崔玉芳；丁彦青；徐菡；柳晓兰；靳巍；毛建平；毛秉智
目的: 研究肝细胞癌(HCC)中端粒酶逆转录酶基因hTERT的表达及其与增殖细胞核抗原(PCNA)和P53基因的关系, 探讨其在HCC发生、发展及预后复发中的意义.方法: 采用免疫组化染色法检测42例HCC组织中hTERT、增殖细胞核抗原(PCNA)和P53蛋白的表达, 并对hTERT与HCC的临床病理特征以及PCNA、 P53蛋白表达的关系进行分析.结果: HCC中hTERT、 PCNA和P53蛋白的阳性率, 分别为71.4%(30/42)、 76.2%(32/42)、 73.8%(31/42); 而hTERT在正常肝脏组织中不表达.hTERT在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ级HCC组织中的表达率, 分别为40.0%(4/10)、 70.0%(14/20)及100%(12/12).HTERT的表达率与疾病复发有显著相关性(P<0.05).结论: hTERT表达的异常可能与肝癌的发生、发展有关.hTERT与PCNA和P53无明显的相关性.检测hTERT的表达可作为预测肝癌预后复发的潜在指标, 并提示HCC为由多基因参与的疾病.
作者：张东；李开宗；窦科峰；高志清；宋振顺；赵青川；付由池 刊期： 2004年第06期
目的: 利用纯化的抗大肠杆菌L2630多抗筛选噬菌体环七肽库, 以获得可模拟脂多糖(LPS)表位的短肽克隆. 方法: 以亲和层析纯化的抗大肠杆菌L2630多克隆抗体为靶分子, 筛选噬菌体随机环七肽库, 用双夹心ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性噬菌体克隆的抗原性. 结果: 对噬菌体环肽库进行3轮筛选后, 随机挑选20个克隆, 经鉴定其中12个可与抗L2630抗体结合, 即为阳性克隆; 其中有5个阳性噬菌体克隆表现出与抗鼠伤寒沙门氏菌LPS多抗结合的活性, 提示这5个噬菌体展示的短肽具有模拟大肠杆菌LPS及鼠伤寒沙门氏菌LPS共同表位的性质.经DNA序列分析显示, 其中8个克隆的氨基酸序列具有X-DGLL-XX或X-EDGLL-X保守序列, 其余4个克隆的序列均不相同. 结论: 筛选获得的噬菌体环七肽克隆具有模拟大肠杆菌LPS表位的活性, 为大肠杆菌L2630多表位模拟短肽.其中5个阳性噬菌体克隆短肽具有模拟大肠杆菌LPS及鼠伤寒沙门氏菌LPS共同表位的活性.
作者：罗海波；郑山根；朱平；富宁 刊期： 2004年第06期
目的: 建立分泌抗HIV-1 p24单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株, 并对其特性进行初步鉴定. 方法: 以纯化的基因工程制备的p24抗原免疫BALB/c小鼠, 取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合, 经HAT、 HT选择培养及有限稀释法进行克隆化后, 用间接ELISA法及Dot blot对其进行筛选和特性鉴定.结果: 筛选到2株可分泌抗HIV-1 p24 mAb的杂交瘤细胞, 其腹水效价为1×10-5, 亲和力为1.7×104～1.8×104 mol/L, mAb的Ig亚类均为IgG1.两株mAb与HBcAg、 HCV RNA 阳性血清及HIVgp41等均无交叉反应, 只与HIV-1 p24抗原阳性血清产生特异反应. 结论: 成功地建立了2株可分泌抗HIV-1 p24 mAb的杂交瘤细胞, 为进一步研制HIV-1 p24抗原的ELISA检测试剂盒奠定了基础.
作者：侯俊；胡燕；朱雷；沈宏辉；杨健洋；洪世雯；貌盼勇 刊期： 2004年第06期
目的: 研究β-淀粉样肽(Aβ)与HBcAg的融合基因Aβ-HBcAg的原核表达, 并检测表达的融合蛋白Aβ-HBcAg的免疫原性. 方法: 从重组质粒7Z/Aβ-HBcAg中, 切下含Aβ-HBcAg的基因片段, 将其融合于质粒pYTA1的lac启动子之后, 构建重组表达质粒pYTA/Aβ-HBcAg.以此重组质粒转化大肠杆菌DH5α, 在IPTG诱导下表达.超声破碎表达的细菌, 通过SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色, 检测融合蛋白Aβ-HBcAg的表达.采用ELISA法检测融合蛋白的反应原性. 融合蛋白经饱和硫酸铵盐析法分离和纯化后免疫BALB/c小鼠, 用ELISA法检测血清中抗-Aβ抗体的滴度.结果: 融合蛋白以可溶性形式存在于细菌裂解液的上清中, 其表达量为菌体总蛋白量的7% .表达的融合蛋白既有Aβ的反应原性, 又有与HBcAg的反应原性.经3次免疫后, BALB/c小鼠血清中抗-Aβ抗体的滴度高可达为1∶ 16 000.结论: 融合基因Aβ-HBcAg可在大肠杆菌DH5α中表达. 表达产物为可溶性蛋白, 存在于细菌裂解液的上清中, 具有较强的免疫原性.本研究为正在进行的AD基因工程疫苗的动物实验打下了基础.
作者：冯改丰；胡海涛；董炜疆；王全颖；杨广笑 刊期： 2004年第06期
目的: 探讨Notch1基因在全反式维甲酸(ATRA)诱导人胚胎神经干细胞分化为神经元过程中的表达及其发挥的作用.方法: 用不同浓度(0.5、 1、 5和10 μmol/L)的ATRA在体外诱导人胚胎神经干细胞, 7 d后, 做NSE免疫荧光染色, 计数分化为神经元的比例.用1 μmol/L的ATRA诱导人胚胎神经干细胞, 于诱导前、诱导3 d和诱导7 d, 提取细胞的总RNA, 用半定量RT-PCR法检测Notch1基因的表达.结果: 与对照组相比较, ATRA能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例(P<0.01).其中1 μmol/L的ATRA诱导人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例高, 为(29.20±1.09)%.Notch1基因在ATRA诱导后表达明显下调(P<0.001).结论: ATRA能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例, Notch1基因在人胚胎神经干细胞分化为神经元的过程中表达量下调.
作者：王飞；李世亭；黄强；兰青 刊期： 2004年第06期
目的: 研究基因转染和表达的可溶性PD-1(soluble programmed death-1, sPD-1)对HSP70-肽疫苗抗肿瘤效果的影响及协同机制.方法: 以HSP70-肽疫苗免疫BALB/c小鼠后, 用半定量RT-PCR技术检测和分析HSP70-肽疫苗对小鼠脾细胞上PD-1及其配体基因表达的影响.体内转染表达sPD-1, 用MTT比色法检测HSP70-肽疫苗免疫小鼠对肿瘤生长的抑制作用以及脾淋巴细胞的细胞毒活性.结果: 单独的sPD-1就有抗肿瘤效应.HSP70-肽疫苗不仅能预先在动物体内诱导肿瘤特异性的CTL, 而且可使脾细胞上抑制性共刺激受体PD-1及其配体的表达显著升高.用sPD-1与HSP70-肽疫苗联合治疗荷瘤小鼠, 能提高脾CTL的杀伤效率并延长HSP70-肽疫苗的免疫效果.结论: sPD-1可通过阻断PD-1与其配体的结合作用, 及减弱PD-1的负反馈抑制作用, 而增强HSP70-肽疫苗的抗肿瘤效应.
作者：王小红；张桂梅；贺宇飞；张慧；冯作化 刊期： 2004年第06期
目的: 探讨口服免疫耐受大鼠脾淋巴细胞对肾小球系膜细胞中NF-κB p65活性的影响.方法: 将10只6～8 wk龄雌性Wistar大鼠随机分为两组, 每组5只.一组用Fx1A抗原灌胃诱导其产生免疫耐受, 另一组用PBS灌胃作为对照组.2 wk后, 杀鼠取脾、分离淋巴细胞进行抗原特异性淋巴细胞增殖实验.制备免疫耐受大鼠脾淋巴细胞培养上清, 用夹心ELISA法测定其中IL-10的水平.将体外培养的系膜细胞用高水平的胰岛素, 同时加入大鼠的脾淋巴细胞培养上清作用24 h.用免疫组化染色及夹心ELISA法检测系膜细胞中NF-κB p65的活性. 结果: 与对照组大鼠相比较, 口服免疫耐受组大鼠抗原特异性脾淋巴细胞的增殖明显受到抑制, 其脾淋巴细胞培养上清中IL-10的水平明显升高(P＜0.01).在体外实验中发现, 口服免疫耐受大鼠脾淋巴细胞培养上清, 可抑制胰岛素刺激的系膜细胞内NF-κB p65的活性(P＜0.05). 结论: 口服免疫耐受大鼠的脾淋巴细胞, 可能通过其分泌的IL-10抑制系膜细胞内NF-κB p65的活性.
作者：杜晓刚；甘华 刊期： 2004年第06期
目的: 建立多天线癌胚抗原(multiple antennae carcinoembryonic antigen, MA-CEA)的快速定量检测法, 并研究肿瘤患者血清中多天线癌胚抗原的水平.方法: 采用神经氨酸酶(neuraminidase, NMD)降解MA-CEA糖链外侧的唾液酸.采用蔓陀萝凝集素(datura stramonium agglutinin, DSA)和CEA抗体, 建立检测MA-CEA的链霉亲和素-生物素系统酶免疫分析法(ABC-EIA), 分别检测239例肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌和卵巢癌患者血清中MA-CEA的水平, 同时采用ELISA检测血清CEA的水平.结果: 血清MA-CEA的水平在CEA阳性的肺癌患者中明显升高, 75例肺癌患者血清MA-CEA的阳性率为14.7%, 而CEA水平升高的肺癌阳性率为47.3%; 但胃癌、肝癌、结肠癌和卵巢癌患者, 无论CEA水平是否升高, 均未检测到MA-CEA水平的升高.结论: 建立了一种可定量检测肿瘤患者血清MA-CEA的方法, 为肺癌的鉴别诊断及其他多天线糖链肿瘤标志物的研究奠定了基础.
作者：张利军；刘树林；徐顺军 刊期： 2004年第06期
目的: 研制抗人促红细胞生成素的特异性单克隆抗体(mAb), 对其生物学特性进行初步鉴定, 并用于转基因羊乳中重组人促红细胞生成素(rhEPO)的提纯.方法: 以自制的rhEPO粗品免疫BALB/c小鼠, 制备抗rhEPO 的mAb.以Western blot和间接ELISA法, 对所获mAb进行初步鉴定.以纯化的mAb同预活化的Sepharose- 4B偶联, 制得mAb亲和层析柱, 并用于转基因羊乳中rhEPO的提纯. 结果: 获得两株可分泌特异性抗rhEPO的mAb的杂交瘤细胞株(1E7和2E6).Ig亚类(型)的鉴定分别为IgG1 和IgG2b, 轻链均为κ型.用Western blot证实, 获得的mAb可特异性地识别rhEPO.用自制的免疫亲和层析柱用于转基因羊乳中rhEPO的提纯, 具有很好的吸附作用, 回收率达70%.结论: 成功地获得两株可分泌特异性抗rhEPO的mAb的杂交瘤细胞.用自制的免疫亲和层析柱提纯转基因羊奶中的rhEPO具有较高的吸附效率.
作者：汪燕芳；彭进；蔡引凤；倪亚明；赵建阳；成国祥 刊期： 2004年第06期
目的: 在真核细胞中表达抗汉坦病毒NP抗原鼠源性单克隆抗体(mAb) 1A8的scFv, 并检测表达产物的活性.方法: 将真核表达载体1A8-scFv-Cκ/pCI-neo用脂质体转染COS-7细胞, 用间接免疫荧光和免疫共沉淀法检测瞬时表达产物的免疫学活性.结果: 间接免疫荧光的结果表明, 约1%细胞胞质中出现弥散荧光, 在免疫共沉淀/免疫印记中, 表达的抗体片段可与汉坦病毒的NP抗原特异性结合.结论: 细胞内表达的1A8-scFv-Cκ可与NP抗原特异性结合, 为进一步研究细胞内抗体的抗病毒功能奠定基础.
作者：白文涛；徐志凯；张芳琳；罗雯；刘勇；吴兴安；阎岩 刊期： 2004年第06期
目的: 研究小鼠博来霉素在肺纤维化模型中肺泡巨噬细胞(AM)分泌的基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)的表达随着时间的变化, 观察肺纤维化中MMP-9和TIMP-1的表达是否存在失衡. 方法: 以博来霉素诱导建立小鼠肺纤维化模型, 采用HE染色观察肺部胶原沉积状况.选用抗CD68 mAb, 采用微小免疫磁珠法分离纯化肺泡灌洗液中的AM, 用Hoechst 33258染色AM, 在下光镜高倍视野计数法评估AM的纯度和活性, 用EIA法检测AM上清液中MMP-9和TIMP-1的表达.结果: 肺组织切片HE染色显示小鼠肺部胶原沉积在1、 3、 7、 14、 28 d呈逐渐加重趋势.粗分离的AM纯度为(82.5±2.5)%. 采用微小免疫磁珠法分离肺泡灌洗液中的AM纯度可达到(99.3±0.7)%(P<0.05). 纯化后的细胞存活率为(92.5±1.8)%, 与纯化前的(92.7±2.0)%, 相差不大(P>0.05).随着小鼠肺间质纤维化的进展, MMP-9的分泌量逐渐减少, 而TIMP-1的表达量逐渐增加.结论: 在小鼠肺纤维化中AM分泌的MMP-9和TIMP-1之间存在失衡, 表明基质降解系统受到抑制.
作者：李圣青；张艰；黎志东；李焕章；戚好文 刊期： 2004年第06期
噬菌体展示技术(Phage display techniques)兴于20世纪90年代初.该技术能将目的的基因表达的多肽或蛋白质展示在噬菌体表面,并保持目的蛋白(或多肽)相对独立的空间结构和生物学活性.
作者：刘佳；郑文岭；马文丽 刊期： 2004年第06期
目的: 克隆人PD-L1基因的cDNA并构建PD-L1胞外区基因的原核表达载体, 在大肠杆菌中进行表达.方法: 以RT-PCR法从活化的人淋巴细胞总RNA中, 扩增并克隆PD-L1的cDNA, 构建PD-L1胞外区基因的原核表达载体, 在大肠杆菌BL21(ED3)中进行表达并鉴定.结果: 克隆到PD-L1 cDNA编码区的全长序列, 经DNA测序证明其与已报道的序列一致.同时构建了在羧基端带有His6标签的PD-L1胞外区基因的原核表达载体, 并在大肠杆菌中表达.免疫印迹分析表明, 在IPTG诱导后表达的PD-L1胞外区蛋白, 相对分子质量(Mr)为25 000, 与理论值的大小相符.该重组蛋白能与抗His6标签的单抗(mAb)特异性反应.结论: 成功地克隆PD-L1基因, 其胞外区蛋白在大肠杆菌中获得表达, 为利用PD-L1转基因修饰移植物或以PD-L1重组蛋白抑制移植排斥反应等研究提供了条件.
作者：何贤辉；徐丽慧；刘毅；蔡小嫦；曾耀英 刊期： 2004年第06期
目的: 探讨慢性冬眠心肌(CHM)组织中血管紧张素II 1型受体(AT1R)和2型受体(AT2R)的变化及意义.方法: 10只中国家猪(乳猪), 随机分为实验组(n=6)和假手术组(n=4), 以免疫组化染色法检测CHM组织中AT1R和AT2R在细胞上的表达及含量的变化.结果: (1)假手术组心肌(Sham)、实验组正常心肌(normal myocardium, NM)及冬眠心肌(CHM)中, AT1R均表达于心肌细胞和血管平滑肌细胞上; AT2R在Sham及NM中仅表达于心肌细胞上, 而在CHM中除心肌细胞外, 血管平滑肌细胞上亦表达AT2R.(2)Sham与NM中血管紧张素受体含量无差别, CHM中AT1R的含量降低, AT2R的含量升高.结论: 冬眠心肌中AT1R含量的降低及AT2R蛋白含量的升高和AT2R在血管平滑肌中的再表达, 可能参与了CHM形成和进展过程.
作者：李东野；丁茜；朱红；夏勇；钱文浩；杨煜；李雷 刊期： 2004年第06期
目的: 观察GM-CSF有无增强MUC1基因疫苗对EMT6乳腺癌生长的特异性抑制作用. 方法: 采用股四头肌肌肉注射法, 将构建的MUC1基因疫苗pcDNA3.1-MUC1免疫雌性BALB/c小鼠, 每3 wk 1次, 共3次.每次基因免疫后1、 3、 5 d, 皮下注射GM-CSF 100 μL(1 μg/100 μL).后1次基因免疫后第3周, 接种表达MUC1的EMT6小鼠乳腺癌细胞.两周后观察、记录肿瘤的生长情况.于肿瘤细胞接种后第43天, 处死全部动物, 称量肿瘤的质量.用4 h 51Cr释放法检测小鼠脾特异性CTL的杀伤活性. 结果: 接种肿瘤细胞后43 d, MUC1基因疫苗加GM-CSF组、 MUC1基因疫苗组、 pcDNA3.1加GM-CSF组及pcDNA3.1组, EMT6肿瘤的大小依次为(135±33.8)mm3、 (250±34.3)mm3、 (568±43.6)mm3和(596±48.2)mm3; 平均瘤质量(g) 依次为(0.81±0.42)g、 (1.23±0.41)g、 (2.30±0.48)g及(2.28±0.58)g .与对照组相比较, MUC1基因疫苗组EMT6肿瘤的生长受到明显抑制(P<0.05); 与单独MUC1基因疫苗组相比较, MUC1基因疫苗加GM-CSF组抗肿瘤生长的作用有显著差异(P<0.05).在效靶比为100∶ 1、 50∶ 1、 25∶ 1和12.5∶ 1时, MUC1基因疫苗加GM-CSF组特异性CTL对EMT6靶细胞的杀伤率, 依次为68.5%、 53.4%、 35.9% 和28.5%; MUC1基因免疫组依次为54.1%、 39.8%、 26.4%和20.1%, pcDNA3.1加GM-CSF及pcDNA3.1两个对照组分别为13.2%、 10%、 8.2%、 7.2% 和11.7%、 9.8%、 7.7%、 7.0%, MUC1加GM-CSF组与单独MUC1基因免疫组相比较差异显著(P<0.05).结论: GM-CSF可显著增强MUC1基因疫苗对EMT6乳腺癌生长的特异性抑制作用.
作者：袁时芳；李开宗；王岭；颜真；韩苇；张英起 刊期： 2004年第06期
目的: 构建人VEGF165基因的真核表达质粒pBudCE4.1/VEGF165, 观察其在血管内皮细胞(VEC)中的表达和表达产物对VEC增殖的影响.方法: 用RT-PCR法从引产胎儿心脏组织中克隆VEGF165基因, 并将其克隆至真核表达质粒pBudCE4.1中, 对重组真核表达质粒pBudCE4.1/VEGF165进行酶切鉴定和测序.以脂质体转染法将pBudCE4.1/VEGF165导入VEC中, 用Northern blot和免疫细胞化学染色法, 分别从mRNA水平和蛋白质水平检测它们在转染的VEC中的表达, 并检测表达产物对VEC增殖的影响.结果: 人VEGF165基因的RT-PCR产物为576 bp.测序结果显示, 扩增的VEGF165基因的序列与基因文库中登录的序列完全一致.经Hind Ⅲ和BamH I酶切鉴定证实, VEGF165基因已成功地克隆至真核表达质粒pBudCE4.1中.以其转染血管内皮细胞(VEC)后, 经Northern blot杂交和免疫细胞化学染色法检测均证实VEGF165基因表达.表达产物对VEC增殖有明显的促进作用.结论: 所构建的pBudCE4.1/VEGF165真核表达质粒可在VEC中表达, 表达产物可明显促进VEC增殖, 为通过VEGF165基因转染防治移植器官内血管的狭窄奠定了基础.
作者：吴忠均；吴维伟；余林；时德；郑树森 刊期： 2004年第06期
目的: 构建和表达可调控鼠蛋白脂质蛋白(PLP)-免疫球蛋白重组腺病毒载体.方法: 采用常规分子生物学方法, 从WT-1杂交瘤细胞中抽提总RNA,克隆小鼠Ig重链Fc基因.将编码PLP139-151的DNA与信号肽设计在引物上, 经两次克隆可形成可分泌型PLP-Ig.经穿梭载体与可调控性腺病毒载体骨架连接, 鉴定后在HEK293细胞中包装.获得高滴度病毒后, 用Western blot鉴定目的基因的表达.结果: PLP-Ig重组腺病毒经测序、限制性内切酶酶切分析及PCR等鉴定, 同预期结果相一致.Western blot检测病毒感染的细胞, 发现目的基因得到特异性表达且可被四环素调节.结论: 构建了可调控的小鼠PLP-Ig重组腺病毒载体并得到正确表达, 为进一步基因治疗实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)和诱导免疫耐受奠定了基础.
作者：张燕；刘梦蕾；沈茜 刊期： 2004年第06期
目的: 构建结核分枝杆菌Ag85B和鼠IL-12基因的共表达载体pBud85B-IL12.方法: 将结核分枝杆菌Ag85B基因和鼠IL-12基因同时克隆入含多启动子的共表达载体pBudCE4.1中, 构建真核共表达质粒pBud85B-IL12.以pBud85B-IL12转染COS-7细胞, 通过RT-PCR及ELISA方法检测目的基因的表达.结果: 在COS-7细胞中同时可检测到Ag85B和IL12的表达.结论: pBud85B-IL12共表达质粒的成功构建, 为对其免疫原性、免疫反应性及免疫保护作用的进一步研究奠定了基础.
作者：江山；朱道银；骆旭东；陈全；蒋英 刊期： 2004年第06期
细胞间黏附分子-1(ICAM-1)又称CD54, 是免疫球蛋白超家族中的单链跨膜球蛋白, 其表达受多种因素(如自身免疫病、创伤、白血病及细胞因子等)的影响[1-4].ICAM-1与细胞迁移至炎性部位有关, 也具有协同刺激T细胞功能的作用, 在淋巴细胞活化及免疫应答过程中起重要作用[5], 但也有助于淋巴细胞与肿瘤细胞之间的相互作用.P53基因是一种肿瘤抑制基因, 对细胞增埴分化起重要的调节作用.50%的人类肿瘤中发现P53基因有缺失或突变[6].我们观察了抑癌基因P53对人肝癌细胞株HepG-2上ICAM-1分子表达的调节作用.
作者：杨晓红；唐恩洁；任碧轩 刊期： 2004年第06期
目的: 观察当归多糖对小鼠腹腔巨噬细胞产生细胞毒效应分子的影响.方法: 从BALB/c小鼠的腹腔分离巨噬细胞, 并进行原代细胞培养.采用MTT比色法及紫外分光光度法, 检测当归多糖对腹腔巨噬细胞释放一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、活性氧(ROS)以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和溶菌酶(LSZ)活性的影响.结果: 当归多糖可激活巨噬细胞释放NO、 TNF-α和ROS等效应分子, 并显著提高LSZ的活性.当归多糖可能通过提高巨噬细胞iNOS的活性而增加NO的释放量, 但其与脂多糖(LPS)无协同促进NO释放的作用.当归多糖体外无直接杀伤肿瘤细胞的作用, 但其与巨噬细胞共孵育的培养上清具有杀伤L929细胞的作用.结论: 当归多糖可促进巨噬细胞释放NO、 TNF-α及ROS等细胞效应分子, 并可通过作用于巨噬细胞而促进TNF-α的分泌, 发挥间接的抗肿瘤免疫作用.
作者：杨兴斌；梅其炳；周四元；腾增辉；王海芳 刊期： 2004年第06期
细胞与分子免疫学杂志
主管:中国免疫学会；第四军医大学
主办：陕西省免疫学会,中国免疫学会
