李建斌；满勇；单泓；赵林娜；段艳丽
目的:观察对比野生型小鼠和成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体突变型小鼠骨髓基质细胞体外培养的生长情况以及成骨潜能,探讨成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体功能持续增强对小鼠骨髓基质细胞发育的影响.方法:实验于2005-09/2006-02在解放军第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所创伤中心实验室,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成.①实验动物:将雄性成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体S252W突变小鼠(由陈林教授在美国国立卫生研究院建立后引入本实验室)和雌性C57BL/6J小鼠(由解放军第三军医大学大坪医院实验动物中心提供)交配,经过基因型鉴定的雄性F1代8周龄小鼠按照基因型分为野生型组和突变型组,12只/组.②实验方法:将两组小鼠脱臼处死后分离胫、股骨,用DMEM培养液冲出骨髓,离心后弃上清,加入DMEM低糖培养液制成细胞悬液,贴壁法分离培养骨髓基质细胞,以1×108 L-1密度传代.③实验评估:倒置相差显微镜下观察细胞形态及贴壁生长情况.采用MTT法检测两组骨髓基质细胞的增殖情况.检测体外成骨诱导条件下两组骨髓基质细胞的碱性磷酸酶活性.采用Van kossa染色检测体外成骨诱导条件下两组骨髓基质细胞的钙结节形成能力.结果:①形态学观察:倒置相差显微镜下两组骨髓基质细胞形态变化相似.第3代骨髓基质细胞在体外诱导成骨条件下增殖速度明显减慢,多数细胞由梭形变成长方形,并逐渐成为立方形,细胞体积增大.②生长曲线:野生型组骨髓基质细胞的吸光度值在接种后2 d内变化不大,细胞处于潜伏期,第4天显著增加,第6天达高峰,进入平台期.与野生型组比较,突变型组骨髓基质细胞生长曲线出现右移和平台期滞后.③碱性磷酸酶活性:在体外诱导成骨条件下,野生型组骨髓基质细胞随培养时间延长碱性磷酸酶活性逐渐上升,第9～15天达高峰,然后随细胞老化而下降.与野生型组相比较,突变型组骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性增高出现滞后现象,并且其高峰数值显著低于野生型组(P＜0.05).④钙结节形成:经过21 d的成骨诱导培养,野生型组骨髓基质细胞可见较多的钙结节形成,突变型组有分散的钙结节形成,但较细小.结论:成纤维细胞生长因子及其受体信号对细胞发育的调控效应是复杂多面的,持续的成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体功能增强可能引起体外培养的小鼠骨髓基质细胞增生减缓,并可能阻抑其向成骨细胞的分化.
作者：尹良军；杜晓兰；刘志君；鲁秀敏；张宜华；杨京；赵玲；陈林 刊期： 2007年第24期
目的:选择合适的细胞外基质,利用脑微血管内皮细胞、细胞外基质与神经干神胞构建神经干细胞共移植体,以提高移植神经干神胞向神经元的分化率.方法:实验于2005-11/2006-10在佳木斯大学神经病研究所免疫组织化学研究实验室完成.①实验材料:同一基因背景出生2 h～7 d清洁级Wistar大鼠由哈尔滨医科大学实验动物学部提供.取出生24 h内Wistar大鼠大脑制备神经干细胞,采用免疫组织化学法和免疫荧光法做nestin染色鉴定;取出生1～7 d Wistar大鼠大脑制备脑微血管内皮细胞,采用免疫细胞化学方法鉴定.②实验方法:不同细胞外基质的筛选:将多聚赖氨酸、层黏连蛋白和Matrigel分别与神经干细胞和脑微血管内皮细胞混合培养,接种于铺有盖玻片的6孔板中,并加入神经干细胞完全培养液,每3 d换半量液,7 d换全液.采用免疫组织化学观察抗微管相关蛋白阳性细胞.进行神经干细胞共移植体构建及检测.③实验评估:利用免疫荧光方法,以Ⅷ因子标记物标记脑微血管内皮细胞,用nestin标记神经干细胞,检测共移植体.结果:①神经干细胞和脑微血管内皮细胞形态学观察及鉴定:原代分离的单神经干细胞4 d增生为神经细胞球,传代后,经nestin免疫荧光染色,细胞球呈阳性;原代培养脑微血管内皮细胞6～8 d长满瓶壁,细胞呈多角形或扁平梭形,核卵圆形,Ⅷ因子相关抗原阳性.②3种细胞外基质对神经干细胞分化的影响:层黏连蛋白与两种细胞共培养,抗微管相关蛋白阳性细胞数明显高于Matrigel组和多聚赖氨酸组(P＜0.01).③共移植体活细胞镜下及免疫荧光结果所见:镜下可见共移植体细胞团不规则,神经干细胞被脑微血管内皮细胞包绕或相互连贴,脑微血管内皮细胞核大,胞体不规则,明显大于神经干细胞,神经干细胞折光性强.在200倍视野下,随机选取100个共移植体进行细胞计数,可见平均细胞数为8～15个,其中脑微血管内皮细胞数平均2.8个.免疫荧光可见红色Ⅷ因子阳性脑微血管内皮细胞包被绿色nestin阳性神经干细胞,或相互粘贴.结论:以脑微血管内皮细胞为支持细胞,用层黏连蛋白为细胞外基质可以成功构建神经干细胞共移植体.
作者：朱晓峰；齐志国；张晓梅 刊期： 2007年第24期
目的:向大脑中动脉缺血大鼠植入神经干细胞,探讨电刺激小脑顶核与神经干细胞共移植体对其向神经元分化的影响.方法:实验于2005-08/2006-11在佳木斯大学神经科学研究所完成.①选取同一基因背景大鼠72只,随机数字表法分成3组:神经干细胞移植组、电刺激+神经干细胞组、电刺激+神经干细胞共移植体组,24只/组.②另选取出生24 h内的Wistar鼠1只用于神经干细胞的分离,制备单细胞悬液,调整细胞密度为5×108 L-1,置于10 mg/L的Brdu完全培养液中孵育72 h.神经干细胞共移植体由神经干细胞、层粘连蛋白和血管内皮细胞构成,由本实验室提供并鉴定.③各组大鼠于造模前1 d麻醉后行小脑顶核刺激,以前囟为零点、正中线向后11.6 mm、正中线向右1.2 mm.给予直角方波脉冲刺激,电流强度为50 μA,频率80 Hz,时程1 h.④各组大鼠均采用线栓法建立局灶性脑缺血动物模型.造模1 d后,分别将培养的神经干细胞及共移植体细胞浓度调整为2×1010 L-1,于缺血纹状体侧缺血半暗带区垂直进针,进入5.0 mm后缓慢推入细胞悬液,神经干细胞移植组、电刺激+神经干细胞组移植神经干细胞悬液10 μL,电刺激+神经干细胞共移植体组移植神经干细胞共移植体悬液10 μL,移植速度为0.5 μL/min,留针10 min后缓慢拔针.⑤各组分别于移植后3,7,14,60 d观察神经于细胞移入脑内后分化成神经元的情况.胞核呈绿色荧光、胞质呈红色荧光的为Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞,代表移植入的神经干细胞所分化的神经元.结果:72只同一基因背景大鼠均进入结果分析.①与神经干细胞移植组比较,移植后7,14,60 d电刺激+神经干细胞组、电刺激+神经干细胞共移植体组Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞百分率均明显升高(F=12.44～25.18,P均＜0.05).移植后3,7,14,60 d电刺激+神经干细胞共移植体组Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞百分率均明显高于电刺激+神经干细胞组(F=8.19～25.18,P均＜0.05).②随移植时间的延长,各组Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞形态均逐渐增大,至移植后60 d时细胞周边可见突起.结论:大脑中动脉缺血模型鼠移植入神经干细胞后,电刺激小脑顶核能够对神经干细胞向神经元的分化产生促进作用,且共移植体与电刺激小脑顶核具有协同效应.
作者：金玉玲；谢艳萍；朱晓峰 刊期： 2007年第24期
目的:采用客观的电生理检查手段评价胚胎嗅鞘细胞移植治疗晚期脊髓损伤的有效性.方法:①对象:选择2003-02/2005-01北京市西山医院暨北京康复中心神经外科收治的接受人胚胎嗅鞘细胞移植治疗的晚期完全性脊髓损伤患者199例,男164例,女35例,平均年龄(34.7±11.3)岁,平均病程(4.7±5.5)年;受伤节段:颈段99例,胸段89例,胸腰段11例;受伤原因:车祸、摔伤、医源性损伤、机器挤压伤等.4个月流产胚胎由北京市虹天济神经科学研究院协作医院提供,产妇及其家属均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②方法:取人胚胎嗅球,消化成单个嗅鞘细胞后培养2周.199例晚期完全性脊髓损伤患者均接受人胚胎嗅鞘细胞移植治疗,在全麻下行脊髓损伤节段后方入路,切开硬膜,显露出病变脊髓.分上下两点各注入50 μL嗅鞘细胞悬液,细胞数共约1×106个.术后给予止血、抗感染等处理,未使用任何免疫抑制剂.③评估:移植前后分别采用肌电/诱发电位仪检查肌电图和椎旁躯体感觉诱发电位,每例患者检查2次,时间一致,且由同一医生操作.肌电图即检查患者大力收缩时的肌肉情况,以观察运动单位电位的数量、波幅及持续放电能力.椎旁躯体感觉诱发电位是于中线旁开2 cm处两侧同时给予刺激,刺激强度以引起可见的肌肉抽动为准,在头皮上记录电位.方波刺激频率3 Hz,强度20～40 mA,时限0.2 ms,观察感觉平面下降情况.结果:199例晚期完全性脊髓损伤患者均进入结果分析.①术后肌电图检查:93例(46.7%)显示部分受累肌肉大力收缩时募集波型改善,运动单位电位数量增加;105例(52.8%)无变化,1例(0.5%)比术前差.②椎旁躯体感觉诱发电位检查:90例(45.2%)显示感觉平面下降,其中左侧平均下降(1.9±1.2)个节段,右侧平均下降(2.0±1.2)个节段;107例(53.8%)无变化,2例(1.0%)双侧感觉平面上升.结论:对于胚胎嗅鞘细胞移植治疗晚期脊髓损伤患者,肌电图和椎旁躯体感觉诱发电位这两种电生理检查能较为客观的反映脊髓术后感觉和运动功能恢复情况.
作者：陈琳；黄红云；王援朝；张峰；郗海涛；张健；刘彦铖 刊期： 2007年第24期
目的:在已成功分离培养皮质神经干细胞的基础上,体外分离培养鼠胚中脑区的神经干细胞,并进行鉴定,为中脑神经干细胞的基础与应用研究建立细胞培养平台.方法:实验于2005-11/2006-07在武汉工业学院完成.①选取孕12～13 d昆明小鼠1只,处死后无菌条件下分离胚胎腹侧中脑,胰酶消化和机械吹打制成单细胞悬液,在碱性成纤维生长因子和B27存在的无血清培养基中培养扩增,机械分离法传代,观察细胞生长状况.②将传至第2代的神经球以20～30个/cm2接种于置有预先经左旋多聚赖氨酸包被盖玻片的24孔培养板中,加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM/F12(不加任何生长因子)诱导分化.③采用免疫细胞化学染色方法鉴定神经干细胞及其传代细胞的分化方向.结果:①孕12～13 d的鼠胚中脑细胞体外培养36 h后,可见2～5个细胞的团块;48 h后有明显球状团块产生,胞间界限不很清楚,出现神经细胞球;培养6 d后传代,少部分单细胞于传代2 d后出现分裂相,随后渐形成细胞团及神经球,生长性状基本同原代.②将培养的神经细胞球转入有血清培养时,约1周球体可完全分化为神经细胞和胶质细胞.免疫荧光染色显示神经球细胞表达巢蛋白,且神经元特异性烯醇化酶染色和胶质纤维酸性蛋白染色均呈阳性.结论:孕12～13 d鼠胚胎腹侧中脑区存在神经干细胞,这些细胞在B27和碱性成纤维生长因子存在的无血清培养基中能够成功的在体外培养和传代.
作者：刘立；彭超华；梁鹏；戴冀斌 刊期： 2007年第24期
背景:三碘甲状腺原氨酸是脑发育临界期的重要调控因素,在中枢神经系统发育过程中可能决定着神经干细胞的世系分化命运.目的:观察三碘甲状腺原氨酸诱导人神经干细胞分化情况以及分化过程中甲状腺激素受体mRNA的表达变化.设计:开放性实验.单位:天津市武警医学院病理教研室,天津医科大学内分泌研究所.材料:实验于2003-01/2005-03在天津医科大学完成.由天津医科大学总医院提供孕10～12周流产胎儿,产妇及家属均签署知情同意书,实验经医学伦理委员会批准.方法:①无菌条件下取人胚胎两侧大脑半球,剥除脑膜,剪碎脑组织,过滤制备细胞悬液.以20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子+30 nmol/L三碘甲状腺原氨酸联合诱导神经干细胞增殖,按1×109 L-1密度分别接种于涂有多聚左旋赖氨酸的24孔板和25 mL培养瓶中常规培养,培养液为含N2添加剂的DMEM/F12无血清培养基.48 h后半量换液,7 d后撤除碱性成纤维细胞生长因子,单独用三碘甲状腺原氨酸诱导分化.②培养1,2,3周时取细胞,RT-PCR半定量检测神经干细胞诱导分化不同阶段甲状腺激素受体mRNA表达的变化,免疫细胞化学鉴定分化后的细胞类型.主要观察指标:①三碘甲状腺原氨酸诱导神经干细胞分化前后细胞形态观察及类型鉴定.②神经干细胞分化过程中甲状腺激素受体mRNA表达的变化.结果:①诱导前细胞呈圆形,表面光滑,并逐渐聚集成神经细胞球,Nestin单染及Nestin+BrdU双染均呈免疫细胞化学反应阳性.三碘甲状腺原氨酸诱导分化1周时,细胞大多呈单极或双极,有细长突起,神经丝蛋白、胶质纤维酸蛋白、半乳糖脑苷免疫细胞化学染色呈阳性;诱导3周后可见细胞核呈圆形,突起多且粗,细胞整体呈蜘蛛状,髓鞘碱性蛋白阳性率达80%.②甲状腺激素受体α1mRNA在诱导前神经干细胞状态时表达量高,三碘甲状腺原氨酸诱导后表达量逐渐下降,至2周时达低,此后表达量有所回升,但仍低于神经干细胞状态(F=32.49,P=0.008).甲状腺激素受体α2mRNA表达变化趋势与甲状腺激素受体α1相同.甲状腺激素受体β1mRNA在神经干细胞状态时表达量低,三碘甲状腺原氨酸诱导后表达量逐渐升高,2周时达高,且超过同时间点甲状腺激素受体α1的表达(t=15.64,P=0.001),至诱导3周时表达水平降至低.甲状腺激素受体α3mRNA在三碘甲状腺原氨酸诱导后呈下降趋势,2周时接近干细胞状态(F=51.94,P=0.378),此后又降至较低水平.结论:三碘甲状腺原氨酸能诱导神经干细胞分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞,且分化过程中甲状腺激素受体mRNA存在不同时间顺序的表达.
作者：刘春蓉；李兰英；刘奔；臧晓怡；陈祖培 刊期： 2007年第24期
目的:比较脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖的抑制作用.方法:实验于2005-07/2006-03在南昌大学第二附属医院血液病研究所及江西省医学分子重点实验室完成.①实验材料:脐带血9份,由南昌大学第二附属医院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意.正常骨髓9份,由南昌大学第二附属医院血液科门诊及住院患者提供,均附有捐赠同意书.外周血9份,取自正常自愿者.本实验经医学伦理委员会批准.②实验方法:无菌条件下采集脐血、骨髓和正常人外周血,分离单个核细胞.脐血及骨髓单个核细胞以1×109 L-1接种于培养瓶中,加入含体积分数为0.1的小牛血清、1×10-3 mol/L氢化可的松的IMDM培养液,7 d后换液,去除悬浮细胞,以后每3～4 d换液1次,待细胞90%融合后,胰蛋白酶+乙二胺四乙酸混合消化,传代培养,取第3代细胞用于实验.正常人外周血单个核细胞以1×109 L-1接种于培养瓶中,加入含体积分数为0.1的小牛血清、10 mg/L植物血凝素的IMDM液,培养3 d后收集细胞用于实验.③实验评估:采用流式细胞术检测脐血间充质干细胞及淋巴细胞表面分子.取第3代的脐血和骨髓间充质干细胞,体外诱导培养后以脂肪染色液鉴定其向脂肪细胞的分化情况.将不同细胞浓度的脐血和骨髓间充质干细胞分别加入到植物血凝素诱导的外周血淋巴细胞增殖体系中,比较两种不同来源的间充质干细胞对淋巴细胞增殖的调控作用.结果:①脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的培养及鉴定:第3代脐血间充质干细胞表面分子标记率CD29为85.18%,CD166为72.52%,CD54为33.70%,CD45为6.70%,CD13为1.51%,CD34为0.23%.正常人外周血单个核细胞中的CD3+T细胞为60%～70%,CD20+B细胞为3.5%～4.5%.脐血间充质干细胞诱导培养3周,可见呈桔黄色的脂肪细胞.②脐血间充质干细胞及骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制:淋巴细胞:间充质干细胞为1∶1,1∶0.5,1∶0.1,1∶0.05,1∶0.02,1∶0.01时,脐血间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制率分别为(49.5±4.8)%,(58.4±6.0)%,(38.1±4.0)%,(31.4±3.2)%,(24.3±3.2)%,(12.6±6.7)%,而骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制率分别为(52.4±8.4)%,(65.1±9.7)%,(34.7±4.5)%,(13.0±6.4)%,(-10.7±12.6)%,(-43.9±9.4)%.后3种细胞浓度比例脐血间充质干细胞对淋巴细胞的抑制作用明显强于骨髓间充质干细胞(t=7.72,8.14,14.68,P均＜0.05).结论:脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞一样,也具有抑制植物血凝素诱导淋巴细胞增殖的作用,抑制效果与间充质干细胞数量有关.低浓度的脐血间充质干细胞对淋巴细胞的抑制作用明显强于骨髓间充质干细胞.
作者：贺文凤；石庆之；华建媛；李剑；李洁；吴琼 刊期： 2007年第24期
目的:采用无血清培养法从人骨肉瘤细胞株U2-OS中分离肿瘤干细胞,检测肿瘤干细胞特异性标志物Stro-1的表达.方法:实验于2006-02/2007-02在兰州大学第二医院骨科研究所完成.①实验材料:人骨肉瘤细胞株U2-OS由中国科学院细胞库提供;DMEM/F12(1∶1)培养基(Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青公司);PCR引物由上海生物工程公司合成.②实验方法:取原代培养的骨肉瘤细胞经胰蛋白酶消化制备单细胞悬液,用含表皮生长因子20 μg/L、碱性成纤维细胞生长因子20 μg/L、L-谷氨酰胺2 mmol/L、胰岛素4 U/L、青霉素100 U/mL和链霉素100 U/mL,pH 7.2～7.5的无血清DMEM/F12培养基重悬细胞,常规培养5～7 d,待培养基中悬浮的肉瘤细胞球体积较大后,用无血清培养基重新吹打成单细胞悬液,按1∶2或1∶3比例传代.③实验评估:从上述骨肉瘤细胞株中分离出的肿瘤细胞球,用MTT法检测其增殖能力,免疫磁珠分选Stro-1阳性细胞,反转录-聚合酶链法检测Stro-1阳性细胞中Stro-1 mRNA的表达,免疫细胞化学染色的方法检测分化后成骨细胞特异性抗原的表达.结果:①肿瘤干细胞增殖活性:增殖潜伏期约为24 h,传代后1～2 d即可见肿瘤干细胞形成,以后体积逐渐增大.第7天吸光度值高,与0 d吸光度值比较差异有显著性意义(P＜0.01).②免疫磁珠法分选Stro-1阳性细胞:分选的Stro-1+细胞接种于无血清培养基后,24～48 h即可形成和原代肿瘤干细胞球形态一样的干细胞球,而Stro-1-细胞却不能形成肿瘤细胞球.③骨肉瘤干细胞中Stro-1 mRNA的表达:Stro-1+细胞和Stro-1-细胞mRNA扩增产物的吸光度值二者比较差异有显著性意义(P＜0.05).④肿瘤干细胞分化:分化2周的肿瘤干细胞骨形态蛋白及Ⅰ型胶原酶均呈阳性表达.结论:骨肉瘤细胞株中存在骨肉瘤干细胞,并具有自我更新和多向分化的能力.
作者：欧阳振；王栓科；康学文；王翠芳；汪静；郭洪章 刊期： 2007年第24期
目的:观察Survivin基因在人胎儿血中的表达及其意义.方法:实验于2003-10/2004-03在广西医科大学第一附属医院血液科完成.①实验材料:50份胎儿血、40份足月脐带血分别取自广西民族医院及南宁第二人民医院妇产科和本院妇产科,产妇均知情同意,并经医院伦理委员会批准.35份成人外周血为无血液系统疾患的健康献血者.②实验方法:无菌操作条件下取EDTA抗凝骨髓液4 mL,常规分离单个核细胞,洗涤后制备合适密度备用.采用RT-PCR技术对50份孕龄为18～32周人胎儿血、40份足月脐带血和35份成人外周血Survivin基因mRNA表达水平进行检测.结果:①Survivin基因在人胎儿血、脐带血及成人外周血表达阳性率的比较:人胎儿血Survivin基因m RNA表达阳性率高于脐血组,差异有显著性意义(68.0%,47.5%,P＜0.05).②Survivin基因在人胎儿血及脐带血中表达水平的比较:人胎儿血Survivin基因m RNA表达水平高于脐带血,差异有显著性意义(0.575±0.276,0.444±0.626,P＜0.05).③Survivin基因表达水平与孕龄的关系:Survivin基因m RNA表达水平随着孕龄增加有下降趋势,对Survivin基因m RNA表达水平与孕龄的相关性进行直线相关分析,结果显示两者之间存在负相关(r=-0.373,P=0.030).结论:①Survivin基因在人胎儿血及脐带血中均有表达,Survivin基因在人胎儿血中表达水平高于脐带血,在成人外周血中检测不到Survivin基因表达.②随着孕龄增加,人胎儿血中Survivin基因表达水平随之下降.③Survivin基因可能在人胎儿发育过程中起一定作用,具体机制还需进一步研究探讨.
作者：赵卫华；赖永榕；彭志刚；马劼 刊期： 2007年第24期
目的:观察胰岛素生长因子对骨髓基质细胞向成骨细胞分化的调节作用.方法:实验于2005-11/2006-04在广东医学院附院中心实验室进行.①实验材料:重组胰岛素生长因子(GIBCO),DEME培养基(GIBCO),胰蛋白酶(GIBCO),胎牛血清(杭州四季青),二甲基亚砜(sigma),四甲基偶氮噻唑盐(sigma),碱性磷酸酶试剂盒(长城临床试剂公司),骨钙素试剂盒(天津九鼎).SD大鼠由广东医学院动物部提供.②实验方法:骨髓基质细胞的分离:将SD大鼠处死后,无菌条件下取出动物的双侧股骨和胫骨,分离培养骨髓基质细胞.骨髓基质细胞成骨诱导条件:取第2代骨髓基质细胞,用含体积分数为0.1胎牛血清、50 mg/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、10-8 mol/L地塞米松、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素成骨诱导培养液培养,置37 ℃、体积分数为0.05 CO2饱和湿度培养箱内孵育.倒置显微镜观察细胞生长状况.③实验分组:将第3代骨髓基质细胞随机分为对照组和实验组.细胞增殖实验:取第3代生长良好的骨髓基质细胞,密度调整至4×106 L-1.实验组加入含1,10,20 μg/L胰岛素生长因子诱导培养液,对照组加不含胰岛素生长因子诱导培养液.培养1,3,5,7 d后采用MTT法检测细胞增殖水平.用碱性磷酸酶试剂盒在全自动生化分析仪上测定细胞内碱性磷酸酶活性.④实验评估:采用RI测定上清液中骨钙素含量.观察胰岛素生长因子对骨髓基质细胞增殖和向成骨细胞方向分化的调节作用.结果:①MTT法测骨髓基质细胞增殖情况:与对照组相比,实验组具有明显促进骨髓基质细胞增殖作用(吸光度值:1 d,0.442±0.002,0.498±0.009,0.546±0.004,0.553±0.005;3 d,0.571±0.008,0.604±0.007,0.682±0.006,0.694±0.009;5 d,0.623±0.003,0.659±0.004,0.793±0.008,0.807±0.007;7 d,0.792±0.008,0.810+0.006,0.912±0.003,0.923±0.004,P＜0.05).20 μg/L胰岛素生长因子与10 μg/L胰岛素生长因子组的作用效果差异无显著性意义(P＞0.05).实验组随时间延长,对骨髓基质细胞均有明显促进作用.②骨髓基质细胞内碱性磷酸酶、骨钙素合成的变化:实验组细胞胞浆内碱性磷酸酶明显高于对照组,差异有显著性意义(t=3.08,P＜0.05).实验组细胞胞浆内骨钙素明显升高,是对照组的1.8倍,差异有显著性意义(t=2.82,P＜0.05).结论:适当质量浓度胰岛素生长因子能促进经诱导分化骨髓基质细胞的增殖和向成骨细胞方向的分化.
作者：魏波；陈日景 刊期： 2007年第24期
目的:为寻找采集外周血造血干细胞更合适的手段,探讨间断流动式血细胞分离机采集外周血造血干细胞的效果.方法:选择中山大学第五附属医院血液风湿科2004-2006年12例行外周血造血干细胞移植住院患者.①实验对象:供者5例,男1例,女4例,一般状况良好,与患者关系为同胞妹妹3例,同胞弟弟1例,同胞姐姐1例;患者7例,男3例,女4例,23～62岁,7例为自体移植,5例为异基因移植.血液系统疾病患者9例(非霍奇淋巴瘤3例,急性淋巴细胞白血病2例,急性髓细胞白血病2例,慢性粒细胞白血病1例,骨髓增生异常综合征1例);自身免疫性疾病3例(重型系统性红斑狼疮2例,难治复发性类风湿关节炎合并干燥综合征1例).②实验过程:每位供/患者均知情同意并签署知情同意书.对于自体患者,根据患者的疾病类型采取不同的干细胞动员化疗方案,联合化疗后7～10 d,待白细胞下降至低点,一般为≤1.0×109 L-1时,给予粒细胞集落刺激因子5 μg/kg皮下注射,白细胞升至3.0×109 L-1时开始采集;对于allo-PBSCT供者直接给予粒细胞集落刺激因子5μg/kg,皮下注射,1次/d,共5 d,同时应用流式细胞仪检测CD34+细胞数,至白细胞升至≥20.0×109 L-1或当CD34+细胞升高＞20个/μL时采用增强型多功能血细胞分离机PBSC程序卡采集健康供者和患者外周血造血干细胞.③实验评估:分析采集效率、血液学参数、不良事件发生率、以及供、受者ABO血型不合的患者回输干细胞溶血反应等情况.结果:12例供者、患者均进入结果分析.①共进行了24次采集,其中1次采集1例,2次采集7例,3次采集3例,平均循环次数(25±5)次,采集时间(228±32)min,处理血量(723 4±120 5)mL,复方枸橼酸钠溶液用量为(623±96)mL,干细胞收集量为(102±21)mL,CD34+细胞采集效率为(54.3±30.7)%,细胞计数示白细胞为(156±34)×109 L-1,单个核细胞为(79.7±13.2)×109 L-1,流式细胞仪检测CD34+细胞为(10.30±4.38)×106/kg受者体质量.②不良反应轻微,24次采集过程中出现不良反应6次均为枸橼酸盐所致低钙血症反应.血红蛋白和血小板与采集前相比分别下降9.36%和11.10%.供、受者ABO血型不合的3例患者在输注造血干细胞悬液后均未出现溶血反应.③12例均获造血功能重建,无移植相关死亡.结论:用间断流动式血细胞分离机采集外周血造血干细胞效果良好,不良反应轻微,能有效的减少被采集者红细胞、血小板的丢失,对供、受者ABO血型不合者不需去除造血干细胞悬液中的红细胞,值得临床应用.
作者：何志国；侯丽君；李碧香；徐景勃；曾林涓 刊期： 2007年第24期
目的:观察急性髓性白血病经混合造血干细胞移植后,应用供者淋巴细胞输注+白细胞介素2治疗的效果,并与移植后未经特殊治疗的效果进行比较.方法:①选取2000-01/2004-07解放军兰州军区兰州总医院全军血液病中心收治的19例急性髓性白血病患者,实验经医院伦理委员会批准,患者均知情同意.随机数字表法分为两组:观察组8例,年龄17～40岁,M2a 4例,M4 1例,M5a 3例;对照组11例,年龄19～39岁,M2a 2例,M3a 2例,M4 3例,M5a 4例.②两组患者采用化疗联合重组人粒细胞集落刺激因子的方法动员自体外周血造血干细胞,采集后液氮中保存5 d备用.③术前采用直线加速器对患者全身及肺部照射,预处理完毕后实施混合造血干细胞移植.首先回输自体单个核细胞中位数为4×108/kg,CD34+细胞中位数为6.2×106/kg,粒-巨噬祖细胞集落形成单位中位数为5.8×104/kg.间隔1～6 h后,采集人类白细胞抗原半相合异体骨髓,按回输自体单个核细胞数的1/6～1/10输注给患者.④两组患者移植期间均住无菌层流病房,给予相应并发症的防治及支持治疗.在粒细胞降至0时注射重组人粒细胞集落刺激因子150 μg/12 h,促进造血恢复.观察组给予供者淋巴细胞输注+白细胞介素2治疗,每次采集的供者淋巴细胞中,CD3+淋巴细胞中位数为1.43×108/kg,CD4+细胞中位数为0.97×108/kg,CD8+细胞中位数为0.41×108/kg,中位治疗次数4(1～7)次,回输后即开始应用100 wu/d重组人白细胞介素2,共10 d.对照组混合造血干细胞移植后未给予特殊治疗.结果:19例急性髓性白血病患者均进入结果分析.①造血恢复:两组患者均获得造血重建,术后4～9 d粒细胞均降至0,12～17 d粒细胞达0.5×109 L-1,16～21 d白细胞达4.0×108 L-1,19～23 d血小板达20×108 L-1.16～21 d骨髓检查示恢复期骨髓象.②术后并发症:两组患者不同程度地出现口腔溃疡,随着造血恢复,7～10 d溃疡消失.观察组1例患者出现出血性膀胱炎,两组各2例患者出现发热.无肝静脉闭塞病和移植物抗宿主病发生.③嵌合体形成:观察组中1例M4患者形成嵌合体,对照组中2例M4患者与1例M5患者形成嵌合体,嵌合体持续存在3～12个月.④供者淋巴细胞输注+白细胞介素2疗效:观察组中有1例M2a患者在接受2次特殊治疗后7个月复发死亡;1例M2a患者接受2次特殊治疗后1年出现骨髓增生异常综合征,脑出血死亡,1例M5a患者应用特殊治疗1次后出现不明原因高热、抽搐,死于癫痫持续状态,其余5例患者随访2年均健康存活,长期生存率为62.5%(5/8).对照组有2例M2a患者、2例M4患者、1例M5患者于移植后1～7个月复发死亡,1例M3患者于移植后25 d死于脑出血,其余2例M3患者、2例M4患者、1例M5患者随访2年均健康存活,长期生存率为45.4%(5/11).结论:混合造血干细胞移植后应用供者淋巴细胞输注+白细胞介素2治疗,急性髓性白血病患者均获得造血重建且无移植物抗宿主病发生,其长期生存率有效提高.
作者：王存邦；白海；欧英贤；潘耀柱；张茜；葸瑞 刊期： 2007年第24期
目的:评价亲缘异基因造血干细胞移植与酪氨酸激酶抑制剂STI571治疗非慢性期慢性粒细胞白血病的有效性及安全性.方法:①对象:所有患者在治疗前均经骨髓细胞学、细胞遗传学和/或分子遗传学检查确诊为加速或急变期慢性粒细胞白血病.实验经医学伦理委员会批准,患者均知情同意.STI571治疗组23例患者,男13例,女10例,平均年龄32岁,2002-04/2006-06陆续开始应用STI571,观察截止时间为2006-10,平均用药17.5个月.造血干细胞移植组7例患者,1999-07/2006-04收治,男6例,女1例,平均年龄35.4岁;健康亲缘性异基因造血干细胞供者7例,均与受者经HLA配型证实为全相合.②STI571治疗:23例患者每日口服STI571 600 mg,此过程未给予其他治疗慢性粒细胞白血病的药物.出现以下任一情况药量增至800 mg:治疗3个月仍未达到血液学完全缓解;达到血液学缓解后复发;达到主要遗传学缓解后复发.出现以下任一情况给予停药或减量:中性粒细胞＜1×109 L-1或血小板＜50×109 L-1;出现≥Ⅱ级非血液学不良反应.每周复查血常规,根据血象和骨髓象凋整剂量,每3个月进行骨髓象及细胞遗传学检查.③干细胞移植的相关干预方案:7例患者均采用经典/改良BuCy2方案进行预处理,再给予短程甲氨蝶呤联合环孢菌素A方案预防移植物抗宿主病,其中部分患者加用抗淋巴细胞球蛋白预防移植物抗宿主病.环孢菌素A于移植前1 d以10 mg/(kg·d)分2次口服,并逐渐调整其血浓度至200～400 μg/L;移植后1 d静脉注射甲氨蝶呤15 mg/m2,移植后3,6,11 d静脉注射甲氨蝶呤10 mg/m2.④有效性评估:包括血液学效应(血液学完全缓解、部分缓解、未缓解)、血液学复发及疾病进展、细胞遗传学反应(根据Ph+细胞所占比例分为完全缓解、大部分缓解、小部分缓解、微缓解、不缓解、主要遗传学反应、遗传学复发).⑤安全性评估:按WHO不良反应分度标准分为0～4度.结果:30例患者均进入结果分析.①血液学和细胞遗传学效应:STI571治疗组23例患者均可评价血液学和细胞遗传学效应,12例(52.2%)保持血液学完全缓解,5例(21.7%)发生主要遗传学效应,其中4例(17.4%)为遗传学完全缓解.造血干细胞移植组7例患者于移植后3～6个月均可评价血液学和细胞遗传学效应,且获得血液学和细胞遗传学完全缓解,与STI571治疗组比较差异有显著性意义(P＜0.05).②两组患者的生存情况:两组患者的总体存活率行Kaplan-Meier法比较,差异无显著性意义(x2=0.04,P=0.85).③不良事件与副反应:STI571治疗组在治疗期间,没有患者因药物不良副作用而停药、死亡,7例(30.4%)患者发生Ⅲ/Ⅳ级白细胞和/或血小板减少.造血干细胞移植组2例(28.6%)发生Ⅲ～Ⅳ度急性移植物抗宿主病,3例(42.9%)发生慢性移植物抗宿主病,给予相应治疗后3例无效死亡;移植60 d内发生细菌或真菌感染4例,监测出巨细胞病毒血症2例,经治疗后均得到控制;2例患者发生出血性膀胱炎,经治疗后病情缓解.结论:亲缘异基因造血干细胞移植后血液学完全缓解率、细胞遗传学完全缓解率显著优于STI571治疗,但两种方法终的患者生存率基本相似.
作者：黎纬明；夏凌辉；游泳；刘新月；仲照东；邹萍 刊期： 2007年第24期
目的:观察成人外周血来源的单个核细胞在体外培养过程中形态、增殖能力和表面抗原的变化.方法:实验于2006-08/2007-02在广州南方医院完成.①实验材料:健康志愿者肘静脉血20份,年龄20～26岁,对本实验均知情同意.②实验方法:密度梯度离心健康成人肘静脉血得到单个核细胞,以(2～3)×106/cm2的密度接种于人纤维连接蛋白包被的6孔板,在含有人血管内皮细胞生长因子的M199培养基中进行培养,第4天首次换液,后每3 d换液一次.③实验评估:第3天起观察细胞的形态及数量,分别对培养至第7,21天的贴壁细胞行流式细胞学分析及免疫组化染色检查.结果:①培养细胞的形态学观察:外周血来源单个核细胞接种后约有1/20贴壁,第4天左右可形成从中心向外放射的典型细胞集落,第7天有大量长梭形、双极针样细胞生长.培养第2周长梭形细胞开始凋亡,数量减少,同时出现大量椭圆形鹅卵石样细胞.至第3周鹅卵石样细胞己占据生长优势且增殖旺盛,长梭形细胞基本消失.②内皮祖细胞表面标志的变化:原代培养第7天,贴壁细胞表达与单核巨噬细胞系相关的表面抗原CD44(96.3%)、CD45(83.9%)、CD11c(63.7%)、CD14(11.9%),弱表达内皮细胞相关抗原flk-1(18.2%)、CD31(6.7%)、vWF(3.6%);第21天CD44表达下降至57.6%,而内皮细胞相关抗原CD31表达增加至67.2%,vWF增加至14.2%;造血干细胞相关抗原CD34始终呈阴性表达.免疫组化染色结果与流式细胞分析结果一致.结论:成人外周血中存在两种不同类型的血管内皮前体细胞,单个核细胞贴壁培养4～7 d左右出现早期内皮祖细胞,2～3周时出现晚期内皮祖细胞.二者的外形、增殖潜能、表面抗原表达均不同.晚期内皮祖细胞是更好的种子细胞来源.
作者：李华；高建华；颜玲；鲁峰；朱茗 刊期： 2007年第24期
目的:采用骨髓间充质干细胞体外向软骨方向诱导分化并和两种载体(胶原海绵和聚乳酸/聚羟乙酸共聚物)混合形成立体培养,对两种不同生物材料的生物相容性进行观察.方法:实验于2005-03/2006-05在华北煤炭医学院中心实验室完成.①实验材料:清洁级成年SD大鼠1只,雌雄不限;聚乳酸/聚羟乙酸共聚物(山东医疗器械研究所高分子室),胶原海绵(上海其胜公司).②实验分组:实验分为3组,即聚乳酸/聚羟乙酸共聚物组、胶原海绵组和平面培养组.③实验干预:取成年大鼠骨髓以密度梯度离心加贴壁分离法纯化分离骨髓间充质干细胞,传至第3代.将细胞以1.5×104/孔定量接种于各组的培养板内,加全培养诱导液[转化生长因子β1 10 μg、碱性成纤维生长因子10 μg、地塞米松100 nmol、维生素C 50 mg、β-甘油磷酸钠10 mmol和ITS 50 mL(牛血清白蛋白,牛转铁蛋白,牛胰岛素及微量元素)].④实验评估:培养1周后,随机取样使用甲苯氨蓝染色和特异性Ⅱ型胶原单克隆抗体免疫组织化学染色后进行检测.培养4周后使用扫描电镜观察细胞在载体上附着和生长的情况.结果:①骨髓间充质干细胞生长情况及形态:3周后倒置相差显微镜观察,可见细胞围绕在材料周边生长,随培养时间的延长,细胞形成均一的椭圆形,各载体组的细胞与平面对照组相似,无细胞衰老及异常分裂现象.②软骨细胞特异性检测:3组间甲苯氨蓝染色和特异性Ⅱ型胶原单克隆抗体免疫组织化学染色差异无显著性.③载体材料扫描电镜观察结果:在两种载体表面,分别有部分细胞黏附在载体表面生长,并在其表面连接成片.结论:胶原海绵和聚乳酸/聚羟乙酸共聚物对大鼠骨髓间充质干细胞在向软骨诱导过程中的细胞功能、细胞生长增殖无影响,两种生物材料具有良好的生物相容性,可作为软骨组织工程的载体材料应用.
作者：张翼；宋敬锋；白俊清；程爱国；张迪 刊期： 2007年第24期
目的:应用高分辨率荧光显微成像系统采集细胞器探针图像,并与激光共聚焦显微成像系统进行对比.方法:实验于2003-05/2004-01在解放军总医院完成.①实验材料:鼠肺毛细血管内皮细胞株(1H11)由上海复旦张江生物公司提供;荧光探针Rhodamine-123,Lucifer Yellow,DiOC6[3],BODIPY(美国Sigma公司).②细胞培养及荧光探针染色:细胞培养采用含体积分数为0.2胎牛血清的低糖DMEM培养基,密度5×107 L-1.选择Rhodamine-123作为细胞线粒体特异性荧光探针,选择DiOC6[3]作为细胞内质网特异性荧光探针,选择BODIPY作为细胞高尔基体特异性荧光探针,选择Lucifer Yellow作为细胞溶酶体探针.前3个探针在完全避光条件下与培养的细胞共同孵育0.5 h,后者则共同孵育15 h.③高分辨率荧光成像系统的图像采集:线粒体荧光图像采集,选取经Rhodamine-123共孵育完成的细胞,选择激发滤色镜为BP460-490,吸收滤色镜为BA515,分光镜为DM500,另加一绿通道液晶滤光片,激发出Rhodamine-123的荧光.电荷耦合器件采集图像并送入计算机.重复上述步骤,采用DiOC6[3]标记内质网,BODIPY标记高尔基体,Lucifer Yellow标记细胞溶酶体,激发条件同Rhodamine-123.分别采集同一视野靶细胞DiOC6[3]、BODIPY或Lucifer Yellow的荧光图像,完成全部图像采集并储存在计算机中.④激光共聚焦显微成像系统的图像采集:选择经4种探针染色的靶细胞,使用氩离子激光器在488 nm激发Rhodamine-123,Rhodamine-123荧光通过配置有530/60-G发射滤光片的通道1探测.重复上述步骤,在488 nm激发DiOC6[3]和BODIPY,在457 nm激发Lucifer yellow,3种荧光均由通道1探测,后2个探针的发射滤光片的配置为515/30-G,DiOC6[3]选择530/60-G.由光电倍增管接收信号并传输入计算机成像.结果:①高分辨率荧光成像系统所采集图像,靶细胞中由荧光探针Rhodamine-123染色的线粒体呈多个典型的小棒状或卵圆状,聚集在核周;Lucifer yellow染色的溶酶体呈多个非对称球型,在胞浆内随机分布,颗粒尺寸通常大于线粒体;荧光探针DiOC6[3]着色的内质网占据胞浆的很大空间,以囊状聚集为特征;BODIPY特异性地结合在高尔基体上,荧光图像显示围绕在细胞核周围呈条索状.②与高分辨率荧光成像系统比较,激光共聚焦显微成像系统所采集的图像其荧光强度基本相同,但分辨率低、细节显示模糊、胞浆中细胞器的准确分布信息和形态特征显示效果欠佳.结论:两种荧光显微成像系统均可采集到细胞器探针的荧光图像.但高分辨率荧光成像系统采集的荧光图像具有细节清晰、分辨度高、准确显示胞浆中细胞器的分布信息和形态特征等优点.
作者：戴维德；李晓松；曾晶；刘凡光；顾瑛 刊期： 2007年第24期
背景:表皮干细胞的研究有相当的成绩,但皮肤移植成活过程中表皮干细胞数量及在皮肤各层中的分布动态变化规律尚需探讨.目的:观察自体全层皮肤移植成活过程中表皮干细胞随其所处微环境的改变及其变化规律.设计:对比观察的前瞻性动物实验.单位:南华大学第一附属医院烧伤整形外科.材料:选用南华大学实验动物中心提供的Wistar大鼠42只,2～3月龄,清洁级,雌雄不拘,体质量200～250 g.饲养1周后按观察时间随机分为7组,术后24 h组,3 d组,5 d组,7 d组,14 d组,21 d组和30 d组,每组6只.抗体:一抗:兔抗鼠整合素β1多克隆抗体(武汉博士德生物公司)小鼠抗大鼠p63单克隆抗体(santa cruz公司);二抗:山羊抗兔lgG(北京中杉生物公司),山羊抗小鼠lgG(北京中杉生物公司);S-P免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒(北京中杉生物公司).方法:实验于2006-05在南华大学动物实验室完成.①所有大鼠背部制作(1.5×1.5)cm2面积的自体全层皮肤移植模型,在不同时间点观察移植皮片的颜色改变,移植皮片下是否有积血、积液,皮片是否与创面粘合.②每只大鼠手术时切取少许皮片立即放入100 g/L中性甲醛中固定并标记为空白对照组.③术后24 h组,3 d组,5 d组,7 d组,14 d组动物分别在相应时间拆开移植皮片固定包,在各创面中央切取皮肤组织固定并标记;术后21 d组和30 d组术后14 d拆包,继续喂养至术后21 d和30 d在移植皮片中央切取皮肤组织.④制作HE染色和免疫组织化学染色病理切片.主要观察指标:①切片中炎症细胞的数量、上皮化程度、纤维细胞的含量.②整合素β1和基因物质p63阳性细胞率.结果:纳入Wistar大鼠42只全部进入结果分析.①创面大体观察:术后一二天颜色苍白、水肿;术后3 d皮片颜色未见有明显的好转,但皮片与创面贴附较紧密;术后7 d皮片颜色明显好转,表皮颜色接近正常,皮片与创面粘连紧密,创面有部分毛根长出;术后14 d皮片创周已经和创面完全愈合;术后30 d皮片颜色较正常稍微深,毛发生长同正常皮肤.②苏木精-伊红染色病理切片观察结果:前4组见皮片内细胞水肿,有少量炎性细胞浸润,术后5 d发现皮片部分角质细胞坏死脱落.③阳性细胞的分布和数量变化规律:整合素β1和基因物质P63阳性细胞在术前主要分布于表皮的基底层和毛囊隆突部,从术后24 h阳性细胞开始在表皮的各层出现,且数量逐渐增多,术后14和21 d在表皮的各层均见到较多的阳性细胞,术后30 d阳性细胞主要分布在表皮的基底层,但在其它各层仍然有少量的阳性细胞出现.免疫组化切片中基因物质P63的阳性细胞数均高于同时限点β1整合素的阳性细胞数,从术后24 h开始减少,到术后3 d达到低点,然后逐渐增加,到术后7 d阳性细胞的比例达到或接近术前,继续增加.术后21 d时阳性细胞比例达到高点,然后又逐渐减低,术后30 d时阳性细胞比例仍高于术前.结论:①表皮干细胞在自体全层皮片移植成活过程中先减少,然后逐渐增加至超过正常皮肤.②自体全层皮肤移植成活过程中,表皮干细胞在皮肤中的排列紊乱,几乎在表皮各层均能见到表皮干细胞;而后又逐渐集中于表皮的基底层和毛囊隆突部.
作者：陶克奇；李利平 刊期： 2007年第24期
目的:观察阳离子脂质体Lipofectamine介导的蛋白激酶Cγ AsODN对原代培养大鼠脑神经元蛋白激酶Cγ mRNA表达及生长的影响.方法:实验于2004-03/08在华中科技大学同济医学院附属同济医院完成.①实验分组:取新生50只SD乳鼠大脑皮质及海马神经元进行原代培养,分为正常对照组,空脂质体转染组,300 nmol/L Lipofectamine-SODN转染组,100 nmol/LLipofectamine-AsODN转染组,300 nmol/L Lipofectamine-AsODN转染组,每组10瓶.②实验方法:培养第4～5天采用脂质体或脂质体包裹的不同浓度的AsODN或SODN蛋白激酶Cγ转染培养神经元.③实验评估:采用倒置显微镜对神经元的生长进行动态观察;免疫组化ABC法进行蛋白激酶Cγ阳性神经元的鉴定;MTT法检测神经元的增殖率;RT-PCR方法检测转染后神经元的蛋白激酶Cγ mRNA的表达变化.结果:①蛋白激酶Cγ阳性神经元呈胞浆内棕褐色染色,胞核不显色.②蛋白激酶Cγ AsODN转染早期呈现促进神经元突起生长,胞体分化的作用.随着反义浓度增加,相对生长指数值升高.而在转染晚期,ASODN蛋白激酶Cγ转染组凋亡率均明显增加.③AsODN蛋白激酶Cγ可降低神经元蛋白激酶Cγ mRNA的表达.结论:蛋白激酶Cγ AsODN可减少神经元蛋白激酶Cγ mRNA的表达,并刺激皮质及海马神经元的增殖及神经突起的生长,这可能与蛋白激酶Cγ对神经元的生长起负性调控作用有关.
作者：万丽；罗爱林；田玉科 刊期： 2007年第24期
外周血造血干细胞移植已越来越多的应用于临床,在干细胞移植治疗过程中,动员和采集足够的造血干细胞是移植成功的关键.重组人粒细胞集落刺激因子是当前外周血造血干细胞动员的主要方法.
作者：吴金艳 刊期： 2007年第24期
目的:观察不同质量浓度转化生长因子β1作用于体外培养小鼠失神经骨骼肌肌源性干细胞后,细胞内结缔组织生长因子生成的变化.方法:实验于2006-03/06在武汉协和医院中心实验室完成.实验材料:清洁级3周龄昆明种小鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供(动物使用许可证:syxk(鄂)2004-0028).实验方法:采用差速贴壁法分离培养并鉴定小鼠失神经骨骼肌肌源性干细胞.取第2代肌源性干细胞,均匀加入6孔培养板中,每孔细胞数为104,置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养2 d后,更换培养液.A～F组每孔加入含有质量浓度0,1,5,10,20,40 μg/L重组人转化生长因子β1的含体积分数为0.2胎牛血清的DMEM培养基后,置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养3 d.G～L组每孔分别加入含有质量浓度为10 μg/L重组人转化生长因子β1的含体积分数为0.2胎牛血清的DMEM培养基后,同样条件培养箱中培养0,3,6,12,24,48 h.实时荧光定量RT-PCR检测结缔组织生长因子mRNA水平,应用Western blot检测结缔组织生长因子蛋白表达变化.结果:①Western blot检测结缔组织生长因子蛋白:可见阳性条带.A～D组平均吸光度比值随转化生长因子β1质量浓度增加而上升,组间差异具有显著性意义(0.854±0.157,1.203±0.144,2.471±0.141,3.652±0.202,P＜0.05),D～F组上升曲线趋于平缓,组间差异无显著性意义(3.652±0.202,3.736±0.216,3.919±0.226,P＞0.05).G～J组平均吸光度比值随转化生长因子β1质量浓度增加而上升,组间差异具有显著性意义(0.788±0.123,1.063±0.143,2.154±0.153,2.997±0.136,P＜0.05),J～L组上升曲线趋于平缓,组间差异无显著性意义.②RT-PCR检测结缔组织生长因子mRNA水平:A～D组结缔组织生长因子mRNA扩增量明显随转化生长因子β1质量浓度升高而上升,差异具有显著性意义(1.713±0.123,1.992+0.143,2.237±0.153,2.859±0.136,P＜0.05),E、F组间差异无显著性意义.G～J组结缔组织生长因子m RNA扩增量明显随转化生长因子β1质量浓度升高而上升,差异具有显著性意义(1.659±0.215,1.897±0.134,2.188±0.259,2.814±0.263,P＜0.05),J～L组间差异无显著性意义(P＞0.05).结论:转化生长因子β1能够促进体外培养小鼠肌源性干细胞生成结缔组织生长因子,在1～10 μg/L质量浓度范围内呈剂量依赖关系,在3～12 h范围内呈时间依赖关系.
作者：聂铭博；陈振兵；洪光祥 刊期： 2007年第24期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
