王海莲；鞠秀丽；李栋；侯怀水；时庆；沈柏均
目的:成体间充质干细胞发育分化接近终末状态后经过一段时间的体外培养,易衰老凋亡,而来自于早期胚胎的卵黄囊间充质干细胞具有更大的增殖潜能和可塑性.那么体外分离培养的小鼠卵黄囊间充质干细胞能否定向诱导分化为血管内皮细胞呢?方法:实验于2006-03/2007-01在首都医科大学组织学与胚胎学实验室完成.①实验方法:显微分离妊娠10 d的ICR小鼠胚胎卵黄囊,经Ⅰ型胶原酶消化得到卵黄囊细胞,取贴壁细胞培养,于接近90%融合时按1∶2进行传代.②实验评估:取生长状态良好的第1代细胞,透射电镜观察细胞器超微结构,流式细胞仪检测其表面标志的表达;以血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子进行体外诱导,观察诱导后细胞形态及超微结构变化,免疫荧光法鉴定诱导后内皮细胞标志物的表达.结果:①体外分离培养可获得小鼠卵黄囊间充质干细胞,大多数呈梭形.透射电镜下卵黄囊间充质干细胞表面有微绒毛,胞浆中细胞器丰富,核大,形态不规则.流式细胞仪检测第1代卵黄囊间充质干细胞CD44、CD105均呈阳性,CD34亦有少量表达.②诱导后的细胞形态明显改变,透射电镜下可见内皮细胞特征性Weible-Palade小体,胞质中有大量吞饮小泡,同时内皮细胞标志物FLK1染色呈阳性.结论:体外可分离培养出小鼠卵黄囊间充质干细胞,并能够成功定向诱导分化为血管内皮细胞.
作者：韩小强；瓦龙美 刊期： 2007年第33期
目的:观察脊髓损伤后不同时间移植真皮多能干细胞对大鼠运动功能修复的影响.方法:实验于2006-06/2007-03在第三军医大学生理学教研室完成.①实验材料:实验动物2～4月龄SPF级SD大鼠,体质量(210±40)g,雌雄不限,由第三军医大学实验动物中心提供.真皮多能干细胞为第三军医大学防原医学系从SD大鼠真皮中提取和分离.②实验方法:将42只SD大鼠在L4水平制成脊髓全横断损伤模型.将动物随机分为对照组(n=6)、真皮多能干细胞移植组(n=36).真皮多能干细胞移植组又分为6个时间点:损伤后1,4,7,10,14,21 d移植组,每组6只.各移植组于伤处移植大鼠真皮多能干细胞,而对照组于损伤后7 d注射等量磷酸盐缓冲液.③实验评估:分别于移植后1 d、1周、4周、8周、12周对各组大鼠进行动物行为学和脊髓诱发电位检测.结果:42只实验大鼠均进入结果分析,无脱落.①动物行为学评分:4周以后各组动物行为学评分比较差异有显著性意义(P＜0.05),移植组明显高于对照组(P＜0.05),各移植组间比较,以损伤后7,10 d移植组动物行为学评分改善显著.②各组大鼠脊髓诱发电位检查:体感诱发电位和运动诱发电位潜伏期和波幅值于移植后8,12周后明显高于对照组(P＜0.05),各移植组间比较,以损伤后7,10 d移植组体感诱发电位和运动诱发电位潜伏期和波幅值改善显著.结论:脊髓损伤后7～14 d进行真皮多能干细胞移植可明显改善大鼠后肢的运动功能.
作者：王涛；李露斯；刘雁平；屈纪富；徐海伟 刊期： 2007年第33期
目的:临床局部辐射条件下会造成非辐射区域组织及细胞功能损害,为突出的是对造血功能的影响.实验建立60Coγ射线左半身辐射动物模型,观察局部电离辐射对其非辐射区域骨髓巨核细胞的影响.方法:实验于2003-10/2005-03在解放军第三军医大学辐照中心和全军复合伤研究所完成.①实验动物:6～8周龄SPF级雄性昆明小鼠180只,随机数字表法分为正常对照组、全身辐射组、左半身辐射组、全身屏蔽辐射组,45只/组.②实验方法:全身辐射组小鼠固定于辐射架内;左半身辐射组小鼠麻醉后固定体位,用铅砖屏蔽右半身;全身屏蔽辐射组小鼠麻醉固定体位,用铅砖屏蔽全身.以60Coγ射线一次性辐射,剂量率68.46 cGy/min.正常对照组不作任何干预.③实验评估:辐射后不同时相检测小鼠血清丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性变化,计数外周血血小板,检测骨髓巨核祖细胞集落形成单位,观察骨髓组织病理改变及CD41a、CD61的表达.结果:全身辐射组第8天死亡2只,第9天死亡4只,其余各组无脱失.①外周血血小板计数:辐射后第2,7天,左半身辐射组外周血血小板数量显著低于正常对照组(P＜0.01),但高于全身辐射组(P＜0.01).②血清丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性变化:辐射后第2,9天,左半身辐射组血清丙二醛含量显著高于正常对照组(P＜0.01),低于全身辐射组(P＜0.01);血清超氧化物歧化酶活性显著低于正常对照组(P＜0.01),高于全身辐射组(P＜0.01).③骨髓巨核祖细胞集落形成单位的变化:与正常对照组比较,辐射后6 h左半身辐射组非辐射侧的巨核祖细胞集落形成单位显著降低(P＜0.01),高于全身辐射组及左半身辐射组(P＜0.01).④骨髓组织病理改变:正常对照组有核细胞比例较高,分布均匀,并见多量散在分布的细胞龛;辐射2 d后,左半身辐射组非辐射侧骨髓有核细胞较正常对照组减少,但好于全身辐射组、左半身辐射组.⑤骨髓CD41a及CD61表达的变化:辐射后2 d与正常对照组比较,左半身辐射组非辐射侧骨髓CD41a及CD61阳性细胞数和相对荧光强度均显著降低(P＜0.01),但高于全身辐射组、左半身辐射组(P＜0.01).结论:局部电离辐射作用后,可导致小鼠非辐射区域骨髓巨核细胞增殖能力降低,血小板减少,产生功能障碍.氧自由基激活可能参与了该损伤过程.
作者：杨龙；荣曙；许祥裕；罗成基；程天民 刊期： 2007年第33期
目的:观察三七总皂甙对大鼠肝卵圆细胞增殖模型肝脏缝隙连接蛋白32、43表达、缝隙连接细胞间通讯功能和肝卵圆细胞增殖的影响,探讨三七总皂甙调节肝卵圆细胞增殖的可能机制.方法:实验于2004-07/2006-02在江西省分子医学重点实验室完成.①实验材料:健康雄性清洁级Wistar大鼠,体质量150 g左右,随机分成对照组(n=6)、模型组(n=38)、三七总皂甙组(n=37).三七总皂甙注射剂(昆明制药集团股份有限公司惠赠).②实验方法:模型组大鼠按20 mg/(kg·d)剂量灌喂2-乙酰氨基芴,连续4 d,第5天不灌喂,行2/3肝切除,术后次日按20 mg/(kg·d)剂量继续灌喂5 d;三七总皂甙组大鼠按模型组建模时,即第1次2-乙酰氨基芴灌胃前1 h予以三七总皂甙25 mg/(kg·d)腹腔内注射,并持续实验结束.模型组、三七总皂甙组在术后4 h,4 d,8 d,12 d,16 d随机取6只大鼠检测.对照组大鼠未作特殊处理,作正常对照.③实验评估:采用组织病理技术观察肝组织的形态学变化;免疫组织化学和细胞形态学方法计数肝卵圆细胞;切开标记/染料示踪技术确定缝隙连接细胞间通讯;免疫组织化学及RT-PCR技术检测缝隙连接蛋白32蛋白及m RNA表达;免疫组织化学、Western blot及RT-PCR技术分析CX43蛋白及m RNA水平.结果:肝功能衰竭导致模型组大鼠死亡8只,三七总皂甙组死亡7只,共66只进入结果分析.①大鼠肝卵圆细胞的活化、增殖情况:对照组,模型组和三七总皂甙组4 h未见肝卵圆细胞增殖.模型组4 d汇管区有肝卵圆细胞增殖反应,8 d肝卵圆细胞增殖达峰值,12 d肝卵圆细胞从汇管区向肝实质内浸润,16 d肝卵圆细胞增殖较12 d减少.与模型组比较,三七总皂甙组4,8,16 d减少(P＜0.05),12 d增殖肝卵圆细胞增多(P＜0.05).②大鼠肝脏缝隙连接细胞间通讯的变化:各时点模型组、三七总皂甙组大鼠肝脏缝隙连接细胞间通讯均低于对照组(P＜0.01),与模型组比较,三七总皂甙组各时点缝隙连接细胞间通讯升高(P＜0.01).③大鼠肝脏CX32、CX43蛋白及CX32、CX43 mRNA表达:模型组、三七总皂甙组各时点CX32蛋白表达低于对照组(P＜0.05),与模型组比较,三七总皂甙组4 d表达上调(P＞0.05),余时点均明显升高(P＜0.05).模型组CX32mRNA水平4 h～16 d各时点均低于对照组,与模型组比较,三七总皂甙组4 h上调(P＞0.05),4～16 d明显升高(P＜0.05);模型组、三七总皂甙组CX43蛋白表达上调,模型组4 h～16 d各时点CX43蛋白均高于对照组.与模型组比较,三七总皂甙组在4 h下凋(P＞0.05),4 d、8 d时点表达下降(P＜0.01),12,16 d时点升高(P＜0.05,P＜0.01).模型组CX43mRNA4 h～16 d各时点均高于对照组.与模型组比较,三七总皂甙组CX43 mRNA水平与蛋白趋势一致,呈现表达峰值低、持续时间长的特点.结论:三七总皂甙可使大鼠2-乙酰氨基芴喂食+肝切除术模型肝脏的肝卵圆细胞增殖峰低、滞后、持续时间长,其机制与调节大鼠2-乙酰氨基芴喂食+肝切除术模型肝脏的缝隙连接蛋白时空表达模式改变肝脏缝隙连接细胞间通讯功能相关.
作者：刘锡文；李学东；傅华群；黄长文；邢宏松；胡朋 刊期： 2007年第33期
目的:选择新生兔为实验对象,观察体外培养破骨细胞形态学和生物学特征.方法:实验于2007-03/06在辽宁医学院生理实验室完成.采用改良Chambers法机械分离兔四肢长骨获得新生兔(出生24 h内)的破骨细胞,并应用倒置显微镜、光镜观察其形态学特征.结果:①倒置显微镜观察结果:培养1 d后,细胞贴壁生长,数量增多,第3天后,可见多核巨细胞,呈油煎蛋、长条形,漏斗形等.②光镜观察结果:苏木精-伊红染色可见破骨细胞胞浆丰满,呈浅粉色,内含许多空泡结构,核3～20个不等,核呈浅蓝色,每个核含一两个核仁,有时周围伸出伪足样胞浆突起;Giemsa染色核集中于细胞中央或散在于细胞周边,呈花篮状,核浅粉色,胞浆着色较浅,其中可见数个大小不等未着色空泡;TRAP染色胞浆呈酒红色颗粒,核蓝色,核仁一两个;甲苯胺蓝染色可见骨吸收陷窝呈蓝紫色,圆形,椭圆形或不规则形,边界清晰,其边缘反光性强.结论:应用改良Chambers法可成功获得新生兔破骨细胞,且具有骨吸收功能.
作者：任媛媛；张健 刊期： 2007年第33期
目的:观察褪黑素对自身免疫性肝炎大鼠模型外周血淋巴细胞亚群的影响方法:实验于2004-10/2006-10在解放军第一二三医院南京军区肝病中心实验室完成.①实验材料:Wistar大鼠,雄性,3月龄,体质量(230±20)g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司.褪黑素:美国Sigma公司产品,临用前以无水乙醇溶解,再加生理盐水配制,使乙醇浓度为0.1%,置4℃冰箱保存备用.②实验方法:采用弗氏完全佐剂加肝细胞特异性脂蛋白法制作大鼠自身免疫性肝炎模型.将建模成功大鼠随机分为模型对照组、褪黑素注射组及猪促肝细胞生长素注射组,每组20只.褪黑素注射组褪黑素2 mg/kg腹腔注射,1次/d,猪促肝细胞生长素注射组2 mg/kg猪促肝细胞生长素腹腔注射,1次/d,模型对照组与正常对照组均用含0.01%乙醇的生理盐水腹腔注射.③实验评估:60 d后检测各组大鼠外周血淋巴细胞亚群浓度.结果:①CD4+细胞≤39.5%18只,均为褪黑素注射组动物,肝炎组织活动性指数≤8分.22只CD4+细胞＞39.5%动物中,4只肝炎组织活动性指数≤8分,其中2只为褪黑素注射组动物,2只为模型对照组动物.18只肝炎组织活动性指数＞8分,均为模型对照组动物.②18只CD4+细胞≤39.5%褪黑素注射组动物中,17只肝纤维化指数≤4分,1只肝纤维化指数4分;22只动物CD4+细胞＞39.5%,2只肝纤维化指数≤4分,为模型对照组动物,20只肝纤维化指数＞4分,褪黑素注射组2只,模型对照组18只.③CD4+细胞≤39.5%,肝组织血管病变均为1级,＞39.5%时,2级以上血管病变为90.9%.18只CD4+细胞≤39.5%褪黑素注射动物血管病变为1级.22只CD4+细胞百分比＞39.5%,2只血管病变为1级,为模型对照动物,17只血管病变为2级,褪黑素注射组2只,模型对照组15只.3只血管病变为3级,为模型对照动物.④CD4+细胞≤39.5%时,83.3%血管内皮细胞生长因子表达呈弱阳性,CD4+细胞＞39.5%时,81.8%血管内皮细胞生长因子表达呈强阳性,提示CD4+细胞与血管内皮细胞生长因子表达有关.⑤模型对照组外周血CD4+细胞数和CD4+/CD8+比值均明显高于其他组(P＜0.05),CD8+细胞与其他组无明显差异(P＞0.05).褪黑素注射动物与猪促肝细胞生长素注射动物相比,无明显差异(P＞0.05).结论:褪黑素对自身免疫性肝炎模型大鼠外周血CD4+细胞有较强的抑制作用.
作者：丁体龙；马勇；于莉；夏志学 刊期： 2007年第33期
目的:对晚期脊髓损伤患者开展嗅鞘细胞再移植治疗,探讨其对神经功能的继续改善效果.方法:①患者男性,27岁,哈萨克斯坦籍,2001年9月20日遭霰弹枪击急诊手术后,双下肢不能运动及感觉消失,尿便失禁,右下肢阵发性钝痛.诊断为陈旧性完全性脊髓损伤(T12),美国脊髓损伤协会标准脊髓功能分级为A级.2002年9月30日第1次行脊髓胚胎嗅鞘细胞移植术,2007年2月5日行第2次脊髓胚胎嗅鞘细胞移植术.治疗方案患者知情同意.②取4个月流产胚胎(孕妇及其家属均知情同意)的嗅球,消化成单个嗅鞘细胞后培养2周,细胞浓度约2×1010 L-1.于患者相应脊髓损伤上端(平T11椎体)做1个锁孔,直径约3 cm,在脊髓损伤部位与正常脊髓交界处沿中线于无血管区,分两点用4.5号细针共注入100 μL(第1次手术)、50 μL(第2次手术)嗅鞘细胞悬液,细胞数均为1×106个.第2次移植术前进行供、受体细胞HLA配型,术后口服FK506胶囊2 mg,2次/d,共42 d.结果:①第1次术后3个月,排尿能控制6 h,双足运动功能改善,性功能改善,阴茎勃起功能改善,疼痛减轻.②第2次术后10 d,双下肢双足皮肤泌汗功能改善,右下肢疼痛减轻,腹部皮肤感觉稍有好转,针刺觉左侧由术前T10皮节消失好转至T10减退.较第2次移植前椎旁躯体感觉诱发电位有所改善,双侧椎旁电位从T10下降到T12.结论:胚胎嗅鞘细胞二次移植能继续改善晚期脊髓损伤患者的神经功能.但移植的细胞数量、容积、注射点位置等需深入探讨.
作者：陈琳；黄红云；江昭；张峰；郗海涛；张健；刘彦铖；王洪美 刊期： 2007年第33期
目的:前期实验已成功构建无突变及564位是单突变腺病毒载体.在此基础上构建人双突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体,为进一步研究低氧诱导因子1α基因及其突变体的临床应用奠定基础.方法:实验于2005-12/2006-12在南方医院心内科重点实验室完成.①实验材料:限制性内切酶Pacl(NEB),PI-Scel、I-Ceul(Clontech);IPTG、C-Gal(Takara),转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen),凝胶回收试剂盒(Omega);DMEM(Omega);小牛血清(PAA);北京天为时代公司病毒基因组提取试剂盒;HIF-1α单克隆抗体(Chemicon International公司);羊抗鼠辣根过氧化物酶标记二抗(北京鼎国生物公司).质粒、菌珠、细胞系等:Adeno-XTM-Adenoviral Expression Systems(BD.CLONTECH):包括有pShuttle2、pShuttle2-lacZ、Adeno-XTM Viral DNA等;重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala564-Ala803及pShuttle2-lacZ(本室已构建成功);大肠杆菌DH5α(本室保存);HEK293A细胞(中科院上海细胞所).②实验方法:采用分子克隆技术,以Pl-Scel和I-Ceul双酶切重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala564-Ala803,然后切下含有低氧诱导因子1αcDNA表达的盒片段,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-X Viral DNA连接,重组成pAdeno-HIF-1α腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,在HEK293A细胞中包装成为重组腺病毒Adeno-HIF-1α-Ala564-Ala803.③实验评估:进行PCR鉴定及滴度测定.用重组腺病毒转染293A,采用Westernblot鉴定低氧诱导因子1α蛋白表达.结果:提取重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala564-Ala803以引物A、B和引物1、2、3、4进行PCR鉴定,分别扩增出287,460,214bp的3种引物片段,与预期一致,经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功.pAdeno-lacZ转染293A细胞后X-Gal原位染色,显示约有近20%左右细胞染成蓝色,病毒滴度为6.8×107 pfu/mL.Adeno-HIF-1α-Ala564-Ala803转染293A后稳定表达低氧诱导因子1α蛋白.结论:成功构建了重组腺病毒突变型的Adeno-HIF-1α-Ala564-Ala803.
作者：胡英芳；王月刚；谢宜军；赖文岩；赖艳娴；吴平生 刊期： 2007年第33期
目的:灵芝对于免疫系统的调节还缺乏严格的临床证据,其关键是缺乏客观、系统评价灵芝对免疫系统调节效果的手段.基于此,采用基因芯片分析检测了灵芝对免疫相关基因表达水平的影响,从而揭示与灵芝功能密切相关的基因和途径.方法:实验于2002-12/2003-05在首都医科大学宣武医院神经分子生物实验室完成.①实验干预:血液材料来源于身体健康的宣武医院医护人员和学生12人,均对检测项目知情同意.平均年龄(31±4)岁,男女各6人.将其分为年龄、性别大致匹配的2组:安慰剂组和灵芝组,每组6人.灵芝组和安慰剂组对象分别服用灵芝胶囊和淀粉胶囊安慰剂,每人每天服用2次,每次2粒(相当于药用灵芝400 mg),连续30 d.灵芝胶囊主要成分为软壁灵芝孢子粉、灵芝提取物.②实验评估:服药前1天和服药30 d后采用自动分析仪计算全血不同种类白细胞计数和不同种类白细胞所占比例.分离白细胞抽提总RNA,利用博星公司的cDNA芯片Biostar-H-IC-I检测了服用灵芝胶囊后白细胞中441个免疫相关基因的表达变化.结果:①所检测的441个免疫相关基因中,共有11个基因存在着差异表达.其中10个基因表达水平升高,1个基因表达水平降低.发生差异表达的11个基因中有2个参与信号转导过程,包括STAT4和LYN.服用灵芝胶囊后两个基因的表达量都显著增加.在发生差异表达的11个基因中有7个基因属于淋巴细胞表面抗原.②服用灵芝胶囊和安慰剂后白细胞总数和不同种类白细胞的百分比均未发生明显变化(P＞0.05).结论:①灵芝对免疫系统的调节功能主要通过调节淋巴细胞的活性而实现,而不是通过改变白细胞数量和分类计数.②STAT4和LYN参与的信号转导途径很有可能是灵芝胶囊作用的主要靶点.
作者：丁晖；蔡彦宁；温玫；陈彪 刊期： 2007年第33期
目的:评价不同阳离子脂质体介导基因转染血管内皮细胞的转染效率.方法:实验于2006-12/2007-02在中山大学生化实验室及广州市创伤外科研究所完成.采用增强型绿色荧光蛋白基因为报告基因,分别采用Lipofectin、Lipofectamine、Dosper 3种不同的阳离子脂质体为载体,转染人脐静脉血管内皮细胞.在24孔板中,每孔加入人脐静脉血管内皮细胞悬液(1×106个细胞),各孔分别加入3种不同阳离子脂质体增强型绿色荧光蛋白质粒复合物,分别于培养24,48 h后用荧光显微镜及流式细胞仪测定增强型绿色荧光蛋白在细胞内的表达及转染效率.结果:3种不同阳离子介导的增强型绿色荧光蛋白基因转染的人脐静脉血管内皮细胞内均有绿色荧光蛋白表达,24 h后明显,48 h后达高峰.Dosper介导组绿色荧光细胞百分比明显高于Lipofectin介导组及Lipofectamine介导组,差异有非常显著意义(P＜0.01).结论:Dosper介导的血管内皮细胞基因转染效率较高,较适合作为血管内皮细胞的基因转染载体.
作者：童仁联；杨黎；张金明；邹海燕；张璇；梁佩红；戴丽冰；李叶扬 刊期： 2007年第33期
目的:建立受强力霉素调控高表达外源基因的真核表达体系-永生化骨骺干细胞株,为调控甲状旁腺相关肽的不同片断在骨骺干细胞中的表达打下基础.方法:实验于2006-09/2007-03在同济医学院矫形外科实验室完成.①实验材料:SD大鼠的乳鼠由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供,雄鼠4只,雌鼠6只.②实验方法:取SD大鼠的乳鼠10只,显微镜下选取La Croix环处的软骨及软骨前体细胞(骨骺干细胞),采用磁性细胞分选的方法,分离出原代骨骺干细胞,并用PCMVSV40质粒将其永生化.用脂质体介导法将pTet-on质粒转染已永生化的骨骺干细胞,通过G418筛选并经有限稀释法进行单克隆化,得到稳定转染的抗性克隆并将其分别扩增培养.将pTRE2hyg-IUC质粒瞬时转染扩增后的单克隆细胞,加入终浓度为1 mg/L的强力霉素诱导剂培养,48 h后逐一检测每个细胞株的荧光素酶表达活性,逐一筛选强力霉素调控高表达外源基因的永生化骨骺干细胞株.③实验评估:将挑选出的第23号克隆扩增培养,加入0.01,0.1,0.5,1,5mg/L强力霉素进行诱导培养,并设置3组对照,一组为空白对照(蒸馏水),一组为未转染Tet-on系统的骨骺干细胞(均加入1 mg/L 0.1 mg/强力霉素诱导),另一组为转染后的骨骺干细胞不加入强力霉素诱导.观察强力霉素对骨骺干细胞的优诱导质量浓度. 结果:第23号克隆的细胞经诱导后荧光素酶的表达活性为85 790,而非诱导状态下该细胞株的活性为437,诱导后的活性增加196.3倍.强力霉素质量浓度梯度实验提示,强力霉素的优诱导质量浓度是1 mg/L左右,质量浓度过高可导致细胞死亡,过低时诱导效率降低.结论:永生化骨骺干细胞株可用于真核调控高表达,为研究甲状旁腺相关肽的不同功能片断与骨骺干细胞的分化机制的关系打下了基础.
作者：李明辉；郭风劲；张树威；宋登新；王江；易磊 刊期： 2007年第33期
目的:建立原发性血小板减少性紫癜动物模型,观察加味小柴胡颗粒及其组方对造模小鼠血浆内皮素含量的调节.方法:实验于2006-07/12在南京中医药大学第一临床医学院实验中心完成.①实验动物与药品:选取SPF级BALB/C小鼠54只,随机数字表法分为5组:正常组10只、模型组12只、加味小柴胡颗粒组11只、小柴胡颗粒组11只、丹参三七颗粒组10只.小柴胡颗粒主要成份为柴胡、黄芩、法半夏、党参、炙甘草、生姜、大枣,每克颗粒含生药5.45 g;丹参三七颗粒每克含生药2 g;加味小柴胡颗粒:在小柴胡颗粒主要成份上添加丹参、三七,每克颗粒含生药4.18 g;均由天江制药厂提供.②实验方法:除正常组外,各组均建立原发性血小板减少性紫癜动物模型.造模后7 d灌胃给药,加味小柴胡颗粒组给予加味小柴胡颗粒16.7 g生药/kg体质量,小柴胡颗粒组给予小柴胡颗粒13.8 g生药/kg体质量,丹参三七颗粒组给予丹参三七颗粒4.4 g生药/kg体质量,正常组及模型组均给予等容积蒸馏水.每天给药1次,共给药14 d.③实验评估:各组小鼠眼球取血,分离血浆,取上清液用放射免疫法测定血浆内皮素含量.结果:54只BALB/CC小鼠均进入结果分析.与正常组比较,模型组血浆内皮素含量明显升高(P＜0.05).与模型组比较,加味小柴胡颗粒组、丹参三七颗粒组明显下降(P＜0.05),而小柴胡颗粒组无明显变化(P＞0.05).结论:原发性血小板减少性紫癜血管内皮功能异常,表现为血浆内皮素明显升高,加味小柴胡颗粒及丹参三七颗粒均对其有下调作用,而小柴胡颗粒无影响.
作者：王缨；夏卫军 刊期： 2007年第33期
背景:许旺细胞培养技术和纯化方法虽不断改良,得到的培养物纯度仍然有限,双重消减法是否可以培养高纯度许旺细胞.目的:采用双重消减法对许旺细胞进行培养,观察其生长情况并测定培养纯度.设计:对照动物实验.单位:首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科,北京市耳鼻咽喉科研究所.材料:实验于2006-03/07在北京市耳鼻咽喉科研究所免疫室和病理室完成.选用20只3天龄Wistar大鼠,雌雄不限,由中国医学科学院实验动物中心提供.方法:分离大鼠坐骨神经,以0.2%胶原酶消化后培养.①分组干预:细胞分为实验组及对照1,2,3组,每组5只.实验组应用双30 min差速贴壁法和Ara-c纯化,对照组1,2分别用双30 min差速贴壁法和Ara-c纯化处理,对照组3不进行纯化.②实验评估:倒置显微镜下观察许旺细胞生长情况;采用MTT法测量实验组和对照组3生长曲线,观察细胞增殖能力;采用免疫细胞化学染色对许旺细胞进行鉴定;计算许旺细胞培养纯度(每个视野S100阳性细胞占所有细胞的比例).主要观察指标:①各组许旺细胞生长情况.②免疫细胞化学染色结果.③细胞生长曲线.④许旺细胞培养纯度.结果:①许旺细胞生长情况:培养5 d时实验组许旺细胞形态及增殖能力良好,偶见成纤维细胞.对照组1、2在培养第5天时可见较多成纤维细胞,许旺细胞形态好,但较少呈漩涡状排列的生长区域.对照组3从培养第2天开始成纤维细胞迅速增殖,所占比例逐渐增大,许旺细胞生长受到影响,突起较短,少见漩涡状生长区域.②许旺细胞生长曲线:实验组许旺细胞于第3天进入对数增殖期,至第6天达平台期.对照组3较实验组提前1 d进入对数增殖期.③免疫细胞化学鉴定结果:实验组经抗S100抗体染色,阳性的许旺细胞胞体及突起呈棕褐色,梭形或三角形,双极突起,漩涡状排列.成纤维细胞形态不规则,胞浆宽大,着蓝色.④许旺细胞计数:实验组S100阳性细胞所占比例高于对照组3(P＜0.01).结论:利用双重消减法得到较高纯度的许旺细胞培养物.
作者：史金凤；雷雳；夏寅 刊期： 2007年第33期
目的:如何培养足够的肝细胞以及应用一些物质、因子从而使其增加分裂、减少凋亡?观察银杏内酯和神经生长因子对体外原代培养的人胚肝细胞增殖、凋亡及相关分泌功能的影响具有临床实用性意义.方法:实验于2005-07/2006-10在南通大学神经生物学研究所完成.①细胞来源:孕14～16周流产胎儿,由南通市妇幼保健院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意,实验经医学伦理委员会批准.银杏内酯由中国药科大学提供,神经生长因子为Roche公司产品.②实验方法:用非灌流法从人胚肝中分离肝细胞,以DMEM作为培养基,接种于4块24孔培养板中,每两块培养板各接种36孔,12孔/组,细胞3×105/孔.银杏内酯组各孔加入含37.5 g/L银杏内酯和体积分数为0.1小牛血清的DMEM培养液2 mL,神经生长因子组各孔加入含100 mg/L神经生长因子和体积分数为0.1小牛血清的DMEM培养液2 mL,空白对照组各孔加入仅含体积分数为0.1小牛血清的DMEM培养液2 mL.③实验评估:人胚肝细胞原代培养至9 d,倒置显微镜下计数每视野的肝细胞数,同时行MTT试验,并用流式细胞仪检测肝细胞凋亡情况.分别于培养3,6,9 d时收集肝细胞培养液进行白蛋白含量检测.结果:①原代肝细胞生长情况及肝细胞计数:接种12 h后各组肝细胞均已贴壁,3 d后可见由3～5个细胞组成的细胞集落,至9 d时银杏内酯组和神经生长因子组肝细胞已基本铺满孔底,且呈立体生长倾向,空白对照组肝细胞较少,胞间有空隙存在.至培养9 d,银杏内酯组、神经生长因子组、空白对照组每视野内肝细胞计数差异有显著性意义(F=12.97,P=0.00).②MTT试验结果:原代肝细胞培养至9 d时,银杏内酯组、神经生长因子组、空白对照组吸光度值差异有显著性意义(F=71.90,P=0.00).③肝细胞培养液白蛋白含量:培养3 d时各组细胞培养液的白蛋白含量方差分析无明显差异(F=0.23,P=0.79).培养6,9 d同一时间点组间比较差异有显著性意义(F=11.69,P=0.00;F=9.35,P=0.00).④细胞凋亡情况:银杏内酯组、神经生长因子组、空白对照组凋亡肝细胞百分率分别为11.53%,9.29%,15.27%.结论:银杏内酯和神经生长因子对原代人胚肝细胞的增殖和分泌白蛋白功能均具有促进作用,并抑制细胞凋亡.
作者：徐芳芹；田美玲；胡丽新；秦建兵；金国华 刊期： 2007年第33期
背景:无症状人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)感染者不适宜抗病毒治疗,中医药早期干预对无症状带毒期HIV感染者会产生一定的治疗意义.目的:观察扶正排早期干预HIV感染者CD4+T淋巴细胞水平及血浆病毒载体量变化.设计:观察对比试验.单位:河南中医学院艾滋病研究所.对象:于2005-11随机抽取HIV感染者较多的某乡69例有偿献血感染的无症状HIV感染者,男39例,女30例,年龄30～61岁,平均(43±8)岁,平均病程(13±3)年.纳入标准:①符合中华人民共和国国家艾滋病无症状HIV感染诊断标准(2005年修订版).②年龄18～65岁.③200/mm3≤CD4+T淋巴细胞计数＜600/mm3.④未使用抗病毒药物及其它药物治疗者.⑤签署知情同意书.排除标准:①严重肝肾功能不全,或合并心脑血管、肺和造血系统等严重原发性疾病,精神病患者.②原发性免疫缺陷患者,激素、化疗等引起的继发性免疫缺陷患者,血液病患者.③妊娠或哺乳期妇女.随机抽取的某个县的25例无症状HIV感染者为空白组,纳入标准、排除标准与治疗组相同.方法:治疗方案:治疗组感染者给予扶正排毒片(黄芪、生白术、防风、白花蛇舌草、甘草等11味,河南省中医研究院奥林特制药厂生产,产品批号:050601),每次5片,相当于生药6.6 g,3次/d,温开水冲服.3个月为1疗程,共观察4个疗程.空白组不服药.主要观察指标:①检测治疗组感染者治疗前和每疗程结束后CD4+、CD8+及CD4+/CD8+值,空白组只检测6个月前后CD4+T淋巴细胞计数.②采用RT-PCR检测方法进行治疗组患者病毒载量检测.结果:治疗组感染者69例及空白组感染者25例均进入结果分析.①空白组感染者6个月前后CD4+较治疗前明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05).②随机抽取23例治疗组感染者进行病毒载量检测,与疗前对比,疗后6个月有9例血浆病毒载量下降较多,疗后1年12例血浆病毒载量下降较多.疗前和疗后6个月及1年对比有效率均达91.30%.结论:扶正排毒片早期干预HIV感染者可提高其免疫功能,对部分病例具有降低病毒载量的作用.
作者：彭勃；刘学伟；郭会军 刊期： 2007年第33期
背景:脂肪间充质干细胞具有多向分化能力,并且相对更加容易获得,因此作为一种新的细胞工程的种子细胞日渐受到重视.目的:观察从大鼠皮下分离脂肪间充质干细胞的体外培养情况,并对其进行免疫细胞化学染色等鉴定.设计:动物实验.单位:解放军总医院心内科.材料:选用1只健康雄性Wistar大鼠,清洁级,鼠龄4个月,体质量200 g;Ⅰ型胶原酶、DMEM培养基、特级胎牛血清(GIBCO公司);免抗大鼠CD13、CD34、CD44、105、Ⅷ因子、HLA-DR、VWF、Myosin等多克隆抗体及SABC试剂盒(武汉博士德公司);绿色荧光蛋白-重组腺病毒包装载体为北京本元正阳基因技术有限公司产品.方法:实验于2006-10在解放军总医院心内科完成.①细胞分离和培养:全麻下取Wistar大鼠腹股沟脂肪垫0.3 g,剪碎,消化后培养,镜下观察有大量梭形贴壁细胞后二三天换DMEM培养液,观察细胞生长情况.调整细胞浓度为2×107 L-1接种于96孔细胞培养板,每孔100 μL.从第2天起每日随机取3孔,胰蛋白酶消化细胞,分别用血球计数板在倒置显微镜下计数.②细胞存活率的计算:收集第3至第8代细胞,加入预配好的DMSO冻存液,2～4周后复苏,台盼蓝染色检测细胞存活率.③免疫细胞化学染色及鉴定:以2×107 L-1的细胞数接种多孔培养板,24 h后行CD13、CD34、CD44、CD45、CD105、Ⅷ、HLA-DR、VWF因子等细胞表面抗体的免疫细胞化学(SABC法)鉴定及油红染色.④多细胞系定向诱导分化及鉴定:用多孔板接种后加含特定诱导因子的培养基进行多系定向诱导分化,并进行油红O脂肪颗粒染色,对成骨诱导组进行碱性磷酸酶组化染色,对成心肌诱导组进行肌浆球蛋白免疫组化染色.⑤转染腺病毒携带的绿色荧光蛋白基:用96孔板接种第4代ADMSC,同时加入Ⅰ型腺病毒为载体的绿色荧光蛋白,以不同MOI值1∶50、1∶100、1∶150、1∶200转染,观察转染情况.主要观察指标:①细胞分离和培养观察结果.②冻存与复苏后细胞存活率.③免疫细胞化学染色及鉴定结果.④多细胞系定向诱导分化及鉴定结果.⑤转染腺病毒携带的绿色荧光蛋白结果.结果:①从0.3 g皮下脂肪分离出约3.6×105贴壁细胞,并可在体外多代传代培养扩增.②细胞冻存2～4周后复苏用台盼蓝染色示存活率在90%以上.③各代CD13、CD44、CD105等免疫细胞化学染色均阳性,CD45、Ⅷ因子、HLA-DR、VWF等免疫细胞化学染色均阴性.④从第2代开始,各代均可见少量细胞油红O染色阳性,而且在延长培养基的换液时间后,油红O染色阳性细胞明显增多.体外多系定向诱导分化后油红O染色、碱性磷酸酶染色、肌浆球蛋白免疫组化检测分别阳性.⑤转染72 h后荧光显微下观察,在MOI值1∶200见绝大多数细胞发出绿色荧光,转染成功,粗测转染率在90%以上.结论:可以从大鼠皮下脂肪成功分离出大量具有成脂、成骨、成肌等多向分化潜能的间充质干细胞,该细胞可以在体外培养进行多代传代及大量扩增、长期冷冻保存,并且成功转染了Ⅰ型腺病毒为载体的绿色荧光蛋白基因.
作者：秦宇红；陈光辉；边素艳；张琰琴；李天德 刊期： 2007年第33期
目的:报告1例低体质量儿童行外周血干细胞采集过程中出现输血反应的情况.方法:患儿,女,6岁,体质量16 kg,于2005-08/2005-09入院,诊断为神经母细胞瘤Ⅳ期.外周血干细胞采集预处理方案为环磷酰胺1 g/d×2 d、法玛新10 mg/d×3 d、长春新碱0.4 mg/d×5 d.采集前30 min给予地塞米松2.5 mg预防输血反应的发生.外周血干细胞采集应用CS-3000 Plus血细胞分离机,调至儿童采集程序,配以小体积分离槽和小体积收集槽.机器正常初始化后,采用去白辐照悬浮红细胞100 mL,将其用生理盐水1∶1稀释至200 mL,进行全血灌注冲盈管路.当返血管路返出全血、首次溢出结束后停机,将其与患儿管路相连接,开机时全血流速设定为15 mL/min.结果:①第1次开机19 min后,患儿从耳阔至面部出现潮红,随即出现红色皮疹、瘙痒、燥动不安,过5 min后全身出现红疹,血压90/60 mm Hg,心率124次/min,立即停机用盐水维持通路,静脉给予地塞米松2 mg,非那根25 mg,10%葡萄糖酸钙10 mL,临床观察10 min后患儿安静入睡,血压90/70 mm Hg,心率120次/min,重新开机,设定全血流速为15 mL/min,20 min后提高全血流速至25 mL/min,共循环5 000 mL,用时3小时26分.②次日,开机前30 min给予地塞米松5 mg,开机后10 min患儿出现胸闷,全身无皮疹,心率90次/min,停机,盐水维持密切观察,10 min后患儿无不适,心率100次/min,重新开机,共循环5 000 mL全血,用时3小时38分.结论:①低体质量儿童在外周血干细胞采集过程中出现输血反应后,经及时处理顺利完成采集,并获得了足够的外周血干细胞.②设定全血流速15 mL/min是CS-3000 Plus血细胞分离机运转程序的低限,输血速度较快,这可能是小儿发生输血过敏反应的一个因素.
作者：刘小超；吴轶苹；黄东生；张伟令；王阳；李淑平 刊期： 2007年第33期
目的:有较多的学者提出,中枢神经系统是一个部分免疫豁免区,仍然存在干细胞移植后的排异问题,为求证免疫排异的存在与否,实验拟探讨人胚神经干细胞移植治疗脑液压损伤大鼠的移植免疫及其对策.方法:实验于2003-01/2003-07在北京神经外科研究所神经干细胞室完成.①实验材料:人胚来源:12周龄死胎大脑,产妇及家属知情同意,来自北京天坛医院产科.SD雌性大鼠30只,体质量(290±10)g,购自中国医学科学院实验动物研究所.②实验方法:体外培养人胚神经干细胞,并用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记,液压冲击大鼠右侧大脑皮质运动感觉区制作脑损伤模型,将其分为实验组与对照组.实验组在移植人胚神经干细胞后使用地塞米松腹腔注射,对照组移植人胚神经干细胞后仅使用生理盐水腹腔注射.③实验评估:脑外伤后24 h移植人胚神经干细胞,于人胚神经干细胞移植后1周脑组织切片免疫组织化学染色检测BrdU、巢蛋白、微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白蛋白表达.采用流式细胞仪计数分析检测大鼠脑组织CD4+T细胞淋巴细胞占总淋巴细胞的百分比.结果:两组移植后1周,均见BrdU阳性细胞从移植区域向周围扩散,切片巢蛋白、微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白均为阳性,且微管相关蛋白2阳性细胞较多;实验组侧脑室脉络丛和脑实质的微血管中只见有少量的BrdU阳性细胞,对照组脉络丛中见大量聚集的BrdU阳性细胞.两组CD4+T淋巴细胞占总淋巴细胞的百分比差异有显著意义(P＜0.05).结论:异种神经干细胞移植治疗脑损伤可能存在免疫排斥反应,地塞米松对其存在抑制作用.
作者：龙新兵；张泽舜；韩富；万虹 刊期： 2007年第33期
目的:感染有可能是自身免疫性疾病患者造血干细胞移植过程中的主要并发症,选择此类患者42例分析其临床感染特点与高危因素.方法:①实验对象:选取1999-01/2006-06郑州市第三人民医院收治的接受自体造血干细胞移植的重症自身免疫性疾病患者42例,移植前平均病程3年.实验经医院医学伦理委员会批准,患者均签署知情同意书.②实验方法:环磷酰胺150 mg/kg+抗人胸腺球蛋白/抗人淋巴细胞球蛋白预处理30例,环磷酰胺200 mg/kg+抗人胸腺球蛋白/抗人淋巴细胞球蛋白预处理12例;CD34+细胞纯化移植17例,CD34+细胞未纯化移植25例.移植过程中无菌层流室全环境保护,当患者体温＞38℃时立即采集血液标本,15 min/次,连续3次.同时依据感染部位,采集相应的分泌物标本,鉴定菌种,并进行药敏试验.移植后1～3个月出现发热的患者,应用酶免疫染色技术与ELISA法检测巨细胞病毒.结果:①感染病例临床特征:42例患者共32例于移植后发生感染,其中9例发生两个部位感染,4例发生3个部位感染.感染部位主要分布在口腔、肛周、肺部等,以及原发感染灶不明确的菌血症.细菌、真菌感染多发生在移植后1个月内,巨细胞病毒检测阳性多发生在移植后1～2.5个月,巨细胞病毒感染所致间质性肺炎多发生在移植后1～6个月.②病原菌分布与耐药:自身免疫性疾病自体造血干细胞移植后,真菌感染占36%,革兰氏阴性杆菌占32%,革兰氏阳性球菌占4%.实验所检出革兰氏阴性杆菌耐药率高,其中铜绿假单胞菌除对亚胺培南、头孢他啶、阿米卡星敏感外,对其他药物均耐药;大肠埃希氏菌对喹诺酮类、第3代头孢菌素等多种药物耐药,仅对氨基糖苷类敏感.③移植相关因素与感染发生:接受自体造血干细胞移植的自身免疫性疾病患者,其病程≥3年、移植前环磷酰胺用量≥5 g、预处理环磷酰胺强度200 mg/kg及CD34+细胞纯化的患者发生重度感染概率更高(x2=4.783～8.776,P均＜0.05).结论:①自身免疫性疾病患者自体造血干细胞移植后,感染病原体以革兰氏阴性杆菌、真菌、巨细胞病毒为主,感染部位主要分布在口腔、肛周、肺部,细菌耐药率高.②感染发生除与原发病有关外,患者病程、移植前环磷酰胺用量、预处理方案及移植方式为显著相关危险因素.
作者：董秀娟；陈蕾；马红霞；赵晓武；马冬燕；周凯 刊期： 2007年第33期
目的:探讨体外诱导骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的可能性,并观察其动态变化.方法:实验于2005-09/2007-03在山东大学齐鲁医院完成.①标本来源:骨髓标本15例来自山东大学齐鲁医院成人骨髓检查结果正常者,均签署捐献同意书.②实验方法:无菌条件下取骨髓2.0～5.0 mL,采用percoll分离液和贴壁法获得纯化的成人骨髓间充质干细胞.③实验评估:流式细胞仪行细胞表面抗原检测,在适当的条件下诱导其分化为成骨细胞和脂肪细胞.采用两步法向胰岛素分泌细胞诱导,观察其在碱性成纤维细胞生长因子、活化素A、胰岛素样生长因子、尼克酰胺等因子刺激下向胰岛素分泌细胞分化的动态变化.双硫踪染色鉴定胰岛样细胞团,酶联免疫吸附试验检测细胞分泌胰岛素的情况,RT-PCR检测胰岛细胞特异基因的表达.结果:①骨髓间充质干细胞的生长特性及免疫表型:分离培养获得的贴壁细胞,呈形态均一的梭形,流式细胞仪检测CD34、CD45表达阴性,CD29、CD44表达阳性.②向成骨细胞和脂肪细胞的诱导分化:此类细胞经茜素红染色、油红O染色均呈阳性,可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞.③向胰岛素分泌细胞的诱导分化:第1步诱导后出现细胞簇,双硫腙染色不着色,胰岛素分泌量少,仅检测到PDX-1基因的表达,证实其为胰岛前体细胞.第2步诱导后细胞簇数目逐渐上升,至诱导14 d大部分细胞簇经双硫腙染色都呈红色.④诱导后培养上清中胰岛素含量:诱导第3,7,14,21天的胰岛素分泌量分别为(15.3±4.9),(34.1±5.6),(40.4±5.3),(39.8±5.1)mU/L.⑤胰岛细胞特异基因的表达:诱导7 d仅检测到PDX-1基因的表达,insulin 1、insulin 2和Glut 2基因均不表达.诱导14,21 d检测到insulin 2、PDX-1基因表达,insulin 1基因弱表达,Glut 2基因不表达.结论:体外分离、纯化得到的骨髓间充质干细胞诱导7 d可分化出胰岛前体细胞,不具功能性;诱导14 d后可成功地分化出成熟的具有功能性的胰岛素分泌细胞.
作者：王海莲；鞠秀丽；李栋；侯怀水；时庆；沈柏均 刊期： 2007年第33期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
