刘春蓉；李兰英；刘奔；臧晓怡；陈祖培
对本院门诊及住院复发性翼状胬肉患者36例(45眼)行翼状胬肉切除加角膜缘干细胞移植术,并对患者术后疗效进行随访观察.结果随访6个月至3年,仅3例复发,占6.67%,复发率较传统手术方法明显降低,并具有术后创面愈合快、刺激症状轻、并发症少等优点.说明角膜缘干细胞移植术治疗复发性翼状胬肉疗效可靠,可以明显降低手术复发率,适合临床应用.
作者：许和；王丽华；李晓慧；候丽萍 刊期： 2007年第24期
背景:胚胎干细胞是一种高度未分化的全能细胞,在体外培养系统中可扩增并可维持其全能性,是治疗中枢神经损伤具有前途的干细胞之一.目的:观察经诱导的胚胎干细胞移植在小鼠脊髓损伤和小鼠缺氧缺血性脑病中的存活和迁移.设计:完全随机分组设计,对照动物实验.单位:上海第二医科大学发育生物学研究中心实验室.材料:选用C57/BL6J小鼠60只,清洁级,雌雄不拘,其中鼠龄6～8周和7 d的小鼠各30只,均由中科院上海实验动物中心提供(许可证号:SCXK(沪)2003-0003).该项动物实验经过动物伦理委员会批准.小鼠胚胎干细胞株S8,携带LacZ标记基因(上海市发育生物学研究中心提供).X-gal染色试剂(Sigma公司).方法:实验于2002-10/2003-12在上海市发育生物学研究中心实验室完成(上海市重点实验室).①脊髓损伤实验分组:将造模成功的鼠龄6～8周的C57/BL6J16只小鼠随机分为2组:实验组8只,脊髓右侧半切(T12,L1位)后行距损伤约1 cm的椎管内注射诱导胚胎干细胞体外诱导分化的衍生细胞悬液;对照组8只,脊髓右侧半切后在损伤区周围注射PBS.②缺氧缺血性脑病实验分组:将造模成功的鼠龄7 d的C57/BL6J16只小鼠随机分为2组:实验组8只,结扎右侧颈总动脉后将小鼠置入含体积分数0.08氧气和体积分数0.92氮气的密闭容器内,1.5 h后取出;1周后在右侧脑室内注入3 μL诱导胚胎干细胞.对照组8只:在右侧脑室区注射等量的PBS.③移植后观察12周,应用酶学的方法检测Lac-Z标记的经诱导的胚胎干细胞在脊髓和脑内的存活和迁移情况.主要观察指标:胚胎干细胞在中枢神经系统内存活和迁移情况.结果:①胚胎干细胞经体外诱导并移植到脊髓损伤部位后,分化为神经前体细胞,神经前体细胞能在损伤区环境中存活和从损伤区域迁移到远处5 mm,免疫组化证实植入的胚胎干细胞细胞的神经前体细胞能分化为神经元,从形态上证实了胚胎干细胞来源的神经前体细胞与周围组织进行良好的整合.②经诱导的胚胎干细胞注射到小鼠的侧脑室内,胚胎干细胞来源的细胞广泛分布在损伤的海马区、大脑皮质脑室脉络丛及血管内皮等处并与周围组织整合,与周边细胞在形态上类似,表明诱导的胚胎干细胞也能长期存活并远距离迁移.结论:经诱导的胚胎干细胞能在宿主损伤脑和脊髓中存活、迁移,且脑内迁移较脊髓内迁移明显.
作者：石磊；杨建华；李长德；马杰；王裕 刊期： 2007年第24期
目的:向大脑中动脉缺血大鼠植入神经干细胞,探讨电刺激小脑顶核与神经干细胞共移植体对其向神经元分化的影响.方法:实验于2005-08/2006-11在佳木斯大学神经科学研究所完成.①选取同一基因背景大鼠72只,随机数字表法分成3组:神经干细胞移植组、电刺激+神经干细胞组、电刺激+神经干细胞共移植体组,24只/组.②另选取出生24 h内的Wistar鼠1只用于神经干细胞的分离,制备单细胞悬液,调整细胞密度为5×108 L-1,置于10 mg/L的Brdu完全培养液中孵育72 h.神经干细胞共移植体由神经干细胞、层粘连蛋白和血管内皮细胞构成,由本实验室提供并鉴定.③各组大鼠于造模前1 d麻醉后行小脑顶核刺激,以前囟为零点、正中线向后11.6 mm、正中线向右1.2 mm.给予直角方波脉冲刺激,电流强度为50 μA,频率80 Hz,时程1 h.④各组大鼠均采用线栓法建立局灶性脑缺血动物模型.造模1 d后,分别将培养的神经干细胞及共移植体细胞浓度调整为2×1010 L-1,于缺血纹状体侧缺血半暗带区垂直进针,进入5.0 mm后缓慢推入细胞悬液,神经干细胞移植组、电刺激+神经干细胞组移植神经干细胞悬液10 μL,电刺激+神经干细胞共移植体组移植神经干细胞共移植体悬液10 μL,移植速度为0.5 μL/min,留针10 min后缓慢拔针.⑤各组分别于移植后3,7,14,60 d观察神经于细胞移入脑内后分化成神经元的情况.胞核呈绿色荧光、胞质呈红色荧光的为Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞,代表移植入的神经干细胞所分化的神经元.结果:72只同一基因背景大鼠均进入结果分析.①与神经干细胞移植组比较,移植后7,14,60 d电刺激+神经干细胞组、电刺激+神经干细胞共移植体组Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞百分率均明显升高(F=12.44～25.18,P均＜0.05).移植后3,7,14,60 d电刺激+神经干细胞共移植体组Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞百分率均明显高于电刺激+神经干细胞组(F=8.19～25.18,P均＜0.05).②随移植时间的延长,各组Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞形态均逐渐增大,至移植后60 d时细胞周边可见突起.结论:大脑中动脉缺血模型鼠移植入神经干细胞后,电刺激小脑顶核能够对神经干细胞向神经元的分化产生促进作用,且共移植体与电刺激小脑顶核具有协同效应.
作者：金玉玲；谢艳萍；朱晓峰 刊期： 2007年第24期
背景:在一定条件下,胚胎干细胞可诱导分化成为神经前体细胞,当移植到健全或损伤的中枢神经系统后,可以与宿主细胞有效整合,修复重建损伤的神经组织.目的:观察胚胎干细胞诱导的神经前体细胞移植对小鼠脊髓损伤神经功能恢复的影响.设计:随机对照动物实验.单位:上海第二医科大学发育生物学研究中心.材料:选用28只6～8周龄C57/BL6J小鼠,雌雄不限.小鼠胚胎干细胞株S8及携带LacZ标记基因由上海市发育生物学研究中心提供.高糖DMEM、2-巯基乙醇、小鼠白血病抑制因子、丝裂霉素C均来自GIBCO贴壁诱导培养液由上海市发育生物学研究中心提供.方法:实验于2003-04/2004-04在上海第二医科大学发育生物学研究中心实验室完成.采用贴壁诱导法将ES细胞培养诱导分化为神经前体细胞,将小鼠麻醉,在9～10椎骨平面制成脊髓半横断模型,随机摸球法将大鼠分为3组,假手术组(n=9):仅剪除T9-10棘突和椎板后,逐层缝合.干细胞移植组(n=10):脊髓半横断后,行距损伤区域以远约1 cm的椎管内注射细胞.模型组(n=9):脊髓半横断后在损伤邻近区注射DMEM.各组分别于实验后第1,2,4,6,8周采用BBB评分观察各组小鼠神经功能恢复情况,实验后第8周(BBB评分后)利用x-gal染色观察各组脊髓损伤区胚胎干细胞存活和分化情况.X-gal染色干细胞移植组阳性的损伤脊髓部位切片进行荧光免疫组化检测.主要观察指标:①各组小鼠神经功能恢复情况.②各组脊髓损伤区胚胎干细胞存活和分化情况.③荧光免疫组化检测结果.结果:①干细胞移植组第1,2,4周BBB得分,高于模型组(P＜0.01).②脊髓损伤区胚胎干细胞存活和分化情况:干细胞移植组中小鼠的脊髓损伤处组织切片可以发现x-gal染色阳性的细胞,胞浆呈现蓝色,即胚胎干细胞来源的衍生细胞,而假手术组和模型组的脊髓均未见该现象.干细胞移植组损伤脊髓部位植入的胚胎干细胞来源的衍生细胞分布损伤区周围并与周围组织整合,与周边细胞在形态上类似.③干细胞移植组损伤脊髓部位,X-gal染色阳性细胞可表达神经元特异性标志NF,但没有表达GFAP标志.结论:将ES细胞的培养诱导分化为神经前体细胞移植后,能够存活、迁移、并分化为神经元,但改善神经功能情况不明显.
作者：杨建华；王凤华；李长德；王裕；马杰 刊期： 2007年第24期
背景:胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1同属于转化生长因子β超家族,两者在哺乳动物中枢与外周神经系统发育、分化及细胞周期的调节中扮演重要角色.目的:观察胶质细胞源性神经营养因子联合转化生长因子β1体外诱导脊髓源性神经干细胞的分化,并与单一因子诱导培养液比较.设计:对照观察.单位:南方医科大学附属深圳医院中心实验室.材料:选用10只清洁级孕16 d的SD大鼠,由华中科大同济医学院动物中心提供.主要试剂及材料:DMEM/F12,B27(GIBCO);碱性成纤维细胞生长因子,EGF,胶质细胞源性神经营养因子,转化生长因子-β1(PeproTech);胎牛血清(Hyclone);神经巢蛋白(nestin)多抗(武汉博士德);胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多抗,神经丝蛋白(NF-200)单抗(Sigma).方法:实验于2005-10/2006-09在南方医科大学附属深圳医院中心实验室完成.无菌条件下分离大鼠胚胎,进行脊髓源性神经干细胞的分离培养.实验分①基础培养基组:含青霉素、链霉素、两性霉素B及体积分数为0.02 B27添加液的DMEM/F12.原代培养1周后,获取体外稳定增殖的鼠脊髓源性神经干细胞克隆.②对照组:在基础培养基中加入体积分数为O.1的胎牛血清.③碱性成纤维细胞生长因子组.④转化生长因子β1组.⑤胶质细胞源性神经营养因子+转化生长因子β1组.换用诱导培养基,即分别在基础培养基中加入20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2 μg/L转化生长因子β1、10 μg/L胶质细胞源性神经营养因子+2 μg/L转化生长因子β1.①光镜观察在不同因子诱导情况下脊髓源性神经干细胞的分化情况.②免疫细胞化学染色标记检测神经元与星状胶质细胞的表达.③通过荧光激发流式细胞仪分选技术对分化细胞计数,检测不同诱导环境下神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率.主要观察指标:①各组细胞分化的形态学特点.②各组神经干细胞免疫组织化学检测结果.③各组神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率.结果:①细胞分化形态:分化早期可见神经球贴壁,大量细胞向四周爬出,1周后迁徙的大部分细胞完全贴壁,完成分化过程.在细胞密度较低区域可辨认出神经元样细胞、星状胶质样细胞、寡突胶质样细胞.②免疫组织化学检测结果:对照组、转化生长因子β1组存在大量胶质纤维酸性蛋白染色阳性的星状胶质细胞;而碱性成纤维细胞生长因子组及胶质细胞源性神经营养因子+转化生长因子β1组分化的神经元细胞数量较多,神经丝蛋白染色阳性.③神经元及星状胶质细胞的阳性百分比:诱导1周后,胶质细胞源性神经营养因子+转化生长因子β1组神经元阳性百分比高于血清对照组、碱性成纤维细胞生长因子组及转化生长因子β1组(x2=24.15,19.56,25.32,P＜0.05～0.01),星状胶质细胞阳性百分比低于血清对照组及转化生长因子β1组(x2=24.45,23.79,P＜0.01).结论:体外胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1的联合诱导有利于脊髓源性神经干细胞向神经元的分化,说明两者具有协同作用.
作者：高明勇；肖建德；李振宇；闫洪印；白润涛；韩漫夫 刊期： 2007年第24期
目的:采用无血清培养法从人骨肉瘤细胞株U2-OS中分离肿瘤干细胞,检测肿瘤干细胞特异性标志物Stro-1的表达.方法:实验于2006-02/2007-02在兰州大学第二医院骨科研究所完成.①实验材料:人骨肉瘤细胞株U2-OS由中国科学院细胞库提供;DMEM/F12(1∶1)培养基(Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青公司);PCR引物由上海生物工程公司合成.②实验方法:取原代培养的骨肉瘤细胞经胰蛋白酶消化制备单细胞悬液,用含表皮生长因子20 μg/L、碱性成纤维细胞生长因子20 μg/L、L-谷氨酰胺2 mmol/L、胰岛素4 U/L、青霉素100 U/mL和链霉素100 U/mL,pH 7.2～7.5的无血清DMEM/F12培养基重悬细胞,常规培养5～7 d,待培养基中悬浮的肉瘤细胞球体积较大后,用无血清培养基重新吹打成单细胞悬液,按1∶2或1∶3比例传代.③实验评估:从上述骨肉瘤细胞株中分离出的肿瘤细胞球,用MTT法检测其增殖能力,免疫磁珠分选Stro-1阳性细胞,反转录-聚合酶链法检测Stro-1阳性细胞中Stro-1 mRNA的表达,免疫细胞化学染色的方法检测分化后成骨细胞特异性抗原的表达.结果:①肿瘤干细胞增殖活性:增殖潜伏期约为24 h,传代后1～2 d即可见肿瘤干细胞形成,以后体积逐渐增大.第7天吸光度值高,与0 d吸光度值比较差异有显著性意义(P＜0.01).②免疫磁珠法分选Stro-1阳性细胞:分选的Stro-1+细胞接种于无血清培养基后,24～48 h即可形成和原代肿瘤干细胞球形态一样的干细胞球,而Stro-1-细胞却不能形成肿瘤细胞球.③骨肉瘤干细胞中Stro-1 mRNA的表达:Stro-1+细胞和Stro-1-细胞mRNA扩增产物的吸光度值二者比较差异有显著性意义(P＜0.05).④肿瘤干细胞分化:分化2周的肿瘤干细胞骨形态蛋白及Ⅰ型胶原酶均呈阳性表达.结论:骨肉瘤细胞株中存在骨肉瘤干细胞,并具有自我更新和多向分化的能力.
作者：欧阳振；王栓科；康学文；王翠芳；汪静；郭洪章 刊期： 2007年第24期
目的:分析人脐带血间质干细胞分离培养方法及临床应用的安全性.方法:实验于2005-04/12在河南省红十字血液中心和郑州市第二人民医院完成.实验方法:①无菌条件下将脐带血液采集到无菌采血袋内,产妇及其家属均知情同意,并经医院伦理委员会批准.随机抽查62份样本,单份采集量80～160 mL,计数有核细胞.②以1∶1体积比将Ficoll-Hypaque混合溶液加入四联袋主袋内,将四联袋与脐带血收集袋相连,再将样本血液沿袋壁缓慢加入四联袋主袋内的液面上.离心后将四联袋主袋放在分浆夹上,袋内液体自上而下分为血浆血小板层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层、多核细胞层、红细胞层5层.将血浆血小板层上2/3液体挤压入四联袋一空袋内,将剩余的血浆血小板层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层上部挤压入四联袋另一空袋内,即为富含有核细胞液体.③随机选择本院2005-04/12收治脑卒中后遗症患者10例.男9例,女1例,35～75岁,病程3个月～7年.诊断均由CT、MRI检查证实,符合第四届全国脑血管病学术会议修订的脑卒中诊断标准,患者均对治疗方案知情同意.将脐带血间充质于细胞经静脉输注入患者体内,每次输注1份,每例患者平均输注6份,每份间隔时间平均4 d.于治疗前和治疗3个月后评价患者神经功能状态、肢体运动功能及日常生活活动能力.采用脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准评估神经功能,分数越低,神经功能状态越好;采用Fugl-Meyer评估患侧肢体运动功能,分数越高,肢体运动功能越好;采用Barthel指数评估日常生活活动能力,分数越高,日常生活活动能力越高.结果:①分离的62份脐血间质干细胞,每份含有有核细胞(3.62±2.39)×109,红细胞残余量为(1.64±1.25)×109,CD34+细胞的比率为(2.31±0.93)%,CD133±的比率为(1.36±1.23)%.培养7 d后贴壁细胞为(3.27+1.85)×107,CD133+比率为(8.21±2.46)%.②患者治疗前与治疗3个月后相比,神经功能状态、肢体运动功能及日常生活活动能力评分均明显升高(治疗前:25.40±6.09,31.90±21.85,36.20±19.41;治疗后:1.90±5.09,80.9±25.00,81.10±15.93,P＜0.01).未发现免疫排斥及不良反应.结论:①利用多联袋无菌制备脐血间质干细胞分离效果良好,分离过程在密闭系统进行,单个核细胞和间质干细胞能满足临床需要,适合患者静脉输注和局部直接应用,方法简便安全可靠.②经静脉输注后,疗效确切,能明显改善脑卒中后遗症作用.
作者：李建斌；满勇；单泓；赵林娜；段艳丽 刊期： 2007年第24期
目的:应用高分辨率荧光显微成像系统采集细胞器探针图像,并与激光共聚焦显微成像系统进行对比.方法:实验于2003-05/2004-01在解放军总医院完成.①实验材料:鼠肺毛细血管内皮细胞株(1H11)由上海复旦张江生物公司提供;荧光探针Rhodamine-123,Lucifer Yellow,DiOC6[3],BODIPY(美国Sigma公司).②细胞培养及荧光探针染色:细胞培养采用含体积分数为0.2胎牛血清的低糖DMEM培养基,密度5×107 L-1.选择Rhodamine-123作为细胞线粒体特异性荧光探针,选择DiOC6[3]作为细胞内质网特异性荧光探针,选择BODIPY作为细胞高尔基体特异性荧光探针,选择Lucifer Yellow作为细胞溶酶体探针.前3个探针在完全避光条件下与培养的细胞共同孵育0.5 h,后者则共同孵育15 h.③高分辨率荧光成像系统的图像采集:线粒体荧光图像采集,选取经Rhodamine-123共孵育完成的细胞,选择激发滤色镜为BP460-490,吸收滤色镜为BA515,分光镜为DM500,另加一绿通道液晶滤光片,激发出Rhodamine-123的荧光.电荷耦合器件采集图像并送入计算机.重复上述步骤,采用DiOC6[3]标记内质网,BODIPY标记高尔基体,Lucifer Yellow标记细胞溶酶体,激发条件同Rhodamine-123.分别采集同一视野靶细胞DiOC6[3]、BODIPY或Lucifer Yellow的荧光图像,完成全部图像采集并储存在计算机中.④激光共聚焦显微成像系统的图像采集:选择经4种探针染色的靶细胞,使用氩离子激光器在488 nm激发Rhodamine-123,Rhodamine-123荧光通过配置有530/60-G发射滤光片的通道1探测.重复上述步骤,在488 nm激发DiOC6[3]和BODIPY,在457 nm激发Lucifer yellow,3种荧光均由通道1探测,后2个探针的发射滤光片的配置为515/30-G,DiOC6[3]选择530/60-G.由光电倍增管接收信号并传输入计算机成像.结果:①高分辨率荧光成像系统所采集图像,靶细胞中由荧光探针Rhodamine-123染色的线粒体呈多个典型的小棒状或卵圆状,聚集在核周;Lucifer yellow染色的溶酶体呈多个非对称球型,在胞浆内随机分布,颗粒尺寸通常大于线粒体;荧光探针DiOC6[3]着色的内质网占据胞浆的很大空间,以囊状聚集为特征;BODIPY特异性地结合在高尔基体上,荧光图像显示围绕在细胞核周围呈条索状.②与高分辨率荧光成像系统比较,激光共聚焦显微成像系统所采集的图像其荧光强度基本相同,但分辨率低、细节显示模糊、胞浆中细胞器的准确分布信息和形态特征显示效果欠佳.结论:两种荧光显微成像系统均可采集到细胞器探针的荧光图像.但高分辨率荧光成像系统采集的荧光图像具有细节清晰、分辨度高、准确显示胞浆中细胞器的分布信息和形态特征等优点.
作者：戴维德；李晓松；曾晶；刘凡光；顾瑛 刊期： 2007年第24期
背景:表皮干细胞的研究有相当的成绩,但皮肤移植成活过程中表皮干细胞数量及在皮肤各层中的分布动态变化规律尚需探讨.目的:观察自体全层皮肤移植成活过程中表皮干细胞随其所处微环境的改变及其变化规律.设计:对比观察的前瞻性动物实验.单位:南华大学第一附属医院烧伤整形外科.材料:选用南华大学实验动物中心提供的Wistar大鼠42只,2～3月龄,清洁级,雌雄不拘,体质量200～250 g.饲养1周后按观察时间随机分为7组,术后24 h组,3 d组,5 d组,7 d组,14 d组,21 d组和30 d组,每组6只.抗体:一抗:兔抗鼠整合素β1多克隆抗体(武汉博士德生物公司)小鼠抗大鼠p63单克隆抗体(santa cruz公司);二抗:山羊抗兔lgG(北京中杉生物公司),山羊抗小鼠lgG(北京中杉生物公司);S-P免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒(北京中杉生物公司).方法:实验于2006-05在南华大学动物实验室完成.①所有大鼠背部制作(1.5×1.5)cm2面积的自体全层皮肤移植模型,在不同时间点观察移植皮片的颜色改变,移植皮片下是否有积血、积液,皮片是否与创面粘合.②每只大鼠手术时切取少许皮片立即放入100 g/L中性甲醛中固定并标记为空白对照组.③术后24 h组,3 d组,5 d组,7 d组,14 d组动物分别在相应时间拆开移植皮片固定包,在各创面中央切取皮肤组织固定并标记;术后21 d组和30 d组术后14 d拆包,继续喂养至术后21 d和30 d在移植皮片中央切取皮肤组织.④制作HE染色和免疫组织化学染色病理切片.主要观察指标:①切片中炎症细胞的数量、上皮化程度、纤维细胞的含量.②整合素β1和基因物质p63阳性细胞率.结果:纳入Wistar大鼠42只全部进入结果分析.①创面大体观察:术后一二天颜色苍白、水肿;术后3 d皮片颜色未见有明显的好转,但皮片与创面贴附较紧密;术后7 d皮片颜色明显好转,表皮颜色接近正常,皮片与创面粘连紧密,创面有部分毛根长出;术后14 d皮片创周已经和创面完全愈合;术后30 d皮片颜色较正常稍微深,毛发生长同正常皮肤.②苏木精-伊红染色病理切片观察结果:前4组见皮片内细胞水肿,有少量炎性细胞浸润,术后5 d发现皮片部分角质细胞坏死脱落.③阳性细胞的分布和数量变化规律:整合素β1和基因物质P63阳性细胞在术前主要分布于表皮的基底层和毛囊隆突部,从术后24 h阳性细胞开始在表皮的各层出现,且数量逐渐增多,术后14和21 d在表皮的各层均见到较多的阳性细胞,术后30 d阳性细胞主要分布在表皮的基底层,但在其它各层仍然有少量的阳性细胞出现.免疫组化切片中基因物质P63的阳性细胞数均高于同时限点β1整合素的阳性细胞数,从术后24 h开始减少,到术后3 d达到低点,然后逐渐增加,到术后7 d阳性细胞的比例达到或接近术前,继续增加.术后21 d时阳性细胞比例达到高点,然后又逐渐减低,术后30 d时阳性细胞比例仍高于术前.结论:①表皮干细胞在自体全层皮片移植成活过程中先减少,然后逐渐增加至超过正常皮肤.②自体全层皮肤移植成活过程中,表皮干细胞在皮肤中的排列紊乱,几乎在表皮各层均能见到表皮干细胞;而后又逐渐集中于表皮的基底层和毛囊隆突部.
作者：陶克奇；李利平 刊期： 2007年第24期
目的:选择合适的细胞外基质,利用脑微血管内皮细胞、细胞外基质与神经干神胞构建神经干细胞共移植体,以提高移植神经干神胞向神经元的分化率.方法:实验于2005-11/2006-10在佳木斯大学神经病研究所免疫组织化学研究实验室完成.①实验材料:同一基因背景出生2 h～7 d清洁级Wistar大鼠由哈尔滨医科大学实验动物学部提供.取出生24 h内Wistar大鼠大脑制备神经干细胞,采用免疫组织化学法和免疫荧光法做nestin染色鉴定;取出生1～7 d Wistar大鼠大脑制备脑微血管内皮细胞,采用免疫细胞化学方法鉴定.②实验方法:不同细胞外基质的筛选:将多聚赖氨酸、层黏连蛋白和Matrigel分别与神经干细胞和脑微血管内皮细胞混合培养,接种于铺有盖玻片的6孔板中,并加入神经干细胞完全培养液,每3 d换半量液,7 d换全液.采用免疫组织化学观察抗微管相关蛋白阳性细胞.进行神经干细胞共移植体构建及检测.③实验评估:利用免疫荧光方法,以Ⅷ因子标记物标记脑微血管内皮细胞,用nestin标记神经干细胞,检测共移植体.结果:①神经干细胞和脑微血管内皮细胞形态学观察及鉴定:原代分离的单神经干细胞4 d增生为神经细胞球,传代后,经nestin免疫荧光染色,细胞球呈阳性;原代培养脑微血管内皮细胞6～8 d长满瓶壁,细胞呈多角形或扁平梭形,核卵圆形,Ⅷ因子相关抗原阳性.②3种细胞外基质对神经干细胞分化的影响:层黏连蛋白与两种细胞共培养,抗微管相关蛋白阳性细胞数明显高于Matrigel组和多聚赖氨酸组(P＜0.01).③共移植体活细胞镜下及免疫荧光结果所见:镜下可见共移植体细胞团不规则,神经干细胞被脑微血管内皮细胞包绕或相互连贴,脑微血管内皮细胞核大,胞体不规则,明显大于神经干细胞,神经干细胞折光性强.在200倍视野下,随机选取100个共移植体进行细胞计数,可见平均细胞数为8～15个,其中脑微血管内皮细胞数平均2.8个.免疫荧光可见红色Ⅷ因子阳性脑微血管内皮细胞包被绿色nestin阳性神经干细胞,或相互粘贴.结论:以脑微血管内皮细胞为支持细胞,用层黏连蛋白为细胞外基质可以成功构建神经干细胞共移植体.
作者：朱晓峰；齐志国；张晓梅 刊期： 2007年第24期
背景:三碘甲状腺原氨酸是脑发育临界期的重要调控因素,在中枢神经系统发育过程中可能决定着神经干细胞的世系分化命运.目的:观察三碘甲状腺原氨酸诱导人神经干细胞分化情况以及分化过程中甲状腺激素受体mRNA的表达变化.设计:开放性实验.单位:天津市武警医学院病理教研室,天津医科大学内分泌研究所.材料:实验于2003-01/2005-03在天津医科大学完成.由天津医科大学总医院提供孕10～12周流产胎儿,产妇及家属均签署知情同意书,实验经医学伦理委员会批准.方法:①无菌条件下取人胚胎两侧大脑半球,剥除脑膜,剪碎脑组织,过滤制备细胞悬液.以20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子+30 nmol/L三碘甲状腺原氨酸联合诱导神经干细胞增殖,按1×109 L-1密度分别接种于涂有多聚左旋赖氨酸的24孔板和25 mL培养瓶中常规培养,培养液为含N2添加剂的DMEM/F12无血清培养基.48 h后半量换液,7 d后撤除碱性成纤维细胞生长因子,单独用三碘甲状腺原氨酸诱导分化.②培养1,2,3周时取细胞,RT-PCR半定量检测神经干细胞诱导分化不同阶段甲状腺激素受体mRNA表达的变化,免疫细胞化学鉴定分化后的细胞类型.主要观察指标:①三碘甲状腺原氨酸诱导神经干细胞分化前后细胞形态观察及类型鉴定.②神经干细胞分化过程中甲状腺激素受体mRNA表达的变化.结果:①诱导前细胞呈圆形,表面光滑,并逐渐聚集成神经细胞球,Nestin单染及Nestin+BrdU双染均呈免疫细胞化学反应阳性.三碘甲状腺原氨酸诱导分化1周时,细胞大多呈单极或双极,有细长突起,神经丝蛋白、胶质纤维酸蛋白、半乳糖脑苷免疫细胞化学染色呈阳性;诱导3周后可见细胞核呈圆形,突起多且粗,细胞整体呈蜘蛛状,髓鞘碱性蛋白阳性率达80%.②甲状腺激素受体α1mRNA在诱导前神经干细胞状态时表达量高,三碘甲状腺原氨酸诱导后表达量逐渐下降,至2周时达低,此后表达量有所回升,但仍低于神经干细胞状态(F=32.49,P=0.008).甲状腺激素受体α2mRNA表达变化趋势与甲状腺激素受体α1相同.甲状腺激素受体β1mRNA在神经干细胞状态时表达量低,三碘甲状腺原氨酸诱导后表达量逐渐升高,2周时达高,且超过同时间点甲状腺激素受体α1的表达(t=15.64,P=0.001),至诱导3周时表达水平降至低.甲状腺激素受体α3mRNA在三碘甲状腺原氨酸诱导后呈下降趋势,2周时接近干细胞状态(F=51.94,P=0.378),此后又降至较低水平.结论:三碘甲状腺原氨酸能诱导神经干细胞分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞,且分化过程中甲状腺激素受体mRNA存在不同时间顺序的表达.
作者：刘春蓉；李兰英；刘奔；臧晓怡；陈祖培 刊期： 2007年第24期
目的:观察Survivin基因在人胎儿血中的表达及其意义.方法:实验于2003-10/2004-03在广西医科大学第一附属医院血液科完成.①实验材料:50份胎儿血、40份足月脐带血分别取自广西民族医院及南宁第二人民医院妇产科和本院妇产科,产妇均知情同意,并经医院伦理委员会批准.35份成人外周血为无血液系统疾患的健康献血者.②实验方法:无菌操作条件下取EDTA抗凝骨髓液4 mL,常规分离单个核细胞,洗涤后制备合适密度备用.采用RT-PCR技术对50份孕龄为18～32周人胎儿血、40份足月脐带血和35份成人外周血Survivin基因mRNA表达水平进行检测.结果:①Survivin基因在人胎儿血、脐带血及成人外周血表达阳性率的比较:人胎儿血Survivin基因m RNA表达阳性率高于脐血组,差异有显著性意义(68.0%,47.5%,P＜0.05).②Survivin基因在人胎儿血及脐带血中表达水平的比较:人胎儿血Survivin基因m RNA表达水平高于脐带血,差异有显著性意义(0.575±0.276,0.444±0.626,P＜0.05).③Survivin基因表达水平与孕龄的关系:Survivin基因m RNA表达水平随着孕龄增加有下降趋势,对Survivin基因m RNA表达水平与孕龄的相关性进行直线相关分析,结果显示两者之间存在负相关(r=-0.373,P=0.030).结论:①Survivin基因在人胎儿血及脐带血中均有表达,Survivin基因在人胎儿血中表达水平高于脐带血,在成人外周血中检测不到Survivin基因表达.②随着孕龄增加,人胎儿血中Survivin基因表达水平随之下降.③Survivin基因可能在人胎儿发育过程中起一定作用,具体机制还需进一步研究探讨.
作者：赵卫华；赖永榕；彭志刚；马劼 刊期： 2007年第24期
目的:评价亲缘异基因造血干细胞移植与酪氨酸激酶抑制剂STI571治疗非慢性期慢性粒细胞白血病的有效性及安全性.方法:①对象:所有患者在治疗前均经骨髓细胞学、细胞遗传学和/或分子遗传学检查确诊为加速或急变期慢性粒细胞白血病.实验经医学伦理委员会批准,患者均知情同意.STI571治疗组23例患者,男13例,女10例,平均年龄32岁,2002-04/2006-06陆续开始应用STI571,观察截止时间为2006-10,平均用药17.5个月.造血干细胞移植组7例患者,1999-07/2006-04收治,男6例,女1例,平均年龄35.4岁;健康亲缘性异基因造血干细胞供者7例,均与受者经HLA配型证实为全相合.②STI571治疗:23例患者每日口服STI571 600 mg,此过程未给予其他治疗慢性粒细胞白血病的药物.出现以下任一情况药量增至800 mg:治疗3个月仍未达到血液学完全缓解;达到血液学缓解后复发;达到主要遗传学缓解后复发.出现以下任一情况给予停药或减量:中性粒细胞＜1×109 L-1或血小板＜50×109 L-1;出现≥Ⅱ级非血液学不良反应.每周复查血常规,根据血象和骨髓象凋整剂量,每3个月进行骨髓象及细胞遗传学检查.③干细胞移植的相关干预方案:7例患者均采用经典/改良BuCy2方案进行预处理,再给予短程甲氨蝶呤联合环孢菌素A方案预防移植物抗宿主病,其中部分患者加用抗淋巴细胞球蛋白预防移植物抗宿主病.环孢菌素A于移植前1 d以10 mg/(kg·d)分2次口服,并逐渐调整其血浓度至200～400 μg/L;移植后1 d静脉注射甲氨蝶呤15 mg/m2,移植后3,6,11 d静脉注射甲氨蝶呤10 mg/m2.④有效性评估:包括血液学效应(血液学完全缓解、部分缓解、未缓解)、血液学复发及疾病进展、细胞遗传学反应(根据Ph+细胞所占比例分为完全缓解、大部分缓解、小部分缓解、微缓解、不缓解、主要遗传学反应、遗传学复发).⑤安全性评估:按WHO不良反应分度标准分为0～4度.结果:30例患者均进入结果分析.①血液学和细胞遗传学效应:STI571治疗组23例患者均可评价血液学和细胞遗传学效应,12例(52.2%)保持血液学完全缓解,5例(21.7%)发生主要遗传学效应,其中4例(17.4%)为遗传学完全缓解.造血干细胞移植组7例患者于移植后3～6个月均可评价血液学和细胞遗传学效应,且获得血液学和细胞遗传学完全缓解,与STI571治疗组比较差异有显著性意义(P＜0.05).②两组患者的生存情况:两组患者的总体存活率行Kaplan-Meier法比较,差异无显著性意义(x2=0.04,P=0.85).③不良事件与副反应:STI571治疗组在治疗期间,没有患者因药物不良副作用而停药、死亡,7例(30.4%)患者发生Ⅲ/Ⅳ级白细胞和/或血小板减少.造血干细胞移植组2例(28.6%)发生Ⅲ～Ⅳ度急性移植物抗宿主病,3例(42.9%)发生慢性移植物抗宿主病,给予相应治疗后3例无效死亡;移植60 d内发生细菌或真菌感染4例,监测出巨细胞病毒血症2例,经治疗后均得到控制;2例患者发生出血性膀胱炎,经治疗后病情缓解.结论:亲缘异基因造血干细胞移植后血液学完全缓解率、细胞遗传学完全缓解率显著优于STI571治疗,但两种方法终的患者生存率基本相似.
作者：黎纬明；夏凌辉；游泳；刘新月；仲照东；邹萍 刊期： 2007年第24期
目的:比较脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖的抑制作用.方法:实验于2005-07/2006-03在南昌大学第二附属医院血液病研究所及江西省医学分子重点实验室完成.①实验材料:脐带血9份,由南昌大学第二附属医院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意.正常骨髓9份,由南昌大学第二附属医院血液科门诊及住院患者提供,均附有捐赠同意书.外周血9份,取自正常自愿者.本实验经医学伦理委员会批准.②实验方法:无菌条件下采集脐血、骨髓和正常人外周血,分离单个核细胞.脐血及骨髓单个核细胞以1×109 L-1接种于培养瓶中,加入含体积分数为0.1的小牛血清、1×10-3 mol/L氢化可的松的IMDM培养液,7 d后换液,去除悬浮细胞,以后每3～4 d换液1次,待细胞90%融合后,胰蛋白酶+乙二胺四乙酸混合消化,传代培养,取第3代细胞用于实验.正常人外周血单个核细胞以1×109 L-1接种于培养瓶中,加入含体积分数为0.1的小牛血清、10 mg/L植物血凝素的IMDM液,培养3 d后收集细胞用于实验.③实验评估:采用流式细胞术检测脐血间充质干细胞及淋巴细胞表面分子.取第3代的脐血和骨髓间充质干细胞,体外诱导培养后以脂肪染色液鉴定其向脂肪细胞的分化情况.将不同细胞浓度的脐血和骨髓间充质干细胞分别加入到植物血凝素诱导的外周血淋巴细胞增殖体系中,比较两种不同来源的间充质干细胞对淋巴细胞增殖的调控作用.结果:①脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的培养及鉴定:第3代脐血间充质干细胞表面分子标记率CD29为85.18%,CD166为72.52%,CD54为33.70%,CD45为6.70%,CD13为1.51%,CD34为0.23%.正常人外周血单个核细胞中的CD3+T细胞为60%～70%,CD20+B细胞为3.5%～4.5%.脐血间充质干细胞诱导培养3周,可见呈桔黄色的脂肪细胞.②脐血间充质干细胞及骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制:淋巴细胞:间充质干细胞为1∶1,1∶0.5,1∶0.1,1∶0.05,1∶0.02,1∶0.01时,脐血间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制率分别为(49.5±4.8)%,(58.4±6.0)%,(38.1±4.0)%,(31.4±3.2)%,(24.3±3.2)%,(12.6±6.7)%,而骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制率分别为(52.4±8.4)%,(65.1±9.7)%,(34.7±4.5)%,(13.0±6.4)%,(-10.7±12.6)%,(-43.9±9.4)%.后3种细胞浓度比例脐血间充质干细胞对淋巴细胞的抑制作用明显强于骨髓间充质干细胞(t=7.72,8.14,14.68,P均＜0.05).结论:脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞一样,也具有抑制植物血凝素诱导淋巴细胞增殖的作用,抑制效果与间充质干细胞数量有关.低浓度的脐血间充质干细胞对淋巴细胞的抑制作用明显强于骨髓间充质干细胞.
作者：贺文凤；石庆之；华建媛；李剑；李洁；吴琼 刊期： 2007年第24期
目的:采用骨髓间充质干细胞体外向软骨方向诱导分化并和两种载体(胶原海绵和聚乳酸/聚羟乙酸共聚物)混合形成立体培养,对两种不同生物材料的生物相容性进行观察.方法:实验于2005-03/2006-05在华北煤炭医学院中心实验室完成.①实验材料:清洁级成年SD大鼠1只,雌雄不限;聚乳酸/聚羟乙酸共聚物(山东医疗器械研究所高分子室),胶原海绵(上海其胜公司).②实验分组:实验分为3组,即聚乳酸/聚羟乙酸共聚物组、胶原海绵组和平面培养组.③实验干预:取成年大鼠骨髓以密度梯度离心加贴壁分离法纯化分离骨髓间充质干细胞,传至第3代.将细胞以1.5×104/孔定量接种于各组的培养板内,加全培养诱导液[转化生长因子β1 10 μg、碱性成纤维生长因子10 μg、地塞米松100 nmol、维生素C 50 mg、β-甘油磷酸钠10 mmol和ITS 50 mL(牛血清白蛋白,牛转铁蛋白,牛胰岛素及微量元素)].④实验评估:培养1周后,随机取样使用甲苯氨蓝染色和特异性Ⅱ型胶原单克隆抗体免疫组织化学染色后进行检测.培养4周后使用扫描电镜观察细胞在载体上附着和生长的情况.结果:①骨髓间充质干细胞生长情况及形态:3周后倒置相差显微镜观察,可见细胞围绕在材料周边生长,随培养时间的延长,细胞形成均一的椭圆形,各载体组的细胞与平面对照组相似,无细胞衰老及异常分裂现象.②软骨细胞特异性检测:3组间甲苯氨蓝染色和特异性Ⅱ型胶原单克隆抗体免疫组织化学染色差异无显著性.③载体材料扫描电镜观察结果:在两种载体表面,分别有部分细胞黏附在载体表面生长,并在其表面连接成片.结论:胶原海绵和聚乳酸/聚羟乙酸共聚物对大鼠骨髓间充质干细胞在向软骨诱导过程中的细胞功能、细胞生长增殖无影响,两种生物材料具有良好的生物相容性,可作为软骨组织工程的载体材料应用.
作者：张翼；宋敬锋；白俊清；程爱国；张迪 刊期： 2007年第24期
目的:以Hs683、3T3成纤维细胞作为对照,探讨人胚胎神经干细胞在体外条件下对SHG44、C6胶质瘤细胞的趋向性.方法:①来源于怀孕子宫肌瘤切除术或流产的10～14周胚胎(西安市中心医院妇产科、西安交大二院妇产科、北方医院妇产科提供),产妇及其家属均签署知情同意书.Hs683成纤维细胞系由田晓峰博士馈赠,SHG44胶质瘤细胞系、C6胶质瘤细胞系、3T3成纤维细胞系均为本研究所冻藏.②将原代培养8 d的人胚胎神经干细胞悬液离心、收集备用,终神经球浓度达8×104 L-1.③将预先消毒的盖玻片(24 mm×24 mm)放置于培养皿内,将SHG44胶质瘤细胞系、C6胶质瘤细胞系、Hs683成纤维细胞系、3T3成纤维细胞系的4组细胞复苏后,加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养基.当各组细胞爬片上的细胞贴壁达75%～85%时,取出盖玻片,与上述制备的人胚神经球悬浮液共同培养.④将预先制备好的SHG44胶质瘤细胞、C6胶质瘤细胞、Hs683成纤维细胞、3T3成纤维细胞爬片(各10张)从培养瓶取出,置于新的培养皿,分别与神经干细胞克隆球在含体积分数为0.01～0.02胎牛血清的DMEM培养液中共培养72 h,观察并统计各细胞系每张爬片的克隆球数.上述4种细胞爬片周边3 mm以外相同面积、无胶质瘤/成纤维细胞区域作为其各自空白对照.⑤分别将神经干细胞克隆球+C6胶质瘤细胞+3T3成纤维细胞、神经干细胞克隆球+SHG44胶质瘤细胞+Hs683成纤维细胞同法共培养72 h,观察人胚神经干细胞在SHG44、Hs683、C6、3T3细胞爬片上的分布情况.结果:①人胚神经干细胞对SHG44、C6胶质瘤细胞的趋向作用:SHG44/C6胶质瘤细胞+人胚神经干细胞克隆球共培养72 h后,胶质瘤细胞爬片上的神经克隆球体积均有所增大,且数量均明显高于外周无胶质瘤细胞的空白对照区(P均＜0.05).②人胚神经干细胞对Hs683、3T3成纤维细胞的趋向作用:Hs683/3T3成纤维细胞+人胚神经干细胞克隆球共培养72 h后,成纤维细胞爬片上的神经克隆球数量与周围无成纤维细胞区基本相似(P均＞0.05).③人胚神经干细胞+SHG44/C6胶质瘤细胞+Hs683/3T3成纤维细胞共培养下的体外趋向作用:SHG44胶质瘤细胞+Hs683成纤维细胞+人胚神经干细胞共培养72 h后,SHG44胶质瘤细胞爬片上的神经球数量明显多于Hs683成纤维细胞爬片(P＜0.05).C6胶质瘤细胞+3T3成纤维细胞+人胚神经干细胞共培养72 h后,C6胶质瘤细胞爬片上的神经球数量明显多于3T3成纤维细胞爬片(P＜0.05).结论:人胚胎神经干细胞与胶质瘤细胞体外共培养后,神经球出现向胶质瘤细胞周围集聚的趋势,提示胶质瘤细胞可能分泌某种对神经干细胞有一定作用的活性因子.
作者：姬西团；章翔；费舟；张剑宁；刘卫平；蒋晓帆；宋少军；宋蕾；梁景文 刊期： 2007年第24期
目的:观察急性髓性白血病经混合造血干细胞移植后,应用供者淋巴细胞输注+白细胞介素2治疗的效果,并与移植后未经特殊治疗的效果进行比较.方法:①选取2000-01/2004-07解放军兰州军区兰州总医院全军血液病中心收治的19例急性髓性白血病患者,实验经医院伦理委员会批准,患者均知情同意.随机数字表法分为两组:观察组8例,年龄17～40岁,M2a 4例,M4 1例,M5a 3例;对照组11例,年龄19～39岁,M2a 2例,M3a 2例,M4 3例,M5a 4例.②两组患者采用化疗联合重组人粒细胞集落刺激因子的方法动员自体外周血造血干细胞,采集后液氮中保存5 d备用.③术前采用直线加速器对患者全身及肺部照射,预处理完毕后实施混合造血干细胞移植.首先回输自体单个核细胞中位数为4×108/kg,CD34+细胞中位数为6.2×106/kg,粒-巨噬祖细胞集落形成单位中位数为5.8×104/kg.间隔1～6 h后,采集人类白细胞抗原半相合异体骨髓,按回输自体单个核细胞数的1/6～1/10输注给患者.④两组患者移植期间均住无菌层流病房,给予相应并发症的防治及支持治疗.在粒细胞降至0时注射重组人粒细胞集落刺激因子150 μg/12 h,促进造血恢复.观察组给予供者淋巴细胞输注+白细胞介素2治疗,每次采集的供者淋巴细胞中,CD3+淋巴细胞中位数为1.43×108/kg,CD4+细胞中位数为0.97×108/kg,CD8+细胞中位数为0.41×108/kg,中位治疗次数4(1～7)次,回输后即开始应用100 wu/d重组人白细胞介素2,共10 d.对照组混合造血干细胞移植后未给予特殊治疗.结果:19例急性髓性白血病患者均进入结果分析.①造血恢复:两组患者均获得造血重建,术后4～9 d粒细胞均降至0,12～17 d粒细胞达0.5×109 L-1,16～21 d白细胞达4.0×108 L-1,19～23 d血小板达20×108 L-1.16～21 d骨髓检查示恢复期骨髓象.②术后并发症:两组患者不同程度地出现口腔溃疡,随着造血恢复,7～10 d溃疡消失.观察组1例患者出现出血性膀胱炎,两组各2例患者出现发热.无肝静脉闭塞病和移植物抗宿主病发生.③嵌合体形成:观察组中1例M4患者形成嵌合体,对照组中2例M4患者与1例M5患者形成嵌合体,嵌合体持续存在3～12个月.④供者淋巴细胞输注+白细胞介素2疗效:观察组中有1例M2a患者在接受2次特殊治疗后7个月复发死亡;1例M2a患者接受2次特殊治疗后1年出现骨髓增生异常综合征,脑出血死亡,1例M5a患者应用特殊治疗1次后出现不明原因高热、抽搐,死于癫痫持续状态,其余5例患者随访2年均健康存活,长期生存率为62.5%(5/8).对照组有2例M2a患者、2例M4患者、1例M5患者于移植后1～7个月复发死亡,1例M3患者于移植后25 d死于脑出血,其余2例M3患者、2例M4患者、1例M5患者随访2年均健康存活,长期生存率为45.4%(5/11).结论:混合造血干细胞移植后应用供者淋巴细胞输注+白细胞介素2治疗,急性髓性白血病患者均获得造血重建且无移植物抗宿主病发生,其长期生存率有效提高.
作者：王存邦；白海；欧英贤；潘耀柱；张茜；葸瑞 刊期： 2007年第24期
背景:外周血单核细胞预激活是动脉粥样硬化形成的重要早期事件和促进因素之一,丹参酮是从传统中药丹参中提取的一种脂溶性成分,具有确切的抗动脉粥样硬化作用.目的:通过检测外周血单核细胞的黏附活性与分泌活性,分析原发性高血压患者病程早期是否存在外周血单核细胞预激活,并探讨丹参酮对体外培养条件下外周血单核细胞激活的抑制作用.设计:病例对照分析.单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊科与中医药研究室.对象:选取2003-01/2004-10华中科技大学同济医学院附属同济医院心血管内科收治的未经治疗或已停用降压药物2周以上的原发性高血压患者30例,男16例,女14例;平均年龄(44.6±7.4)岁;体质量指数(26.2±4.5) kg/m2;平均病程(38.5±16.9)个月;对本实验均知情同意.根据1999年WHO/ISH的高血压诊断标准,均为高血压Ⅰ～Ⅱ级.排除继发性高血压、器质性心脏病、高脂血症、糖尿病、肝肾功能障碍、感染等临床情况以及高血压所致的心、脑、肾、血管等靶器官损害.另选择30例血压正常的健康体检者作为正常对照组.人脐静脉内皮细胞(武汉大学物种保存中心);丹参酮注射液(雅安三九药业有限公司,批号020724).方法:①入选者均抽取静脉血4.0～5.0 mL,采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法和塑料吸附法分离单个核细胞,37 ℃孵育40～60 min后收集贴壁细胞即为外周血单核细胞.瑞氏染色后镜下观察细胞形态符合单核细胞特征,锥虫蓝拒染试验测定活细胞数＞95%.将新鲜分离的外周血单核细胞重悬,按4×107 L-1接种到24孔培养板上,每份标本设3孔:第1孔为基础分泌孔,第2孔为血管紧张素Ⅱ刺激孔,第3孔为丹参酮预处理孔.在血管紧张素Ⅱ刺激前先将外周血单核细胞与丹参酮共同孵育30 min.血管紧张素Ⅱ、丹参酮终浓度分别为1×10-8 mol/L和1×10-8 g/L,外周血单核细胞终浓度为2×107 L-1.37 ℃下置于体积分数为0.05的CO2培养箱内24 h,分别收集培养上清和细胞成分.②制备外周血单核细胞悬液,密度调整至2.5×109 L-1.在24孔培养板上用含体积分数为0.1小牛血清的M199培养基培养人脐静脉内皮细胞,待细胞生长至对数增长期后,铺板汇成单层,每孔加入100 μL外周血单核细胞悬液,37 ℃下分别孵育2,4 h,去除未黏附细胞,戊二醛固定后计数黏附细胞,高倍镜下每孔计数40个视野,取其平均值.③采用双抗体夹心ELISA法和反转录-聚合酶链技术检测外周血单核细胞培养上清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6的浓度及其mRNA的表达水平.主要观察指标:①外周血单核细胞黏附活性的变化.②外周血单核细胞培养上清中细胞因子浓度及其mRNA的表达.结果:①孵育2,4 h时外周血单核细胞与内皮细胞的黏附数,在基础状态下高血压组和正常对照组基本相似(t=1.153～1.577,P均＞0.05);血管紧张素Ⅱ刺激后高血压组明显多于正常对照组(t=3.842～4.536,P均＜0.01);丹参酮预处理后两组又降至同一水平(f=0.855～1.702,P均＞0.05).②基础状态时,两组培养上清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6的浓度均较低(t=0.981～1.829,P均＞0.05);血管紧张素Ⅱ刺激后,高血压组各细胞因子浓度均明显高于正常对照组(t=2.442～5.075,P＜0.01,0.01,0.05);丹参酮预处理后两组各细胞因子浓度均有不同程度降低,但差异无显著性意义(f=1.227～1.940,P均＞0.05).两组外周血单核细胞中各细胞因子mRNA的表达与浓度变化基本相似.结论:①基础状态下原发性高血压患者外周血单核细胞与内皮细胞的黏附数及各炎性细胞因子浓度和mRNA表达处于正常人群水平,经血管紧张素Ⅱ刺激后显著升高,提示原发性高血压患者病程早期外周血单核细胞处于预激活状态.②丹参酮干预可使原发性高血压患者外周血单核细胞的黏附活性与分泌活性降至正常水平,证明丹参酮能够抑制预激活的外周血单核细胞进一步激活,一定程度上可防止动脉粥样硬化的发生.
作者：占成业；陶秀良；周代星；郑智 刊期： 2007年第24期
目的:克隆人血小板源性生长因子B基因于腺相关病毒载体中,以获得高感染滴度的重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒.方法:实验于2005-10/2006-11在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.①健康足月产妇胎盘组织由青岛大学医学院附属医院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意.DH5α宿主菌由青岛大学医学院附属医院中心实验室制备保存.②Trizol试剂提取健康足月产妇胎盘组织总RNA,反转录-聚合酶链反应一步法克隆人血小板源性生长因子B基因全长开放读框.聚合酶链反应产物定向克隆于腺相关病毒载体,重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体进行双酶切和测序鉴定.③采用磷酸钙转染法将重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体、腺相关病毒包装载体,腺相关病毒辅助载体共转染腺相关病毒293细胞,包装得到重组腺相关病毒并回收病毒原液,显微镜下观察细胞及培养基的变化.④以携带β-半乳糖苷酶基因的腺相关病毒作为报告基因同重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体一样共转染相关病毒293细胞,对报告基因行X-Gal染色,通过蓝染的细胞计算病毒滴度.结果:①重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体酶切鉴定及序列分析:聚合酶链反应产物经电泳证明大小正确,重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体酶经双酶切和测序鉴定证实将血小板源性生长因子B基因正确插入.②腺相关病毒293细胞转染过程中病毒颗粒的产生:腺相关病毒293细胞转染6 h后培养基底部出现无数小黑色颗粒,为加入的转染复合物颗粒.24 h后腺相关病毒293细胞部分变圆,随着病毒增殖,细胞成串浮起,出现细胞病理效应.48 h后细胞变形,逐渐从壁上脱落.72 h后培养基的颜色从红色变化为橙色或黄色.③病毒滴度检测:通过携带β-半乳糖苷酶基因的腺相关病毒感染细胞后X-gal染色计数,测定重组腺相关病毒滴度为1×1010 L-1.结论:成功构建表达人血小板源性生长因子B基因的重组腺相关病毒载体,为进一步研究血小板源性生长因子B基因治疗角膜病和相关细胞系与组织的增殖提供实验基础.
作者：刘相萍；罗文娟；隋爱华；杨堃；吕振华；王传富 刊期： 2007年第24期
目的:观察成人外周血来源的单个核细胞在体外培养过程中形态、增殖能力和表面抗原的变化.方法:实验于2006-08/2007-02在广州南方医院完成.①实验材料:健康志愿者肘静脉血20份,年龄20～26岁,对本实验均知情同意.②实验方法:密度梯度离心健康成人肘静脉血得到单个核细胞,以(2～3)×106/cm2的密度接种于人纤维连接蛋白包被的6孔板,在含有人血管内皮细胞生长因子的M199培养基中进行培养,第4天首次换液,后每3 d换液一次.③实验评估:第3天起观察细胞的形态及数量,分别对培养至第7,21天的贴壁细胞行流式细胞学分析及免疫组化染色检查.结果:①培养细胞的形态学观察:外周血来源单个核细胞接种后约有1/20贴壁,第4天左右可形成从中心向外放射的典型细胞集落,第7天有大量长梭形、双极针样细胞生长.培养第2周长梭形细胞开始凋亡,数量减少,同时出现大量椭圆形鹅卵石样细胞.至第3周鹅卵石样细胞己占据生长优势且增殖旺盛,长梭形细胞基本消失.②内皮祖细胞表面标志的变化:原代培养第7天,贴壁细胞表达与单核巨噬细胞系相关的表面抗原CD44(96.3%)、CD45(83.9%)、CD11c(63.7%)、CD14(11.9%),弱表达内皮细胞相关抗原flk-1(18.2%)、CD31(6.7%)、vWF(3.6%);第21天CD44表达下降至57.6%,而内皮细胞相关抗原CD31表达增加至67.2%,vWF增加至14.2%;造血干细胞相关抗原CD34始终呈阴性表达.免疫组化染色结果与流式细胞分析结果一致.结论:成人外周血中存在两种不同类型的血管内皮前体细胞,单个核细胞贴壁培养4～7 d左右出现早期内皮祖细胞,2～3周时出现晚期内皮祖细胞.二者的外形、增殖潜能、表面抗原表达均不同.晚期内皮祖细胞是更好的种子细胞来源.
作者：李华；高建华；颜玲；鲁峰；朱茗 刊期： 2007年第24期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
