学术投稿

利用SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测大鼠P物质mRNA方法的建立

于挺敏;姚刚

关键词:实时定量聚合酶链反应, SYBR Green Ⅰ, P物质
摘要:目的:建立检测大鼠P物质(SP)mRNA的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法,为检测大鼠SP基因表达提供有效的手段.方法:提取大鼠中脑总RNA,扩增SP基因片段,将其克隆入pMD-18T载体,制作标准品质粒;应用SYBR Green Ⅰ双链嵌合染料,对连续稀释的标准品质粒进行实时PCR分析,评价所建立方法的检测灵敏度;对PCR产物进行溶解曲线分析评价其特异性.结果:标准品质粒构建成功,经酶切及测序鉴定,目的片段已插入pMD-18T载体;所建立的实时定量PCR方法的低检测限度为104个拷贝/反应,在每反应104~109拷贝范围内,Ct值(荧光信号达到设定阈值所经历的循环数)与起始模板浓度具有良好的线性关系,r=0.998.结论:所建立的检测大鼠SP mRNA的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法具有敏感性高、特异性强和线性范围广等特点,适用于对大鼠各种组织SP的大量样本检测.
吉林大学学报(医学版)杂志相关文献
  • 非Q波及ST段抬高性心肌梗塞1例报告

    1 临床资料患者,女性,87岁.因阵发性心悸气短3年,加重1周入院.3年来每于劳累、情绪激动出现心悸气短、胸闷,休息及应用扩冠药物可缓解症状.近1周因劳累、睡眠欠佳,上述症状加重.既往6年前因患乳腺癌,行左侧乳腺切除术.查体:一般状态良好,神志清晰,胸廓不对称,左侧胸壁可见长约15 cm之手术瘢痕.双肺叩之清音,右下肺闻及干罗音及小水泡音.

    作者:赵羽;胡中桥;赵灵芝 刊期: 2008年第06期

  • 利用SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测大鼠P物质mRNA方法的建立

    目的:建立检测大鼠P物质(SP)mRNA的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法,为检测大鼠SP基因表达提供有效的手段.方法:提取大鼠中脑总RNA,扩增SP基因片段,将其克隆入pMD-18T载体,制作标准品质粒;应用SYBR Green Ⅰ双链嵌合染料,对连续稀释的标准品质粒进行实时PCR分析,评价所建立方法的检测灵敏度;对PCR产物进行溶解曲线分析评价其特异性.结果:标准品质粒构建成功,经酶切及测序鉴定,目的片段已插入pMD-18T载体;所建立的实时定量PCR方法的低检测限度为104个拷贝/反应,在每反应104~109拷贝范围内,Ct值(荧光信号达到设定阈值所经历的循环数)与起始模板浓度具有良好的线性关系,r=0.998.结论:所建立的检测大鼠SP mRNA的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法具有敏感性高、特异性强和线性范围广等特点,适用于对大鼠各种组织SP的大量样本检测.

    作者:于挺敏;姚刚 刊期: 2008年第06期

  • 体外循环期间经肺动脉灌注肺保护液对犬肺形态及功能的保护作用

    目的:探讨体外循环期间经肺动脉灌注肺保护液及氧合机器血对犬肺形态及功能的保护效果.方法:将18只杂种犬随机分为对照组、氧合血组(B组)及保护液组(P组)(每组6只).体外循环(CPB)期间氧合血组及保护液组分别经肺动脉灌注氧合机器血和肺保护液,CPB前及停止后15及60 min,监测气道峰压、肺血管阻力和肺静脉血氧分压,留取血标本做生化分析.对肺组织进行光、电镜观察.结果:氧合血组CPB后15和60 min气道阻力均明显高于CPB前(P<0.05),且低于对照组相应时间点(P<0.05).各组CPB后15和60 min肺血管阻力均明显高于CPB前(P<0.01),肺保护液组CPB后15和60 min肺血管阻力明显低于氧合血组及对照组(P<0.05).各组CPB后15和60 min氧指数均明显高于CPB前(P<0.01),肺保护液组CPB后15和60 min氧指数明显高于氧合血组及对照组(P<0.05).肺保护液组CPB后60 min肺泡-动脉氧压力差(P[A-a]O2)明显低于氧合血组及对照组(P<0.001).肺保护液组肺组织MDA含量及支气管肺泡灌洗液(PAL)中性粒细胞计数明显低于氧合血组(P<0.05)及对照组(P<0.001,P<0.05),且氧合血组低于对照组(P<0.01,P<0.05).肺保护液组组织学改变明显轻于氧合血组(P<0.05)及对照组(P<0.001),且氧合血组明显轻于对照组(P<0.001).结论:CPB后肺脏形态和功能有明显变化,肺动脉灌注低温肺保护液对犬肺形态和功能有良好保护作用.

    作者:林柏松;李玉林;张秀和;张柏民;姜亦忠 刊期: 2008年第06期

  • 痤疮霜的制备方法

    本文作者选取苦参、芙蓉花、赤勺及野菊花4味中药,组成临床上用于治疗痤疮的验方,采用科学方法提取分离,添加于化妆品中,开发成祛痤疮化妆品,并进行了质量考察及药理实验观察.

    作者:陈锐;聂海洋 刊期: 2008年第06期

  • 咪唑安定对大鼠海马脑片突触长时程增强效应的影响

    目的:观察眯唑安定对大鼠海马脑片突触长时程增强(LTP)效应的影响,并探讨其影响记忆的机制.方法:126只雄性SD大鼠,断头后取出海马组织,制备400μm海马脑片.取42张脑片,随机分为6组(n=7):对照组及咪唑安定0.1、0.5、1.0,2.0和5.0μmol?L-1组.各组脑片分别灌流人工脑脊液(ACSF)及咪唑安定0.1、0.5、1.0、2.0和5.0μmol·L-1.采用细胞外微电极记录技术,记录海马脑片CA1区细胞外群体峰电位(PS)的变化.另取84张脑片,随机分为12组(n=7):LTP组,眯唑安定LTP 0.1、0.5、1.0、2.0和5.0μmol·L-1组,印防己毒素组,荷包牡丹碱组,CGP35348组,印防己毒素+咪唑安定组,荷包牡丹碱+眯唑安定组,CGP35348+咪唑安定组.各组脑片分别灌流ACSF及其他各组相对应药物.海马脑片记录PS30 min后,施以100Hz的高频强直刺激(HFS),诱发LTP,观察各组脑片HFS后PS幅值的变化.结果:与对照组比较,咪唑安定1.0、2.0和5.0μmol·L-1组给药后PS幅值明显降低(P<0.05或P<0.01).LTP组HFS后PS幅值增高,较刺激前增加了52%±12%(P<0.01).与LTF组比较,咪唑安定LTP 0.1μmol·L-1组HFS后其Ps幅值无明显改变(P>0.05),眯唑安定LTP 0.5、1.0、2.0及5.0 μmol·L-1组HFS后其PS幅值均明显降低(P<0.01).印防己毒素+咪唑安定组、荷包牡丹碱+咪唑安定组HFS后PS幅值与HFS前和咪唑安定LTP 2.0μmol·L-1组比较均明显增加(P<0.01),与LTP组比较差异无显著性(P>0.05).CGP35348+眯唑安定组HFS后PS幅值与HFS前和咪唑安定LTP 2.0 μmol·L-1组比较均无明显改变(P>0.05),与LTP组比较明显降低(P<0.01).结论:咪唑安定能够抑制海马LTP的形成而影响记忆功能,其作用机制与活化海马γ-氨基丁酸(GABA)A受体有关.

    作者:冯春生;王艳姝;仇金鹏;岳云;麻海春 刊期: 2008年第06期

  • 甲基化硒酸对人前列腺癌DUl45细胞增殖与凋亡的影响

    目的:观察甲基化硒酸(MSA)对DUl45前列腺癌细胞增殖及凋亡的影响,并初步探讨其作用机制.方法:采用MTT比色法观察1.25、2.50和5.00 μmol·L-1MSA对DU145细胞增殖活力的抑制作用;吖啶橙染色观察MSA诱导细胞凋亡情况;流式细胞术分析细胞周期及凋亡,并计算细胞平均凋亡指数;免疫细胞化学技术观察细胞内激活的caspase-3的表达情况.结果:经1.25、2.50和5.00μmol·L-1MSA处理48 h后,DU145细胞生长抑制率分别为16.35%、38.10%和73.54%,3组间比较差异有显著性(P<0.01),随MSA浓度升高细胞生长抑制率增加,呈明显的剂量依赖性.吖啶橙荧光染色可见,经1.25、2.50和5.00μmol·L-1MSA处理后的细胞呈明显凋亡形态,并随药物剂量增加凋亡细胞数增多;流式细胞术结果显示,经1.25、2.50和5.00 μmol·L-1MSA处理48 h后,细胞凋亡率分别为,5.34%、8.71%和13.60%,3组间比较差异有显著性(P<0.05),随MSA浓度升高细胞凋亡率升高,呈剂量依赖关系;免疫细胞化学染色结果显示,随着MSA剂量增加,细胞内激活的caspase-3表达上调.结论:MSA对DU145细胞具有明显的抗肿瘤作用,其机制可能与激活的caspase途径诱导细胞凋亡有关.

    作者:刘艳波;赵丹;郭亚雄;赵丽晶;张海涛;董妍;赵丽娟;赵雪俭 刊期: 2008年第06期

  • 肝细胞生长因子受体在宫颈癌组织中的表达及其与增殖细胞核抗原的关系

    目的:研究肝细胞生长因子受体(c-met)在宫颈癌中的表达,探讨其与增殖细胞核抗原(PCNA)的关系.方法:运用免疫组化(SP)方法检测14例慢性宫颈炎和50例宫颈癌组织中c-met及PCNA的表达率.结果:在慢性宫颈炎组织,c-met表达阳性率为14.3%(2/14),而在宫颈癌组织,其表达阳性率为62.0%(31/50),两者比较差异有显著性(P<0.05).组织分化程度低组c-met表达率高于分化程度高组(P<0.05),淋巴结转移组的c-me t表达率明显高于无淋巴结转移组(P<0.05),鳞癌组与腺癌组c-met表达率比较差异无显著性(P>0.05),临床Ⅰ期和Ⅱ期组c-met表达量比较差异无显著性(P>0.05).在慢性宫颈炎组织中,PCNA指数为24.79%±5.1%,在宫颈癌组织中,PCNA指数为39.9%±15.46%,两者比较差异有显著性(P<0.05).组织分化程度越低、临床分期越晚PCNA的表达量越高(P<0.05),鳞癌组与腺癌组的PCNA表达量比较差异无显著性(P>0.05).c-met阳性表达组的PCNA指数明显高于c-met阴性表达组(P<0.01).结论:c-met的表达与PCNA密切关联,可作为评估宫颈癌预后的一个指标.

    作者:舒畅;方艳秋;齐亚灵;刘婷;谭岩;张晓霞 刊期: 2008年第06期

  • 颈动脉滴注尿激酶合剂治疗脑梗塞(附16例报告)

    近年来,本院采用颈动脉加压滴注尿激酶及维脑路通合剂治疗脑梗塞,效果良好,现报道如下.1 临床资料治疗组16例,男性10例,女性6例,年龄39~65岁,平均年龄52.5岁;均为颈内动脉系统脑梗塞,其中脑梗塞7例,大面积脑梗塞2例(梗塞灶涉及2个脑叶或以上),腔隙性脑梗塞7例;除外脑出血、出血性梗塞、高血压病、胃溃疡、意识障碍、颈动脉高度狭窄、颈动脉窦反射亢进、支气管哮喘病及心、肝、肾功能障碍者;采用尿激酶、维脑路通合剂(生理盐水70 mL,普鲁卡因5 mL,维脑路通200 mg,尿激酶15万U)经颈动脉加压滴注,30 min内滴完,其后以每小时15万U静脉滴注12 h.

    作者:宫景峰;纪莉 刊期: 2008年第06期

  • 蛋白质酪氨酸磷酸酶及相关疾病

    蛋白质酪氨酸磷酸酶家族是细胞信号转导中的重要调节因子,参与多种细胞功能的调控.本文作者概述了几种重要的蛋白质酪氨酸磷酸酶PTPIB、TC-PTP、SHP-1、SHP-2、MEG2及PRL3等的功能,并介绍了其在许多人类疾病(癌症、心血管疾病、神经及代谢失调及自身免疫系统疾病等)的发生和发展中所起的重要作用.

    作者:李婉南;姜轶群;范晓迪;董洪钵 刊期: 2008年第06期

  • 慢性肺源性心脏病治疗前后心电图P波变化与预后的关系

    为探讨慢性肺源性心脏病的预后指标,本文作者对慢性肺源性心脏病急性发作期患者治疗前后心电图P波振幅的变化与预后的关系进行分析,现报道如下.

    作者:索金梅;周连春;阮红 刊期: 2008年第06期

  • 血管内皮祖细胞在骨组织工程中的应用

    在组织损伤、缺血或生长因子、药物刺激等因素作用下,骨髓中的血管内皮祖细胞(EPCs)会动员进入外周血,并趋化、分化,参与机体血管形成.由于骨组织形成(或改建)是一个以血管形成为基础,多种细胞、生长因子、细胞外基质参与的复杂过程,因此EPCs在骨形成中的作用近年来受到广大学者的关注.利用EPCs在新血管形成中的重要作用,将其作为骨组织工程的种子细胞,为利用血管化人工骨修复骨组织缺损提供广阔的应用前景.

    作者:刘超;苗雷英;孙宏晨;孙新华 刊期: 2008年第06期

  • 脂肪肝与胆囊结石的关系(附376例报告)

    为探讨脂肪肝与胆囊结石发病的关系,本文作者对近3年来本院体检及就诊的40岁以上376例患者彩色多普勒超声检查结果进行对比分析,发现脂肪肝患者胆囊结石发病率明显高于无脂肪肝者,现报道如下.

    作者:丁怡敏;马志辉;门洪君 刊期: 2008年第06期

  • 食盐加碘前后甲状腺恶性肿瘤检出率及组织学类型分析

    目的:探讨食盐加碘前后甲状腺恶性肿瘤的检出率及组织学类型构成的变化.方法:回顾性查阅1961-2000年外检病理登记资料,对其中1011例甲状腺恶性肿瘤依据WHO新分类标准进行重新分类,统计分析食盐加碘前后甲状腺恶性肿瘤检出率、组织学类型的构成比及甲状腺主要恶性肿瘤的年龄和性别分布变化.结果:食盐加碘后甲状腺恶性肿瘤检出率为0.69%,明显高于加碘前的0.46%(P<0.01);食盐加碘前后甲状腺恶性肿瘤构成比出现明显变化,甲状腺乳头状癌在食盐加碘后构成比(70.17%)高于加碘前(55.84%),而甲状腺滤泡癌在食盐加碘后的构成比(11.08%)低于加碘前(24.58%);食盐加碘前甲状腺恶性肿瘤发病高峰年龄为(40.95±14.71)岁,加碘后发病高峰年龄为(43.06±13.09)岁,发病年龄有增加趋势(P<0.05);食盐加碘前甲状腺乳头状癌、滤泡癌及未分化癌的高发年龄均≤40岁,加碘后3种癌的高发年龄均>40岁;食盐加碘前后女性甲状腺恶性肿瘤检出率均高于男性(P<0.05).结论:食盐加碘后甲状腺恶性肿瘤检出率增高,甲状腺癌的组织类型发生变化:乳头状癌显著增加,滤泡状癌减少;甲状腺乳头状癌、滤泡癌及未分化癌的发病年龄有增加趋势.

    作者:崔俊生;倪劲松;孔庆扬;王静 刊期: 2008年第06期

  • GPI锚定蛋白检测诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿症的临床价值

    目的:探讨阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者不同外周血细胞GPI锚定蛋白的表达情况,为PNH的诊断和鉴别诊断提供依据.方法:采用流式细胞术检测32例PNH患者外周血各类细胞膜上CD55、CD59、CDl6及CD14的表达百分率.结果:PNH患者外周血红细胞、粒细胞膜上CD55、CD59表达均明显减少,与正常对照组比较差异有显著性(P<0.001),且粒细胞上CD55、CD59表达率低于红细胞(P<0.05);血小板CD55、CD59表达率也较对照组减少(P<0.05);有27例PNH患者的淋巴细胞CD55、CD59表达降低,其缺失率达30%,低于粒细胞和红细胞;CDl6在粒细胞上表达量差异很大(34%~83%),与对照组比较差异有显著性(P<0.001);在单核细胞上可见CDl4表达缺失的PNH克隆,CD14表达比例明显低于正常对照组(P<0.001).结论:检测外周各系血细胞CD55和CD59可以使典型PNH的诊断更加可靠,使部分缺乏典型临床表现的PNH明确诊断.检测CD16和CD14对排除PNH具有重要意义.

    作者:段秀梅;车媛媛;谭岩;方艳秋;许淑芬;刘磊;孙牧男 刊期: 2008年第06期

  • 彩超诊断膀胱憩室并憩室内多发结石1例

    1 临床资料患者,男性,73岁.因尿频、尿急、尿不净等症状反复发作多次就诊.实验室检查尿常规经常出现红细胞及白细胞,临床诊断为泌尿系感染.近日患者尿频、尿急症状加重,来本院就诊.超声检查使用东芝SSA-350A彩色多普勒超声诊断仪,探头频率为3.5MHz.

    作者:尹鸿鹰;丛震宇;王丽萍 刊期: 2008年第06期

  • 卵巢癌组织中PI3K的表达及意义

    目的:研究卵巢癌组织中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的表达,探讨PI3K在卵巢癌发生及发展中的作用.方法:应用RT-PCR检测10例卵巢癌组织、10例卵巢良性肿瘤组织及10例正常卵巢组织中PI3K mRNA表达.应用免疫组化方法检测PI3K蛋白在60例卵巢癌、24例卵巢良性肿瘤及24例正常卵巢组织中的表达.结果:PI3K mRNA在卵巢癌组织中表达量高于正常卵巢及卵巢良性肿瘤(P<0.01),在卵巢良性肿瘤组织中表达量与正常卵巢组织表达量比较差异无显著性(P>0.05).PI3K蛋白表达主要定位于细胞质和(或)胞核.PI3K蛋白在卵巢癌组的阳性表达率明显高于正常卵巢组和卵巢良性肿瘤组(P<0.01);PI3K蛋白的表达强度与病理分级及临床分期有关,卵巢癌分化越差PI3K蛋白表达越强(P<0.05),临床分期越晚,其PI3K蛋白阳性表达率也越高(P<0.05).结论:PI3K mRNA和蛋白在卵巢癌组织表达明显增强,PI3K基因在卵巢癌发生及发展中起促进作用.

    作者:张晓霞;费军伟;于晓伟;倪劲松;王芯蕊;李荷莲 刊期: 2008年第06期

  • 丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建及其在HL-7702细胞中的高效表达

    目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5A基因的真核表达载体,并在正常人肝细胞株(HL-7702细胞)中进行表达,为今后研究HCV NS5A蛋白功能奠定基础.方法:从含HCV NS345序列的重组质粒pCDNA3.1(+)/NS345中扩增出HCV NS5A基因片段,构建pCI-neo/NS5A重组表达质粒.用脂质体将其转染HL-7702细胞,通过Western blotting印迹法鉴定NS5A蛋白.结果:用PCR方法扩增的HCV NS5A基因全长1 344 bp,与PGEM-T重组,测序证实所克隆的NSSA基因片段大小正确;成功地构建pCI-neo/NS5A重组表达质粒,瞬时转染HL-7702细胞表达NS5A蛋白,Western blotting印迹法显示其相对分子质量约为56 000.结论:HCV NS5A的真核表达载体pCI-neo/NS5A在HL-7702细胞中能有效表达NS5A蛋白,NS5A蛋白可导致病毒复制、肝细胞癌发生,且NS5A区为IFN敏感性决定区.

    作者:苏秀芬;姜艳芳;王峰;牛俊奇 刊期: 2008年第06期

  • 99Tcm-MIBI影像与分化型甲状腺癌手术131Ⅰ清甲后复发的关系

    目的:探讨分化型甲状腺癌(DTC)99Tcm-MIBI显像与手术131Ⅰ清甲后复发的关系.方法:经手术病理确诊为DTC清甲治疗后患者173例,行99Tcm-MIBI双时相甲状腺局部静态显像,利用感兴趣区技术,分别计算99Tcm-M1BI早期、延迟T/N比值及洗脱率;依据Tg、TgAb、B超、X线及全身131Ⅰ显像的复发判定标准,分析DTC手术131Ⅰ清甲治疗成功后复发率;比较复发与无复发组99Tcm-MIBI早期、延迟T/N比值及洗脱率.结果:DTC手术131Ⅰ清甲治疗成功后3年内复发率为5.20%(9/173).其中乳头状癌复发率为4.90%(5/102),滤泡状癌复发率为5.63%(4/71),两组问比较差异无显著性(P>0.05).无论何种病理类型,分化型甲状腺癌复发组早期、延迟T/N比值均明显低于无复发组(P<0.05),洗脱率明显高于无复发组(P<0.05).结论:'99

    作者:张浩然;赵劼;孙辉;温强;赵国庆;马庆杰 刊期: 2008年第06期

  • 损伤肝组织匀浆诱导间充质干细胞甲胎蛋白和白蛋白的表达

    目的:建立分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法,探讨损伤肝组织匀浆对MSCs的诱导分化作用.方法:采用密度梯度离心、贴壁培养法分离培养大鼠MSCs,以含10%损伤肝组织匀浆、10%FBS的L-DMEM培养基诱导培养,并在不同时间点采用免疫组织化学方法(SP)检测甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(Alb)的表达.结果:MSCs在含10%损伤肝组织匀浆的10%FBS L-DMEM培养基中培养,呈类上皮样细胞.诱导组在培养7 d时,大部分细胞呈AFP阳性表达(75.2%),与对照组比较差异有显著性(P<0.05);诱导培养14、21和28 d AFP表达阳性率分别为35.2%、12.3%和2.0 0A,组间比较差异有显著性(P<0.05);诱导组在培养7 d仅少数细胞Alb呈阳性表达(14.6%),诱导培养14、21和28 d Alb表达阳性率分别为67.6 oA、88.9%和95.6%,诱导组与对照组比较及不同时间点比较差异均有显著性(P<0.05).结论:此方法可获得纯度较高MSCS,损伤肝组织匀浆可诱导MSCs表达AFP和Alb.

    作者:赵文静;方艳秋;齐亚灵;刘婷;牛凤兰;谭岩 刊期: 2008年第06期

  • 原发性肺淋巴瘤的影像学诊断

    1 临床资料本组原发性肺淋巴瘤8例,男性6例,女性2例,年龄45~70岁.发热4例,咳嗽,咳痰带血丝3例,胸痛2例,咯血、乏力各1例,并发右上肢疼痛1例,无自觉症状经查体发现1例.8例均行胸片和CT检查.采用GE Lightspeed 16多层螺旋CT机,常规扫描层厚7.5 mm,层距为7.5 mm,薄层扫描层厚、层距均为1.25 mm.影像学诊断:肺癌5例,肺炎3例.

    作者:成钢;黄森 刊期: 2008年第06期

吉林大学学报(医学版)杂志

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主办:吉林大学