秦宇红；陈光辉；边素艳；张琰琴；李天德
目的:观察骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞过程中神经生长因子及其受体的表达变化情况,以探索骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞的机制.方法:实验于2005-10/2006-08在华北煤炭医学院中心实验室和形态实验室完成.实验方法:①骨髓间充质干细胞的分离和培养:分离纯化健康成年SD大鼠骨髓间充质干细胞进行传代培养.②骨髓间充质干细胞的诱导分化:取第5代细胞,加入含L-DMEM、1 mmol/L β-巯基乙醇、20%FBS预诱导液进行预诱导,24 h后去除预诱导液,加入含L-DMEM、5 mmol/L β-巯基乙醇诱导液诱导培养5 h,应用倒置相差显微镜观察细胞形态变化,采用免疫细胞化学方法鉴定神经细胞.③尼氏小体染色:应用甲苯胺蓝对尼氏小体染色,光镜下观察并照相.④实验评估:对诱导前后细胞进行免疫组织化学检测,并提取诱导前后细胞的mRNA,通过RT-PCR法检测神经生长因子、神经生长因子受体TrkA mRNA表达变化.结果:①骨髓间充质干细胞的培养:骨髓间充质干细胞贴壁生长情况良好,大部分细胞贴壁呈长梭形.传代后细胞形态和原代细胞相似,生长加快.②骨髓间充质干细胞的诱导分化:加入预诱导液后,细胞体积缩小,立体感增强,细胞边缘变得不规整,部分细胞有细的指状突起,其中约2%的细胞胞体已变成近似球形,具有短的突起,形状类似神经元.5 h后细胞转化达到峰值,形态不再发生明显改变,具有典型神经细胞样形态,免疫细胞化学检测显示,神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达均呈阳性.③尼氏小体染色:未诱导骨髓间充质干细胞胞浆内无尼氏小体,诱导5 h后大部分细胞染色阳性,胞质中存在着深蓝色颗粒状尼氏小体.④RT-PCR反应检测神经生长因子和TrkA mRNA:神经生长因子mRNA表达在诱导前后没有变化,TrkA mRNA在诱导后的表达减少(P＜0.05).结论:①骨髓间充质干细胞成功诱导分化为神经细胞,其在诱导分化为神经细胞前后表达神经生长因子及其受体TrkA.②神经生长因子在诱导分化前后稳定表达,神经生长因子受体TrkA在诱导分化后表达减少,神经生长因子/TrkA信号途径可能在骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞的过程中起作用.
作者：王相利；宓宝杰；王海立 刊期： 2007年第33期
目的:报告1例低体质量儿童行外周血干细胞采集过程中出现输血反应的情况.方法:患儿,女,6岁,体质量16 kg,于2005-08/2005-09入院,诊断为神经母细胞瘤Ⅳ期.外周血干细胞采集预处理方案为环磷酰胺1 g/d×2 d、法玛新10 mg/d×3 d、长春新碱0.4 mg/d×5 d.采集前30 min给予地塞米松2.5 mg预防输血反应的发生.外周血干细胞采集应用CS-3000 Plus血细胞分离机,调至儿童采集程序,配以小体积分离槽和小体积收集槽.机器正常初始化后,采用去白辐照悬浮红细胞100 mL,将其用生理盐水1∶1稀释至200 mL,进行全血灌注冲盈管路.当返血管路返出全血、首次溢出结束后停机,将其与患儿管路相连接,开机时全血流速设定为15 mL/min.结果:①第1次开机19 min后,患儿从耳阔至面部出现潮红,随即出现红色皮疹、瘙痒、燥动不安,过5 min后全身出现红疹,血压90/60 mm Hg,心率124次/min,立即停机用盐水维持通路,静脉给予地塞米松2 mg,非那根25 mg,10%葡萄糖酸钙10 mL,临床观察10 min后患儿安静入睡,血压90/70 mm Hg,心率120次/min,重新开机,设定全血流速为15 mL/min,20 min后提高全血流速至25 mL/min,共循环5 000 mL,用时3小时26分.②次日,开机前30 min给予地塞米松5 mg,开机后10 min患儿出现胸闷,全身无皮疹,心率90次/min,停机,盐水维持密切观察,10 min后患儿无不适,心率100次/min,重新开机,共循环5 000 mL全血,用时3小时38分.结论:①低体质量儿童在外周血干细胞采集过程中出现输血反应后,经及时处理顺利完成采集,并获得了足够的外周血干细胞.②设定全血流速15 mL/min是CS-3000 Plus血细胞分离机运转程序的低限,输血速度较快,这可能是小儿发生输血过敏反应的一个因素.
作者：刘小超；吴轶苹；黄东生；张伟令；王阳；李淑平 刊期： 2007年第33期
目的:感染有可能是自身免疫性疾病患者造血干细胞移植过程中的主要并发症,选择此类患者42例分析其临床感染特点与高危因素.方法:①实验对象:选取1999-01/2006-06郑州市第三人民医院收治的接受自体造血干细胞移植的重症自身免疫性疾病患者42例,移植前平均病程3年.实验经医院医学伦理委员会批准,患者均签署知情同意书.②实验方法:环磷酰胺150 mg/kg+抗人胸腺球蛋白/抗人淋巴细胞球蛋白预处理30例,环磷酰胺200 mg/kg+抗人胸腺球蛋白/抗人淋巴细胞球蛋白预处理12例;CD34+细胞纯化移植17例,CD34+细胞未纯化移植25例.移植过程中无菌层流室全环境保护,当患者体温＞38℃时立即采集血液标本,15 min/次,连续3次.同时依据感染部位,采集相应的分泌物标本,鉴定菌种,并进行药敏试验.移植后1～3个月出现发热的患者,应用酶免疫染色技术与ELISA法检测巨细胞病毒.结果:①感染病例临床特征:42例患者共32例于移植后发生感染,其中9例发生两个部位感染,4例发生3个部位感染.感染部位主要分布在口腔、肛周、肺部等,以及原发感染灶不明确的菌血症.细菌、真菌感染多发生在移植后1个月内,巨细胞病毒检测阳性多发生在移植后1～2.5个月,巨细胞病毒感染所致间质性肺炎多发生在移植后1～6个月.②病原菌分布与耐药:自身免疫性疾病自体造血干细胞移植后,真菌感染占36%,革兰氏阴性杆菌占32%,革兰氏阳性球菌占4%.实验所检出革兰氏阴性杆菌耐药率高,其中铜绿假单胞菌除对亚胺培南、头孢他啶、阿米卡星敏感外,对其他药物均耐药;大肠埃希氏菌对喹诺酮类、第3代头孢菌素等多种药物耐药,仅对氨基糖苷类敏感.③移植相关因素与感染发生:接受自体造血干细胞移植的自身免疫性疾病患者,其病程≥3年、移植前环磷酰胺用量≥5 g、预处理环磷酰胺强度200 mg/kg及CD34+细胞纯化的患者发生重度感染概率更高(x2=4.783～8.776,P均＜0.05).结论:①自身免疫性疾病患者自体造血干细胞移植后,感染病原体以革兰氏阴性杆菌、真菌、巨细胞病毒为主,感染部位主要分布在口腔、肛周、肺部,细菌耐药率高.②感染发生除与原发病有关外,患者病程、移植前环磷酰胺用量、预处理方案及移植方式为显著相关危险因素.
作者：董秀娟；陈蕾；马红霞；赵晓武；马冬燕；周凯 刊期： 2007年第33期
目的:将外源性人端粒酶反转录酶基因转入人骨髓间充质干细胞,以建立永生化细胞株.方法:实验于2006-01/2007-01在石河子大学新疆地方与民族高发病省部共建教育部重点实验室完成.①实验材料:骨髓标本采自因意外事故引产死亡的8个月正常胎儿,家属均签署知情同意书.大肠杆菌DH5α分子克隆的受体菌由本室保存.质粒pBabepuro-hTERT由美国Weinberg博士惠赠.PA317细胞和Hela细胞由郭志儒博士惠赠.NIH3T3细胞由黄瑾博士惠赠.②实验方法:无菌条件下将骨块置于α-MEM培养液中,分离及扩增培养人骨髓间充质干细胞.提取并纯化质粒pBabepuro-hTERT,转染包装骨髓间充质干细胞,经嘌呤霉素筛选后获得抗性克隆,选取病毒滴度高的细胞克隆感染生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞.③实验评估:采用端粒酶重复序列扩增法-酶链免疫吸附法检测人骨髓间充质干细胞转染前后端粒酶活性的变化,样本的△A值高于0.2视为端粒酶阳性.结果:①骨髓间充质干细胞的形态观察:第3代人骨髓间充质干细胞形态不规则,体积较大的细胞逐渐死亡,以梭形为主.②基因转染包装细胞和克隆筛选结果:嘌呤霉素筛选7 d后,转染的细胞出现抗性克隆.待细胞克隆长至肉眼可见时将细胞克隆消化后扩增培养,挑选出4个抗性克隆,分别命名为克隆1,2,3,4.③病毒滴度的测定:1～4号细胞克隆的病毒滴度分别为3×106,7×105,4×105,9×106 cfu/L.④端粒酶活性变化的检测:未转染的第3代骨髓间充质干细胞△A值为0.121±0.043,端粒酶活性为阴性.第3代人端粒酶反转录酶-骨髓间充质干细胞的△A值为1.741±0.103,端粒酶活性为阳性.结论:导入外源性人端粒酶反转录酶基因后可激活骨髓间充质干细胞的端粒酶活性.
作者：徐燕；慕晓玲 刊期： 2007年第33期
目的:选择新生兔为实验对象,观察体外培养破骨细胞形态学和生物学特征.方法:实验于2007-03/06在辽宁医学院生理实验室完成.采用改良Chambers法机械分离兔四肢长骨获得新生兔(出生24 h内)的破骨细胞,并应用倒置显微镜、光镜观察其形态学特征.结果:①倒置显微镜观察结果:培养1 d后,细胞贴壁生长,数量增多,第3天后,可见多核巨细胞,呈油煎蛋、长条形,漏斗形等.②光镜观察结果:苏木精-伊红染色可见破骨细胞胞浆丰满,呈浅粉色,内含许多空泡结构,核3～20个不等,核呈浅蓝色,每个核含一两个核仁,有时周围伸出伪足样胞浆突起;Giemsa染色核集中于细胞中央或散在于细胞周边,呈花篮状,核浅粉色,胞浆着色较浅,其中可见数个大小不等未着色空泡;TRAP染色胞浆呈酒红色颗粒,核蓝色,核仁一两个;甲苯胺蓝染色可见骨吸收陷窝呈蓝紫色,圆形,椭圆形或不规则形,边界清晰,其边缘反光性强.结论:应用改良Chambers法可成功获得新生兔破骨细胞,且具有骨吸收功能.
作者：任媛媛；张健 刊期： 2007年第33期
目的:对晚期脊髓损伤患者开展嗅鞘细胞再移植治疗,探讨其对神经功能的继续改善效果.方法:①患者男性,27岁,哈萨克斯坦籍,2001年9月20日遭霰弹枪击急诊手术后,双下肢不能运动及感觉消失,尿便失禁,右下肢阵发性钝痛.诊断为陈旧性完全性脊髓损伤(T12),美国脊髓损伤协会标准脊髓功能分级为A级.2002年9月30日第1次行脊髓胚胎嗅鞘细胞移植术,2007年2月5日行第2次脊髓胚胎嗅鞘细胞移植术.治疗方案患者知情同意.②取4个月流产胚胎(孕妇及其家属均知情同意)的嗅球,消化成单个嗅鞘细胞后培养2周,细胞浓度约2×1010 L-1.于患者相应脊髓损伤上端(平T11椎体)做1个锁孔,直径约3 cm,在脊髓损伤部位与正常脊髓交界处沿中线于无血管区,分两点用4.5号细针共注入100 μL(第1次手术)、50 μL(第2次手术)嗅鞘细胞悬液,细胞数均为1×106个.第2次移植术前进行供、受体细胞HLA配型,术后口服FK506胶囊2 mg,2次/d,共42 d.结果:①第1次术后3个月,排尿能控制6 h,双足运动功能改善,性功能改善,阴茎勃起功能改善,疼痛减轻.②第2次术后10 d,双下肢双足皮肤泌汗功能改善,右下肢疼痛减轻,腹部皮肤感觉稍有好转,针刺觉左侧由术前T10皮节消失好转至T10减退.较第2次移植前椎旁躯体感觉诱发电位有所改善,双侧椎旁电位从T10下降到T12.结论:胚胎嗅鞘细胞二次移植能继续改善晚期脊髓损伤患者的神经功能.但移植的细胞数量、容积、注射点位置等需深入探讨.
作者：陈琳；黄红云；江昭；张峰；郗海涛；张健；刘彦铖；王洪美 刊期： 2007年第33期
目的:观察脊髓损伤后不同时间移植真皮多能干细胞对大鼠运动功能修复的影响.方法:实验于2006-06/2007-03在第三军医大学生理学教研室完成.①实验材料:实验动物2～4月龄SPF级SD大鼠,体质量(210±40)g,雌雄不限,由第三军医大学实验动物中心提供.真皮多能干细胞为第三军医大学防原医学系从SD大鼠真皮中提取和分离.②实验方法:将42只SD大鼠在L4水平制成脊髓全横断损伤模型.将动物随机分为对照组(n=6)、真皮多能干细胞移植组(n=36).真皮多能干细胞移植组又分为6个时间点:损伤后1,4,7,10,14,21 d移植组,每组6只.各移植组于伤处移植大鼠真皮多能干细胞,而对照组于损伤后7 d注射等量磷酸盐缓冲液.③实验评估:分别于移植后1 d、1周、4周、8周、12周对各组大鼠进行动物行为学和脊髓诱发电位检测.结果:42只实验大鼠均进入结果分析,无脱落.①动物行为学评分:4周以后各组动物行为学评分比较差异有显著性意义(P＜0.05),移植组明显高于对照组(P＜0.05),各移植组间比较,以损伤后7,10 d移植组动物行为学评分改善显著.②各组大鼠脊髓诱发电位检查:体感诱发电位和运动诱发电位潜伏期和波幅值于移植后8,12周后明显高于对照组(P＜0.05),各移植组间比较,以损伤后7,10 d移植组体感诱发电位和运动诱发电位潜伏期和波幅值改善显著.结论:脊髓损伤后7～14 d进行真皮多能干细胞移植可明显改善大鼠后肢的运动功能.
作者：王涛；李露斯；刘雁平；屈纪富；徐海伟 刊期： 2007年第33期
目的:有较多的学者提出,中枢神经系统是一个部分免疫豁免区,仍然存在干细胞移植后的排异问题,为求证免疫排异的存在与否,实验拟探讨人胚神经干细胞移植治疗脑液压损伤大鼠的移植免疫及其对策.方法:实验于2003-01/2003-07在北京神经外科研究所神经干细胞室完成.①实验材料:人胚来源:12周龄死胎大脑,产妇及家属知情同意,来自北京天坛医院产科.SD雌性大鼠30只,体质量(290±10)g,购自中国医学科学院实验动物研究所.②实验方法:体外培养人胚神经干细胞,并用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记,液压冲击大鼠右侧大脑皮质运动感觉区制作脑损伤模型,将其分为实验组与对照组.实验组在移植人胚神经干细胞后使用地塞米松腹腔注射,对照组移植人胚神经干细胞后仅使用生理盐水腹腔注射.③实验评估:脑外伤后24 h移植人胚神经干细胞,于人胚神经干细胞移植后1周脑组织切片免疫组织化学染色检测BrdU、巢蛋白、微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白蛋白表达.采用流式细胞仪计数分析检测大鼠脑组织CD4+T细胞淋巴细胞占总淋巴细胞的百分比.结果:两组移植后1周,均见BrdU阳性细胞从移植区域向周围扩散,切片巢蛋白、微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白均为阳性,且微管相关蛋白2阳性细胞较多;实验组侧脑室脉络丛和脑实质的微血管中只见有少量的BrdU阳性细胞,对照组脉络丛中见大量聚集的BrdU阳性细胞.两组CD4+T淋巴细胞占总淋巴细胞的百分比差异有显著意义(P＜0.05).结论:异种神经干细胞移植治疗脑损伤可能存在免疫排斥反应,地塞米松对其存在抑制作用.
作者：龙新兵；张泽舜；韩富；万虹 刊期： 2007年第33期
目的:观察褪黑素对自身免疫性肝炎大鼠模型外周血淋巴细胞亚群的影响方法:实验于2004-10/2006-10在解放军第一二三医院南京军区肝病中心实验室完成.①实验材料:Wistar大鼠,雄性,3月龄,体质量(230±20)g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司.褪黑素:美国Sigma公司产品,临用前以无水乙醇溶解,再加生理盐水配制,使乙醇浓度为0.1%,置4℃冰箱保存备用.②实验方法:采用弗氏完全佐剂加肝细胞特异性脂蛋白法制作大鼠自身免疫性肝炎模型.将建模成功大鼠随机分为模型对照组、褪黑素注射组及猪促肝细胞生长素注射组,每组20只.褪黑素注射组褪黑素2 mg/kg腹腔注射,1次/d,猪促肝细胞生长素注射组2 mg/kg猪促肝细胞生长素腹腔注射,1次/d,模型对照组与正常对照组均用含0.01%乙醇的生理盐水腹腔注射.③实验评估:60 d后检测各组大鼠外周血淋巴细胞亚群浓度.结果:①CD4+细胞≤39.5%18只,均为褪黑素注射组动物,肝炎组织活动性指数≤8分.22只CD4+细胞＞39.5%动物中,4只肝炎组织活动性指数≤8分,其中2只为褪黑素注射组动物,2只为模型对照组动物.18只肝炎组织活动性指数＞8分,均为模型对照组动物.②18只CD4+细胞≤39.5%褪黑素注射组动物中,17只肝纤维化指数≤4分,1只肝纤维化指数4分;22只动物CD4+细胞＞39.5%,2只肝纤维化指数≤4分,为模型对照组动物,20只肝纤维化指数＞4分,褪黑素注射组2只,模型对照组18只.③CD4+细胞≤39.5%,肝组织血管病变均为1级,＞39.5%时,2级以上血管病变为90.9%.18只CD4+细胞≤39.5%褪黑素注射动物血管病变为1级.22只CD4+细胞百分比＞39.5%,2只血管病变为1级,为模型对照动物,17只血管病变为2级,褪黑素注射组2只,模型对照组15只.3只血管病变为3级,为模型对照动物.④CD4+细胞≤39.5%时,83.3%血管内皮细胞生长因子表达呈弱阳性,CD4+细胞＞39.5%时,81.8%血管内皮细胞生长因子表达呈强阳性,提示CD4+细胞与血管内皮细胞生长因子表达有关.⑤模型对照组外周血CD4+细胞数和CD4+/CD8+比值均明显高于其他组(P＜0.05),CD8+细胞与其他组无明显差异(P＞0.05).褪黑素注射动物与猪促肝细胞生长素注射动物相比,无明显差异(P＞0.05).结论:褪黑素对自身免疫性肝炎模型大鼠外周血CD4+细胞有较强的抑制作用.
作者：丁体龙；马勇；于莉；夏志学 刊期： 2007年第33期
目的:临床局部辐射条件下会造成非辐射区域组织及细胞功能损害,为突出的是对造血功能的影响.实验建立60Coγ射线左半身辐射动物模型,观察局部电离辐射对其非辐射区域骨髓巨核细胞的影响.方法:实验于2003-10/2005-03在解放军第三军医大学辐照中心和全军复合伤研究所完成.①实验动物:6～8周龄SPF级雄性昆明小鼠180只,随机数字表法分为正常对照组、全身辐射组、左半身辐射组、全身屏蔽辐射组,45只/组.②实验方法:全身辐射组小鼠固定于辐射架内;左半身辐射组小鼠麻醉后固定体位,用铅砖屏蔽右半身;全身屏蔽辐射组小鼠麻醉固定体位,用铅砖屏蔽全身.以60Coγ射线一次性辐射,剂量率68.46 cGy/min.正常对照组不作任何干预.③实验评估:辐射后不同时相检测小鼠血清丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性变化,计数外周血血小板,检测骨髓巨核祖细胞集落形成单位,观察骨髓组织病理改变及CD41a、CD61的表达.结果:全身辐射组第8天死亡2只,第9天死亡4只,其余各组无脱失.①外周血血小板计数:辐射后第2,7天,左半身辐射组外周血血小板数量显著低于正常对照组(P＜0.01),但高于全身辐射组(P＜0.01).②血清丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性变化:辐射后第2,9天,左半身辐射组血清丙二醛含量显著高于正常对照组(P＜0.01),低于全身辐射组(P＜0.01);血清超氧化物歧化酶活性显著低于正常对照组(P＜0.01),高于全身辐射组(P＜0.01).③骨髓巨核祖细胞集落形成单位的变化:与正常对照组比较,辐射后6 h左半身辐射组非辐射侧的巨核祖细胞集落形成单位显著降低(P＜0.01),高于全身辐射组及左半身辐射组(P＜0.01).④骨髓组织病理改变:正常对照组有核细胞比例较高,分布均匀,并见多量散在分布的细胞龛;辐射2 d后,左半身辐射组非辐射侧骨髓有核细胞较正常对照组减少,但好于全身辐射组、左半身辐射组.⑤骨髓CD41a及CD61表达的变化:辐射后2 d与正常对照组比较,左半身辐射组非辐射侧骨髓CD41a及CD61阳性细胞数和相对荧光强度均显著降低(P＜0.01),但高于全身辐射组、左半身辐射组(P＜0.01).结论:局部电离辐射作用后,可导致小鼠非辐射区域骨髓巨核细胞增殖能力降低,血小板减少,产生功能障碍.氧自由基激活可能参与了该损伤过程.
作者：杨龙；荣曙；许祥裕；罗成基；程天民 刊期： 2007年第33期
背景:实验证明外源性的碱性成纤维细胞生长因子可以增强骨骼肌成肌细胞的生长及成活,内源性碱性成纤维细胞生长因子对肌肉修复也有明显作用.但如将其基因转染到眼外肌中也有相同的效果吗?目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子基因转染对鼠眼外肌成肌细胞生物学行为的影响.设计:单一样本观察.单位:青岛大学医学院附属医院眼科.材料:原代大鼠眼外肌成肌细胞为前期培养得到,纯度大于90%,并成功构建人PEGFP-N3-bFGF真核表达载体(另文发表).方法:实验于2005-09/2006-12在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.①实验干预及分组:实验分为试验组:用重组PEGFP-N3-bFGF转染的细胞;对照组1:空载PEGFP-N3转染的细胞;对照组2:培养皿中只加入F-10培养基(体积分数为0.1的胎牛血清)培养的细胞.采用脂质体转染技术,将重组PEGFP-N3-bFGF质粒转染体外培养的大鼠眼外肌成肌细胞中.③实验评估:用免疫组织化学法观察碱性成纤维细胞生长因子表达;用荧光显微镜检测转染效率;在培养的第1,3,5,7,9,11,13,15,21,28天采用ABC-ELISA法检测各组成肌细胞碱性成纤维细胞生长因子蛋白的分泌;采用四甲基偶氮唑盐法检测各组眼外肌成肌细胞增殖情况;根据已知一定浓度标准品的A值计算各组细胞肌酸激酶活性.主要观察指标:①观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染体外培养的大鼠眼外肌成肌细胞的效率;转染后的表达情况.②转染后碱性成纤维细胞生长因子蛋白的分泌情况;对大鼠眼外肌肌原细胞生长和分化的影响.结果:①碱性成纤维细胞生长因子基因转染体外培养的大鼠眼外肌成肌细胞的转染率达(42.8±1.2)%.②免疫组织化学检测试验组呈现阳性反应.③转染细胞能够分泌碱性成纤维细胞生长因子蛋白,第5天高达662.935 ng/L.④转染细胞增殖活性明显提高,其A值均比同一时相点的对照组明显增高(P＜0.05).⑤转染后细胞从第5天始至终,肌酸激酶值高于对照组(P＜0.01).结论:碱性成纤维细胞生长因子基因转入大鼠眼外肌的成肌细胞中,能够使大鼠眼外肌的成肌细胞分泌碱性成纤维细胞生长因子,具有促进细胞增殖,提高其成活率,促进其分化能力.
作者：张立贵；王传富；黄晓辉 刊期： 2007年第33期
目的:探讨体外诱导骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的可能性,并观察其动态变化.方法:实验于2005-09/2007-03在山东大学齐鲁医院完成.①标本来源:骨髓标本15例来自山东大学齐鲁医院成人骨髓检查结果正常者,均签署捐献同意书.②实验方法:无菌条件下取骨髓2.0～5.0 mL,采用percoll分离液和贴壁法获得纯化的成人骨髓间充质干细胞.③实验评估:流式细胞仪行细胞表面抗原检测,在适当的条件下诱导其分化为成骨细胞和脂肪细胞.采用两步法向胰岛素分泌细胞诱导,观察其在碱性成纤维细胞生长因子、活化素A、胰岛素样生长因子、尼克酰胺等因子刺激下向胰岛素分泌细胞分化的动态变化.双硫踪染色鉴定胰岛样细胞团,酶联免疫吸附试验检测细胞分泌胰岛素的情况,RT-PCR检测胰岛细胞特异基因的表达.结果:①骨髓间充质干细胞的生长特性及免疫表型:分离培养获得的贴壁细胞,呈形态均一的梭形,流式细胞仪检测CD34、CD45表达阴性,CD29、CD44表达阳性.②向成骨细胞和脂肪细胞的诱导分化:此类细胞经茜素红染色、油红O染色均呈阳性,可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞.③向胰岛素分泌细胞的诱导分化:第1步诱导后出现细胞簇,双硫腙染色不着色,胰岛素分泌量少,仅检测到PDX-1基因的表达,证实其为胰岛前体细胞.第2步诱导后细胞簇数目逐渐上升,至诱导14 d大部分细胞簇经双硫腙染色都呈红色.④诱导后培养上清中胰岛素含量:诱导第3,7,14,21天的胰岛素分泌量分别为(15.3±4.9),(34.1±5.6),(40.4±5.3),(39.8±5.1)mU/L.⑤胰岛细胞特异基因的表达:诱导7 d仅检测到PDX-1基因的表达,insulin 1、insulin 2和Glut 2基因均不表达.诱导14,21 d检测到insulin 2、PDX-1基因表达,insulin 1基因弱表达,Glut 2基因不表达.结论:体外分离、纯化得到的骨髓间充质干细胞诱导7 d可分化出胰岛前体细胞,不具功能性;诱导14 d后可成功地分化出成熟的具有功能性的胰岛素分泌细胞.
作者：王海莲；鞠秀丽；李栋；侯怀水；时庆；沈柏均 刊期： 2007年第33期
目的:探讨用高强度聚焦超声辐照肿瘤细胞制备肿瘤抗原致敏树突状细胞的可行性,为高强度聚焦超声开辟新的应用领域.方法:实验于2004-01/2005-04在泰安市中心医院中心实验室完成.①实验材料:BALB/C清洁级小鼠20只.CT-26肿瘤细胞为BALB/C小鼠来源的结肠癌细胞,由解放军第二军医大学免疫学研究所惠赠.②实验方法:应用白细胞介素4+粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子联合诱导培养小鼠骨髓细胞.设立4组:高强度聚焦超声辐照组将CT-26细胞置于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中,进入对数生长期后调整细胞浓度为5×109 L-1,采用1 000 W/cm2×30 s剂量辐照CT-26细胞,离心,取上清过滤除菌.冻融组将CT-26细胞调整浓度至5×109 L-1,-80℃冷冻,35℃水浴复温,循环4次,裂解离心,取上清过滤除菌.单纯CT-26细胞组将CT-26细胞调整浓度至5×109 L-1,细胞不经其他任何处理.空白对照组将树突状细胞与抗原按1∶10接种,培养4～6 h.从小鼠脾脏制备脾细胞,分离纯化T细胞,调整浓度至2×109 L-1,T细胞与上述4组负载的树突状细胞按20∶1接种,培养基中加入白细胞介素2,共孵育48 h.③实验评估:对扩增培养的树突状细胞首先进行形态学观察,再采用流式细胞仪分析细胞表型.锥虫蓝染色观察高强度聚焦超声辐照后CT-26细胞拒染率和形态学变化.ELISA法检测各组致敏树突状细胞诱导T细胞分泌白细胞介素12及干扰素-γ的含量.结果:①骨髓源性树突状细胞形态及细胞表面表型分析:体外培养小鼠骨髓细胞6～8 d,细胞表面出现较多毛刺样突起,拉长,为典型的树突状细胞特征.流式细胞仪检测树突状细胞表面分子CD80、CD86、H-2Kd及I-Ad呈高表达.②高强度聚焦超声辐照后细胞拒染率和形态学的变化:超声辐照剂量为1 000W/cm2×30 s时,无细胞存活,完全失去细胞形态,全部被撕裂成碎片.③致敏树突状细胞诱导T细胞分泌细胞因子情况:与空白对照组比较,高强度聚焦超声辐照组、冻融组、单纯CT-26细胞组分泌的白细胞介素12及干扰素-γ含量均明显升高(P均＜0.05);且高强度聚焦超声辐照组、冻融组升高幅度大于单纯CT-26细胞组,但此两组比较差异无显著性意义(P＞0.05).结论:高强度聚焦超声能使肿瘤细胞灭活、破碎,其制备的肿瘤抗原可体外致敏树突状细胞,并使树突状细胞分泌白细胞介素12,诱导T细胞分泌干扰素-γ.
作者：邹玉红；崔志芳；韩秋霞；闫华晓；叶欣 刊期： 2007年第33期
目的:成体间充质干细胞发育分化接近终末状态后经过一段时间的体外培养,易衰老凋亡,而来自于早期胚胎的卵黄囊间充质干细胞具有更大的增殖潜能和可塑性.那么体外分离培养的小鼠卵黄囊间充质干细胞能否定向诱导分化为血管内皮细胞呢?方法:实验于2006-03/2007-01在首都医科大学组织学与胚胎学实验室完成.①实验方法:显微分离妊娠10 d的ICR小鼠胚胎卵黄囊,经Ⅰ型胶原酶消化得到卵黄囊细胞,取贴壁细胞培养,于接近90%融合时按1∶2进行传代.②实验评估:取生长状态良好的第1代细胞,透射电镜观察细胞器超微结构,流式细胞仪检测其表面标志的表达;以血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子进行体外诱导,观察诱导后细胞形态及超微结构变化,免疫荧光法鉴定诱导后内皮细胞标志物的表达.结果:①体外分离培养可获得小鼠卵黄囊间充质干细胞,大多数呈梭形.透射电镜下卵黄囊间充质干细胞表面有微绒毛,胞浆中细胞器丰富,核大,形态不规则.流式细胞仪检测第1代卵黄囊间充质干细胞CD44、CD105均呈阳性,CD34亦有少量表达.②诱导后的细胞形态明显改变,透射电镜下可见内皮细胞特征性Weible-Palade小体,胞质中有大量吞饮小泡,同时内皮细胞标志物FLK1染色呈阳性.结论:体外可分离培养出小鼠卵黄囊间充质干细胞,并能够成功定向诱导分化为血管内皮细胞.
作者：韩小强；瓦龙美 刊期： 2007年第33期
目的:观察三七总皂甙对大鼠肝卵圆细胞增殖模型肝脏缝隙连接蛋白32、43表达、缝隙连接细胞间通讯功能和肝卵圆细胞增殖的影响,探讨三七总皂甙调节肝卵圆细胞增殖的可能机制.方法:实验于2004-07/2006-02在江西省分子医学重点实验室完成.①实验材料:健康雄性清洁级Wistar大鼠,体质量150 g左右,随机分成对照组(n=6)、模型组(n=38)、三七总皂甙组(n=37).三七总皂甙注射剂(昆明制药集团股份有限公司惠赠).②实验方法:模型组大鼠按20 mg/(kg·d)剂量灌喂2-乙酰氨基芴,连续4 d,第5天不灌喂,行2/3肝切除,术后次日按20 mg/(kg·d)剂量继续灌喂5 d;三七总皂甙组大鼠按模型组建模时,即第1次2-乙酰氨基芴灌胃前1 h予以三七总皂甙25 mg/(kg·d)腹腔内注射,并持续实验结束.模型组、三七总皂甙组在术后4 h,4 d,8 d,12 d,16 d随机取6只大鼠检测.对照组大鼠未作特殊处理,作正常对照.③实验评估:采用组织病理技术观察肝组织的形态学变化;免疫组织化学和细胞形态学方法计数肝卵圆细胞;切开标记/染料示踪技术确定缝隙连接细胞间通讯;免疫组织化学及RT-PCR技术检测缝隙连接蛋白32蛋白及m RNA表达;免疫组织化学、Western blot及RT-PCR技术分析CX43蛋白及m RNA水平.结果:肝功能衰竭导致模型组大鼠死亡8只,三七总皂甙组死亡7只,共66只进入结果分析.①大鼠肝卵圆细胞的活化、增殖情况:对照组,模型组和三七总皂甙组4 h未见肝卵圆细胞增殖.模型组4 d汇管区有肝卵圆细胞增殖反应,8 d肝卵圆细胞增殖达峰值,12 d肝卵圆细胞从汇管区向肝实质内浸润,16 d肝卵圆细胞增殖较12 d减少.与模型组比较,三七总皂甙组4,8,16 d减少(P＜0.05),12 d增殖肝卵圆细胞增多(P＜0.05).②大鼠肝脏缝隙连接细胞间通讯的变化:各时点模型组、三七总皂甙组大鼠肝脏缝隙连接细胞间通讯均低于对照组(P＜0.01),与模型组比较,三七总皂甙组各时点缝隙连接细胞间通讯升高(P＜0.01).③大鼠肝脏CX32、CX43蛋白及CX32、CX43 mRNA表达:模型组、三七总皂甙组各时点CX32蛋白表达低于对照组(P＜0.05),与模型组比较,三七总皂甙组4 d表达上调(P＞0.05),余时点均明显升高(P＜0.05).模型组CX32mRNA水平4 h～16 d各时点均低于对照组,与模型组比较,三七总皂甙组4 h上调(P＞0.05),4～16 d明显升高(P＜0.05);模型组、三七总皂甙组CX43蛋白表达上调,模型组4 h～16 d各时点CX43蛋白均高于对照组.与模型组比较,三七总皂甙组在4 h下凋(P＞0.05),4 d、8 d时点表达下降(P＜0.01),12,16 d时点升高(P＜0.05,P＜0.01).模型组CX43mRNA4 h～16 d各时点均高于对照组.与模型组比较,三七总皂甙组CX43 mRNA水平与蛋白趋势一致,呈现表达峰值低、持续时间长的特点.结论:三七总皂甙可使大鼠2-乙酰氨基芴喂食+肝切除术模型肝脏的肝卵圆细胞增殖峰低、滞后、持续时间长,其机制与调节大鼠2-乙酰氨基芴喂食+肝切除术模型肝脏的缝隙连接蛋白时空表达模式改变肝脏缝隙连接细胞间通讯功能相关.
作者：刘锡文；李学东；傅华群；黄长文；邢宏松；胡朋 刊期： 2007年第33期
目的:观察心肌梗死后不同时间点移植骨髓间充质干细胞对梗死心肌修复的影响,寻找细胞治疗的有效移植时间窗.方法:实验于2006-04/10在郑州大学基础医学院完成.①实验动物:清洁级6周龄雄性SD大鼠81只,1只用于获取骨髓间充质干细胞,剩余80只随机数字表法分为细胞移植组、培养液对照组,再按心肌梗死后1 d及1,2,3周进行移植的时间各分为4个亚组,10只/组.②实验方法:获取、培养大鼠骨髓间充质干细胞,培养至第3代接近70%融合时,加入5-溴脱氧尿嘧啶体外标记,调整细胞密度为4×1010 L-1备用.两组大鼠均结扎左冠状动脉前降支建立心肌梗死模型.细胞移植组各亚组按对应时间点在心肌梗死中央及四周移植骨髓间充质干细胞悬液50 μL/点(2×106个),培养液对照组各亚组于相同部位移植L-DMEM培养液,50 μL/点.③实验评估:移植前和移植3周后检测心功能;苏木精-伊红、免疫组织化学染色观察心肌梗死区组织及细胞变化.结果:共79只大鼠进入结果分析.①骨髓间充质干细胞的生长特点:刚分离的细胞为圆形.5 d后有集落形成,细胞呈梭形、纺锤形或多角形,胞核较大.传代后细胞体积较原代细胞增大,生长速度加快.②心肌梗死后不同时间移植骨髓间充质干细胞的心功能比较:与移植前比较,移植3周后细胞移植组各亚组左室射血分数、短轴缩短率均有所改善(P＜0.05),以心肌梗死后2周细胞移植组为明显(P＜0.01);培养液对照组各亚组左室射血分数、短轴缩短率均下降(P＜0.05).③梗死心肌组织学观察:细胞移植组心肌梗死区及周边可见核蓝色深染的细胞,排列整齐,梗死区瘢痕化减轻.④骨髓间充质干细胞在心肌组织中的分化:细胞移植组梗死心肌内可见大量BrdU标记阳性的骨髓间充质干细胞,胞核呈棕黄色,对心肌特异性肌钙蛋白T呈阳性表达.结论:心肌梗死后早期移植骨髓间充质干细胞能够改善心功能,以2周内进行细胞移植的效果较佳.
作者：贾敏；卢沛琦；杨继要；王永奎；韩雪飞 刊期： 2007年第33期
目的:如何培养足够的肝细胞以及应用一些物质、因子从而使其增加分裂、减少凋亡?观察银杏内酯和神经生长因子对体外原代培养的人胚肝细胞增殖、凋亡及相关分泌功能的影响具有临床实用性意义.方法:实验于2005-07/2006-10在南通大学神经生物学研究所完成.①细胞来源:孕14～16周流产胎儿,由南通市妇幼保健院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意,实验经医学伦理委员会批准.银杏内酯由中国药科大学提供,神经生长因子为Roche公司产品.②实验方法:用非灌流法从人胚肝中分离肝细胞,以DMEM作为培养基,接种于4块24孔培养板中,每两块培养板各接种36孔,12孔/组,细胞3×105/孔.银杏内酯组各孔加入含37.5 g/L银杏内酯和体积分数为0.1小牛血清的DMEM培养液2 mL,神经生长因子组各孔加入含100 mg/L神经生长因子和体积分数为0.1小牛血清的DMEM培养液2 mL,空白对照组各孔加入仅含体积分数为0.1小牛血清的DMEM培养液2 mL.③实验评估:人胚肝细胞原代培养至9 d,倒置显微镜下计数每视野的肝细胞数,同时行MTT试验,并用流式细胞仪检测肝细胞凋亡情况.分别于培养3,6,9 d时收集肝细胞培养液进行白蛋白含量检测.结果:①原代肝细胞生长情况及肝细胞计数:接种12 h后各组肝细胞均已贴壁,3 d后可见由3～5个细胞组成的细胞集落,至9 d时银杏内酯组和神经生长因子组肝细胞已基本铺满孔底,且呈立体生长倾向,空白对照组肝细胞较少,胞间有空隙存在.至培养9 d,银杏内酯组、神经生长因子组、空白对照组每视野内肝细胞计数差异有显著性意义(F=12.97,P=0.00).②MTT试验结果:原代肝细胞培养至9 d时,银杏内酯组、神经生长因子组、空白对照组吸光度值差异有显著性意义(F=71.90,P=0.00).③肝细胞培养液白蛋白含量:培养3 d时各组细胞培养液的白蛋白含量方差分析无明显差异(F=0.23,P=0.79).培养6,9 d同一时间点组间比较差异有显著性意义(F=11.69,P=0.00;F=9.35,P=0.00).④细胞凋亡情况:银杏内酯组、神经生长因子组、空白对照组凋亡肝细胞百分率分别为11.53%,9.29%,15.27%.结论:银杏内酯和神经生长因子对原代人胚肝细胞的增殖和分泌白蛋白功能均具有促进作用,并抑制细胞凋亡.
作者：徐芳芹；田美玲；胡丽新；秦建兵；金国华 刊期： 2007年第33期
目的:Persephin是近年来发现的对多巴胺神经元的发育与分化起调控作用重要基因,单纯神经干细胞系C17.2移植治疗帕金森病在体内分化为多巴胺能神经元比例不高.实验构建了人Persephin基因重组腺病毒载体,并观察其在C17.2神经干细胞的表达.方法:实验于2005-06/12在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成(广东省重点实验室).①实验材料:流产胚胎由中山大学附属第二医院妇产科提供,产妇及其家属均签署知情同意书.病毒骨架质粒载体pAdEasy-1、穿梭载体PAdTrack-CMV(含绿色荧光蛋白基因)、大肠杆菌菌株BJ5183和DH5α、人胚肾293细胞均为本室保存.C17.2神经干细胞由美国哈佛大学医学院Snyder教授惠赠.②实验方法:采用反转录聚合酶链式反应从人胚胎脑获得Persephin cDNA.将重组质粒pAdTrack-CMV-Persephin与骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒.将重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒AdCMVPersephin,转化体外培养的C17.2神经干细胞.③实验评估:用原位杂交、免疫组化、Westernblot法检测Persephin在C17.2神经干细胞中的表达.结果:①人Persephin基因的克隆与测序分析:琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,其Persephin基因片段长约310 bp,与预期分子量相符.Persephin基因被克隆于载体pMD18-T,以SaiⅠ和XhoⅠ双酶切可回收长约310 bp的克隆片段,测序结果证实所克隆的为人Persephin cDNA.②大肠杆菌同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组及鉴定:Persephin重组腺病毒质粒pAdTrack-CMV-Persephin用PacⅠ酶切可切出4.1 kb的目标片断,PCR鉴定可从重组腺病毒质粒中可扩增出PersephincDNA片断(310 bp).病毒滴度在脂质体转染后为1.9×107 pfu/L.用收集的上清4次重复感染293细胞扩增重组腺病毒后,病毒滴度经绿色荧光蛋白检测达3.0×1011 pfu/L.③Persephjn基因在C17.2神经干细胞中的表达:免疫组化与原位杂交显示转染pAdPersephin的C17.2神经干细胞胞浆中有Persephin蛋白和mRNA表达.提取感染病毒的C17.2神经干细胞的总蛋白,经Western blot检测可见一特异性蛋白条带存在.结论:采用RT-PCR法成功克隆人Persephin cDNA并构建其腺病毒载体,获得了稳定表达Persephin的神经干细胞克隆,为进一步分析转基因神经干细胞治疗神经退行性疾病提供可行的操作方法.
作者：肖颂华；沈庆煜；黄仕雄；刘军；邢诒刚；陶恩祥；彭英 刊期： 2007年第33期
目的:脐血有核细胞中富含多系前体细胞,具备改善受损神经系统功能的潜能.为此建立阻塞性脑卒中动物模型,探讨脐血有核细胞移植对其治疗的可行性.方法:实验于2004-09/2005-05在深圳市宝安区人民医院动物实验室完成.①实验材料:脐带血取自足月新生儿,由深圳宝安血站研究室提供,产妇及其家属均签署知情同意书.SD清洁级成年大鼠80只,随机取20只作为正常对照组,另60只以电凝法建立阻塞性脑卒中模型.剔除运动功能障碍不典型鼠后,随机取5只作为模型观察,余鼠按1∶1随机分为细胞移植组和模型对照组,当出现单只为尾数时,将其分配在细胞移植组.②实验方法:无菌抽取脐血20 mL,加入乙二胺四乙酸抗凝,Ficoll法分离脐血有核细胞.造模后第10天,细胞移植组大鼠将头部固定,按前囟尾侧3.0 mm,中线旁1.5 mm,深度1.2 mm注入1011 L-1脐血有核细胞悬液5 μL,1 μL/min.模型对照组注射等量无细胞脐血清,正常对照组不给予任何干预.③实验评估:造模后4周,5只模型观察大鼠制作脑切片,行苏木精-伊红染色镜检.各组分别于细胞移植前、细胞移植后2,6周进行横木行走实验和触觉刺激试验,检测其运动和触觉功能的恢复.处死各组大鼠制作病理切片,免疫荧光检测脐血有核细胞在脑内生存和分化情况.结果:正常对照组、细胞移植组、模型对照组各20只、24只、24只进入结果分析.①阻塞性脑卒中模型大鼠病理特征:造模大鼠出现行为障碍,缺血部位出现中风囊,病理切片可见缺血坏死区等阻塞性脑卒中所致脑组织病理损伤.②运动和触觉功能测试:细胞移植前,细胞移植组与模型对照组大鼠的横木行走能力、撕胶纸能力均基本相似(P=0.05),且明显低于正常对照组(P＜0.01).移植后第2周,细胞移植组大鼠两项能力均明显强于模型对照组(P＜0.05),但仍低于正常对照组(P＜0.01).移植后第6周,细胞移植组大鼠的横木行走能力明显改善,与正常对照组基本相似(P＞0.05);撕胶纸能力仍低于正常对照组(P＜0.01).③阳性细胞免疫荧光检测:细胞移植组进针注射部位存在大量抗人RNP/CD45双阳性完整细胞,并向大脑中线、皮层梗死部位迁移.所植入的细胞约2.95%表达胶质纤维酸性蛋白,3.41%表达神经特异性烯醇化酶.结论:移植人脐血有核细胞能有效改善阻塞性脑卒中大鼠的运动和触觉功能缺陷.
作者：朱美玲；彭爱军；那晓东；雷俊霞；罗伟琼；邹翠贤；李树浓 刊期： 2007年第33期
背景:许旺细胞培养技术和纯化方法虽不断改良,得到的培养物纯度仍然有限,双重消减法是否可以培养高纯度许旺细胞.目的:采用双重消减法对许旺细胞进行培养,观察其生长情况并测定培养纯度.设计:对照动物实验.单位:首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科,北京市耳鼻咽喉科研究所.材料:实验于2006-03/07在北京市耳鼻咽喉科研究所免疫室和病理室完成.选用20只3天龄Wistar大鼠,雌雄不限,由中国医学科学院实验动物中心提供.方法:分离大鼠坐骨神经,以0.2%胶原酶消化后培养.①分组干预:细胞分为实验组及对照1,2,3组,每组5只.实验组应用双30 min差速贴壁法和Ara-c纯化,对照组1,2分别用双30 min差速贴壁法和Ara-c纯化处理,对照组3不进行纯化.②实验评估:倒置显微镜下观察许旺细胞生长情况;采用MTT法测量实验组和对照组3生长曲线,观察细胞增殖能力;采用免疫细胞化学染色对许旺细胞进行鉴定;计算许旺细胞培养纯度(每个视野S100阳性细胞占所有细胞的比例).主要观察指标:①各组许旺细胞生长情况.②免疫细胞化学染色结果.③细胞生长曲线.④许旺细胞培养纯度.结果:①许旺细胞生长情况:培养5 d时实验组许旺细胞形态及增殖能力良好,偶见成纤维细胞.对照组1、2在培养第5天时可见较多成纤维细胞,许旺细胞形态好,但较少呈漩涡状排列的生长区域.对照组3从培养第2天开始成纤维细胞迅速增殖,所占比例逐渐增大,许旺细胞生长受到影响,突起较短,少见漩涡状生长区域.②许旺细胞生长曲线:实验组许旺细胞于第3天进入对数增殖期,至第6天达平台期.对照组3较实验组提前1 d进入对数增殖期.③免疫细胞化学鉴定结果:实验组经抗S100抗体染色,阳性的许旺细胞胞体及突起呈棕褐色,梭形或三角形,双极突起,漩涡状排列.成纤维细胞形态不规则,胞浆宽大,着蓝色.④许旺细胞计数:实验组S100阳性细胞所占比例高于对照组3(P＜0.01).结论:利用双重消减法得到较高纯度的许旺细胞培养物.
作者：史金凤；雷雳；夏寅 刊期： 2007年第33期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
