酸钠),以108 L-1密度接种于25 cm2培养瓶常规培养,48 h后弃上清,以后每两三天半量换液,3周后用5 g/L胰酶消化传代.③抽取正常成人骨髓5～10 mL,ficoll分离单个核细胞,收取白雾层及以上部分细胞,采用上述培养基按相同条件进行培养,约14～18 d胰酶消化传代.④取流产胎儿,无菌条件下分离股骨,冲洗干净后采用两种方法分离间充质干细胞:直接将胎骨剪成约1 mm3大小的碎片,磷酸盐缓冲液洗涤后加入少量上述培养基,置10 cm培养皿培养;剪去股骨两端后,用上述培养基冲出骨髓腔内细胞,直接培养.⑤观察连续传代对3种不同来源间充质干细胞增殖的影响;免疫荧光及免疫组化分析所得细胞的表型;观察3种不同来源间充质干细胞在诱导培养条件下向成骨及成脂细胞分化的潜能.结果:①不同来源间充质干细胞的体外增殖特性:脐带、成人及胎儿骨髓内均存在间充质干细胞,且细胞形态相似.成人骨髓间充质干细胞的体外增殖能力较差,传至10～12代基本失去增殖能力.脐静脉间充质干细胞的增殖能力强于成人骨髓间充质干细胞,可体外连续传代15～18次.而胎儿来源的间充质干细胞增殖能力及体外传代更新能力均明显强于其他两种间充质干细胞,传至20代时基本保持原有的特性.②不同来源间充质干细胞免疫表型:3种间充质干细胞均高表达CD29、CD44、CD54及HLA-ABC分子,成人骨髓源间充质干细胞还表达中等量的CD106及少量HLA-DR.3种间充质干细胞均不表达造血细胞标志CD34和CD45,其中脐静脉来源的间充质干细胞αSMA呈阳性,vWF呈阴性.③不同来源间充质干细胞的分化潜能:在成脂或成骨条件培养基中,3种间充质干细胞均可向脂肪及成骨细胞分化,油红O及von Kossa染色呈阳性.结论:①脐带、成人及胎儿骨髓内均存在数量不等的间充质干细胞,其形态、生长特性及表面标志具有相似性.②脐静脉源间充质干细胞的增殖能力优于骨髓间充质干细胞,尽管略弱于胎源性间充质干细胞,但其来源广泛、分离方便、间充质干细胞得率高,且没有伦理限制,是一种较好的间充质干细胞来源.
作者：傅晋翔；张晓惠；张建华；张阳敏；孙谕 刊期： 2007年第24期
目的:为寻找采集外周血造血干细胞更合适的手段,探讨间断流动式血细胞分离机采集外周血造血干细胞的效果.方法:选择中山大学第五附属医院血液风湿科2004-2006年12例行外周血造血干细胞移植住院患者.①实验对象:供者5例,男1例,女4例,一般状况良好,与患者关系为同胞妹妹3例,同胞弟弟1例,同胞姐姐1例;患者7例,男3例,女4例,23～62岁,7例为自体移植,5例为异基因移植.血液系统疾病患者9例(非霍奇淋巴瘤3例,急性淋巴细胞白血病2例,急性髓细胞白血病2例,慢性粒细胞白血病1例,骨髓增生异常综合征1例);自身免疫性疾病3例(重型系统性红斑狼疮2例,难治复发性类风湿关节炎合并干燥综合征1例).②实验过程:每位供/患者均知情同意并签署知情同意书.对于自体患者,根据患者的疾病类型采取不同的干细胞动员化疗方案,联合化疗后7～10 d,待白细胞下降至低点,一般为≤1.0×109 L-1时,给予粒细胞集落刺激因子5 μg/kg皮下注射,白细胞升至3.0×109 L-1时开始采集;对于allo-PBSCT供者直接给予粒细胞集落刺激因子5μg/kg,皮下注射,1次/d,共5 d,同时应用流式细胞仪检测CD34+细胞数,至白细胞升至≥20.0×109 L-1或当CD34+细胞升高＞20个/μL时采用增强型多功能血细胞分离机PBSC程序卡采集健康供者和患者外周血造血干细胞.③实验评估:分析采集效率、血液学参数、不良事件发生率、以及供、受者ABO血型不合的患者回输干细胞溶血反应等情况.结果:12例供者、患者均进入结果分析.①共进行了24次采集,其中1次采集1例,2次采集7例,3次采集3例,平均循环次数(25±5)次,采集时间(228±32)min,处理血量(723 4±120 5)mL,复方枸橼酸钠溶液用量为(623±96)mL,干细胞收集量为(102±21)mL,CD34+细胞采集效率为(54.3±30.7)%,细胞计数示白细胞为(156±34)×109 L-1,单个核细胞为(79.7±13.2)×109 L-1,流式细胞仪检测CD34+细胞为(10.30±4.38)×106/kg受者体质量.②不良反应轻微,24次采集过程中出现不良反应6次均为枸橼酸盐所致低钙血症反应.血红蛋白和血小板与采集前相比分别下降9.36%和11.10%.供、受者ABO血型不合的3例患者在输注造血干细胞悬液后均未出现溶血反应.③12例均获造血功能重建,无移植相关死亡.结论:用间断流动式血细胞分离机采集外周血造血干细胞效果良好,不良反应轻微,能有效的减少被采集者红细胞、血小板的丢失,对供、受者ABO血型不合者不需去除造血干细胞悬液中的红细胞,值得临床应用.
作者：何志国；侯丽君；李碧香；徐景勃；曾林涓 刊期： 2007年第24期
目的:检测胎盘早剥产妇血、新生儿血及脐血组织因子及组织因子途径抑制物蛋白的变化,以及这些变化对其凝血功能的影响.方法:收集2006-10/2007-04在中山大学附属第一医院产科的胎盘早剥产妇血(足月或早产不限)、分娩胎儿的脐带血及新生儿血标本各11例,4例为足月产,其余均为胎龄29～36周早产标本,男婴5份,女婴6份.正常对照15份来自同期广州市妇婴医院产妇及分娩胎儿.标本收集时间母亲血为分娩前24 h内、脐血为分娩即刻、新生儿血为出生后2 h内抽取,排除标准为产妇本次分娩前无血液系统疾病史,未使用过对凝血功能产生影响的药物,采用酶联免疫吸附方法测定血浆组织因子及组织因子途径抑制物抗原水平,并与正常分娩产妇对照组进行比较.病理及正常标本均经产妇及家属知情同意后获得.结果:①胎盘早剥产妇血、新生儿血及脐血血浆中组织因子测定值明显高于正常对照组(P＜0.05).②胎盘早剥产妇血、新生儿血浆及脐血中组织因子途径抑制物测定值较正常分娩产妇降低,差异具有显著性意义(P＜0.01).③胎盘早剥产妇血、新生儿和脐血组织因子途径抑制物/组织因子比值均较正常分娩产妇明显降低(P＜0.01).结论:胎盘早剥时产妇血、脐血及新生儿血促凝血活性增强,抗凝血活性降低,与其高凝状态相关.
作者：唐雯；杨红玲；冯琼；陶少华；石小东；花少栋；孙学刚；封志纯 刊期： 2007年第24期
外周血造血干细胞移植已越来越多的应用于临床,在干细胞移植治疗过程中,动员和采集足够的造血干细胞是移植成功的关键.重组人粒细胞集落刺激因子是当前外周血造血干细胞动员的主要方法.
作者：吴金艳 刊期： 2007年第24期
目的:向大脑中动脉缺血大鼠植入神经干细胞,探讨电刺激小脑顶核与神经干细胞共移植体对其向神经元分化的影响.方法:实验于2005-08/2006-11在佳木斯大学神经科学研究所完成.①选取同一基因背景大鼠72只,随机数字表法分成3组:神经干细胞移植组、电刺激+神经干细胞组、电刺激+神经干细胞共移植体组,24只/组.②另选取出生24 h内的Wistar鼠1只用于神经干细胞的分离,制备单细胞悬液,调整细胞密度为5×108 L-1,置于10 mg/L的Brdu完全培养液中孵育72 h.神经干细胞共移植体由神经干细胞、层粘连蛋白和血管内皮细胞构成,由本实验室提供并鉴定.③各组大鼠于造模前1 d麻醉后行小脑顶核刺激,以前囟为零点、正中线向后11.6 mm、正中线向右1.2 mm.给予直角方波脉冲刺激,电流强度为50 μA,频率80 Hz,时程1 h.④各组大鼠均采用线栓法建立局灶性脑缺血动物模型.造模1 d后,分别将培养的神经干细胞及共移植体细胞浓度调整为2×1010 L-1,于缺血纹状体侧缺血半暗带区垂直进针,进入5.0 mm后缓慢推入细胞悬液,神经干细胞移植组、电刺激+神经干细胞组移植神经干细胞悬液10 μL,电刺激+神经干细胞共移植体组移植神经干细胞共移植体悬液10 μL,移植速度为0.5 μL/min,留针10 min后缓慢拔针.⑤各组分别于移植后3,7,14,60 d观察神经于细胞移入脑内后分化成神经元的情况.胞核呈绿色荧光、胞质呈红色荧光的为Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞,代表移植入的神经干细胞所分化的神经元.结果:72只同一基因背景大鼠均进入结果分析.①与神经干细胞移植组比较,移植后7,14,60 d电刺激+神经干细胞组、电刺激+神经干细胞共移植体组Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞百分率均明显升高(F=12.44～25.18,P均＜0.05).移植后3,7,14,60 d电刺激+神经干细胞共移植体组Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞百分率均明显高于电刺激+神经干细胞组(F=8.19～25.18,P均＜0.05).②随移植时间的延长,各组Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞形态均逐渐增大,至移植后60 d时细胞周边可见突起.结论:大脑中动脉缺血模型鼠移植入神经干细胞后,电刺激小脑顶核能够对神经干细胞向神经元的分化产生促进作用,且共移植体与电刺激小脑顶核具有协同效应.
作者：金玉玲；谢艳萍；朱晓峰 刊期： 2007年第24期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
