任培君；易小萍；张元兴
目前,应用地高辛标记探针检测Veto细胞残余DNA含量仍是常用的检测方法,该方法具有特异性强、无放射污染、操作简便等特点.在实际操作中,地高辛探针的灵敏度及杂交的条件对检测结果均有很大的影响.为此,我们就提高探针灵敏度及优化杂交条件进行了摸索.
作者：何晓燕；许峰；窦佳；何荣；金程；江贤木；张佳丽；金晓中；高春润；恽冬泽；张玉慧 刊期： 2008年第11期
目的 研究腺病毒载体介导gag基因在C57BL/6小鼠体内的生物分布.方法 经C57BL/6小鼠左后肢股四头肌部位单次注射0.05 ml Ad-gag,于给药后不同时间摘取组织脏器,采用Taqman探针实时荧光定量PCR法,以小鼠β-actin基因作为内参,外标绝对定量法分别定量样本中gag和β-actin基因拷贝数.计算每104个小鼠细胞中gag基因的拷贝数,比较各脏器的分布数量.结果 外标绝对定量法精密性良好.gag基因主要分布在注射位点、淋巴结、脾脏和肝脏,其他脏器没有分布.给药后3 d,gag基因在靶器官分布达峰值,注射位点分布多,伴随时间延长逐渐减少.结论 Ad-gag疫苗在体内不会蓄积并产生全身的特别是生殖系统毒性.本研究可作为重要的安全性试验数据,支持药物在临床应用.
作者：王欣；苗玉发；周晓冰；沈连忠；李波 刊期： 2008年第11期
目的 构建EGFP-PDGFRβ融合基因表达载体,并优化PEI介导基因转染COS-7细胞的条件.方法 PCR扩增EGFP和PDGFRβ基因,依次连接至pcDNA3.1(+)质粒中,构建融合基因表达载体H-E-P-pcDNA3.1(+),经PEI介导转染COS-7细胞,并对转染条件进行优化.结果 融合基因表达载体经酶切及测序证明构建正确.经PEI介导转染COS-7细胞的佳条件为:DNA浓度2 μg/ml,N/P比值15.5,在无血清条件下转染.此条件适用于滚瓶培养细胞的转染.结论 已成功构建了EGFP-PDGFRβ融合基因表达载体,并优化了经PEI介导转染COS-7细胞的条件.
作者：任培君；易小萍；张元兴 刊期： 2008年第11期
目的 筛选高效抗牛血清白蛋白(BSA)单克隆抗体细胞株,并建立BSA抗原检测的双抗体夹心ELISA法.方法 分别采用辛酸-硫酸铵法和葡萄球菌A蛋白亲和层析法纯化单抗,并进行抗体类型、腹水效价、特异性和相对亲和力测定;应用纯化的单抗建立BSA双抗体夹心ELISA检测法,并进行初步应用.结果 筛选出4株可稳定分泌抗BSA单抗的杂交瘤细胞株,抗体类型为IgG,抗体滴度均可达10-6,特异件良好,相对亲和力较高.建立的双抗体夹心ELISA法线性范围为1.25～20 ng/ml,R2>0.98.灵敏度为1.25 ng/ml.结论 已筛选出高效抗BSA的单抗,并建立了BSA双抗体夹心ELISA检测方法.
作者：张加利；蔡芳；高强；宋莉莉；于丹；桑建利 刊期： 2008年第11期
目的 在大肠杆菌中表达含穿膜肽HIV-TAT与呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白片段G1及CTL表位的融合蛋白,并进行纯化.方法 以质粒pET-G1F/M2为模板,扩增含TAT、RSV G蛋白片段G1和CTL表位F/M2的融合基因片段,与原核表达质粒pET-His连接,构建融合表达质粒pET-TAT-G1F/M2,转化E coli BL21(DE3)plysS进行诱导表达,采用Ni2+螯合亲和层析法纯化经尿素变性的包涵体,梯度透析复性纯化的目的 蛋白,并进行Western blot鉴定.结果 在E coli中可高效表达重组蛋白TAT-G1F/M2,表达量占菌体总蛋白的30%以上,目的 蛋白主要存在于包涵体中.经变性、纯化、复性可获得高纯度(>95%)特异性的TAT-G1F/M2蛋白.结论 已在大肠杆菌中成功表达了融合蛋白TAT-G1F/M2,为进一步进行RSV体内体外免疫学研究奠定了基础.
作者：张竞；龚伟；梅兴国；阎浩林 刊期： 2008年第11期
目的 建立狂犬病病毒抗原的定量检测方法,用于疫苗生产过程中病毒含量的监测.方法 用狂犬病病毒aG株免疫豚鼠,制备抗狂犬病病毒多克隆抗体,纯化后以辣根过氧化物酶进行标记.采用双抗体夹心ELISA法建立检测系统.以狂犬病疫苗国家参考品为定量标准,建立剂量反应曲线,确定该方法的灵敏度,并对该方法的精密性、特异性和适用性进行验证.结果 制备的多克隆抗体高峰效价为1:105,纯化后的抗血清蛋白含量为6.45 mg/ml.建立的ELISA方法对狂犬病病毒抗原的低检出量为5.3 mIU/nd,佳定量区间为10～110 mIU/ml,相关系数为0.998 3,精密性和特异性较好.用该方法对狂犬病疫苗进行抗原定量,与NIH法测定的疫苗效力具有一定的相关性;检测市售的不同毒株和细胞系生产的狂犬病疫苗,其结果在2.4～9.9IU/ml之间.结论 已建立了狂犬病病毒抗原的定量检测方法,可对来自不同毒株和不同细胞系的狂犬病疫苗进行快速定量检测,为疫苗生产中的质量控制提供了简便的监测手段.
作者：张国强；王远征；王晋；施彤；冯素英 刊期： 2008年第11期
目的 探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)对大鼠肝纤维化细胞(CFSCs)凋亡的影响.方法 常规培养BMSCs、CFSCs和大鼠肝细胞系BRL,并双层共培养CFSCs与BMSCs.用ELISA方法检测BMSCs培养上清中NGF、HGF和TGF-β1的浓度;RT-PCR检测与BMSCs共培养的CFSCs及BRL的p75表达;TUNEL法检测BMSCs分泌的细胞因子封闭后对CFSCs凋亡的影响.结果 BMSCs可分泌NGF、HGF、TGF-β1等细胞因子,且随着培养时间的延长,其分泌量逐渐增多;BRL不表达p75,CFSCs表达p75,且与BMSCs共培养后,其表达量增高;分别用p75的阻断剂TAT-Pep5、HGF的中和抗体和JNK的阻滞剂sp600125作用后,BMSCs诱导CFSCs凋亡的比例均明显降低;封闭TGF-β1后,BMSCs诱导CFSCs凋亡的比例增高.结论 BMSCs能够通过分泌NGF和HGF促进CFSCs的凋亡,这种凋亡诱导作用依赖于JNK的活性,并且在封闭TGF-β1后增强.
作者：史立军；王菁华；徐克达；曹振远；孙博；王广友；王丹丹；孔庆飞；李呼伦 刊期： 2008年第11期
目的 表达、纯化血管内皮细胞生长因子(VEGF165)蛋白,并制备其单克隆抗体.方法 将pGEX-4T-1/VEGF165表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达GST-VEGF165融合蛋白,并采用十二烷基肌氨酸钠溶解,亲和层析纯化.用获得的GST-VEGF165蛋白免疫小鼠,制备抗GST-VEGF165单克隆抗体,并进行鉴定及初步应用.结果 表达的GST-VEGF165融合蛋白相对分子质量约为45 000,表达量约占菌体总蛋白的20%,纯化后蛋白纯度大于90%,并具有与其受体结合的活性,亲和力约为109L/mol.免疫小鼠后,获得1株抗GST-VEGF165的单克隆抗体,反应原性良好,亚类为IgG2a,解离常数为2×10-9mol/L.以此单抗为包被抗体,建它了双抗体夹心ELISA法,VEGF165的佳检测范围为1.562 5～25 ng/ml.结论 成功表达、纯化了VEGF165蛋白,并制备出VEGF165单克隆抗体,为VEGF检测试剂盒的研制奠定了基础.
作者：徐静；李树香；刘立成；刘敬；王欣怡；许丽锋；邹检平 刊期： 2008年第11期
目的 在毕赤酵母中表达突变型干扰素-τ(TFN-τ),并检测其生物学活性及抗乙型肝炎病毒作用.方法 将绵羊IFN-τ序列中6个氨基酸突变为人IFN-α相应的氨基酸,将合成的基因克隆至pPICZa质粒.构建突变型IFN-τ表达质粒pPICZα-IFN-τ,转化巴斯德毕赤酵母中进行高密度发酵.发酵上清液经超滤浓缩、离子交换层析和分子筛层析纯化后,检测其生物学活性及抗乙型肝炎病毒作用,并与市售IFN-α2a进行比较.结果 发酵上清液中突变型IFN-τ的表达量为400～500 mg/L,占上清总蛋白的40%以上;纯化收率达31.4%,纯度约为95%;比活为2.1×107 IU/mg;对乙型肝炎病毒的抑制作用与IFN-α2a相当,但细胞毒性显著低于后者.结论 已在毕赤酵母中高效表达了突变型IFN-τ,表达的蛋白具有较高的生物学活性,对乙型肝炎病毒有良好的抑制作用,且细胞毒性较低.
作者：张晴妮；徐骥；芮康宁；罗鹏；杨子义 刊期： 2008年第11期
目的 探讨聚合酶链式反应(PCR)变性及退火温度与产物假阴性之间的关系.方法 以含有HBV完整基因组的重组质粒pUC-19为模板进行PCR扩增,人为改变PCR循环的变性或退火温度,探讨其与产物假阴性之间的关系.结果 随着变性温度的降低和退火温度的升高,PCR扩增效率降低,产物量明显减少.当变性温度降低至85℃及85℃以下,退火温度升高至72℃时,琼脂糖凝胶电泳肉眼观察不到扩增产物.结论 过低的变性温度和过高的退火温度会导致PCR产物出现假阴性.
作者：冉姝；周国燕；王景宇；李红卫；华泽钊 刊期： 2008年第11期
目的 构建人源抗菌肽LL-37/hCAP-18的真核表达载体,并在人乳腺癌细胞MCF-7中进行表达.方法 以重组质粒pcDNA4.0-LL-37为模板,采用PCR法扩增LL-37/hCAP-18基因,连入pEGFP-c1质粒,构建真核表达载体pEGFP-c1-LL-37,瞬时转染人乳腺癌细胞MCF-7,采用激光共聚焦显微镜观察重组质粒的转染效率,RT-PCR法检测目的 基因的表达.结果 所构建的抗菌肽LL-37/hCAP-18真核表达载体经双酶切和测序证明构建正确,在瞬时转染MCF-7细胞48 h后,目的 基因转染效率较高,约为40%,RT-PCR结果显示,重组质粒转染的细胞可扩增出339 bp的目的 基凼条带.结论 已成功构建了人源抗菌肽LL-37/hCAP-18的真核表达载体,并在人乳腺癌细胞中获得表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定了基础.
作者：韩艳非；袁红艳；廖翔宇；刘超；常雅萍 刊期： 2008年第11期
目的 制备LKB1(Thr336)磷酸化多克隆抗体.并以其检测细胞中LKB1的表达.方法 用生物信息学方法选取LKB1 Thr336位点附近10个氨基酸,且使Thr336位点磷酸化,并铰链到BSA上.以此为抗原免疫家兔,制备抗血清,纯化后通过ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性,并用LKB1抗体和p-LKB1(Thr336)抗体分别检测正常细胞及肿瘤细胞中LKB1的表达.结果 纯化后的p-LKB1(Thr336)抗体效价为1:1 000;LKB1抗体不仅识别His-LKB1蛋白,而且识别p-LKB1(Thr336)抗原,而p-LKB1(Thr336)抗体仅识别p-LKB1(Thr336)抗原;在正常细胞HL7702和HEK293中,LKB1表达较多,而在HeLa细胞中,LKB1基本没有表达;在这3种细胞中.p-LKB1(Thr336)基本没有表达;在肿瘤细胞S180、COS-7和Caco2中,LKB1和p-LKB1(Thr336)均有表达,p-LKB1表达相对较多.结论 已制备了特异性的p-LKB1(Thr336)多克隆抗体,LKB1-Thr336位点的磷酸化可能是某些肿瘤发生的特征,有望成为肿瘤诊断的指标之一.
作者：任艳敏；黄蓓；魏浩；赖柳静 刊期： 2008年第11期
目的 观察腮腺炎病毒蛋白组分疫苗的免疫效果.方法 SP株腮腺炎病毒液经灭活、浓缩、裂解后,采用SPSepharoseTM Fast Flow阳离子层析柱及Sepharose CL-4B分子筛层析柱纯化,收集各峰样品,经12%SDS-PAGE、Western blot分析及HPLC检测.并取第1峰样品免疫ICR及BALB/c小鼠,检测血清中和抗体效价及CTL杀伤活性.结果 所收集的第1峰样品为单一的腮腺炎病毒蛋白组分.免疫ICR小鼠可诱导产生中和抗体,其免疫后各检测时间点的GMT水平与减毒活疫苗组相比,差异均无统计学意义;免疫BALB/c小鼠可诱导产生针对HN肽段的CTL杀伤活性,而减毒活疫苗组则未能诱导此特异性CTL反应.结论 腮腺炎病毒蛋白组分疫苗在小鼠体内可诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答,为新型腮腺炎疫苗的研制提供了实验依据.
作者：梁燕；杨子江；董承红；马绍辉；崔萍芳；王丽春；刘龙丁；史长军；李琦涵 刊期： 2008年第11期
目的 利用响应面分析法对鸟苷发酵培养基进行优化,提高鸟苷产量.方法 采用响应面分析法对鸟苷发酵培养基的3种主要成分葡萄糖、酵母粉和豆饼水解液进行优化.用Design-Expert软件对实验数据进行多元回归分析,并建立3种因素与鸟苷产量之间的函数关系.用终优化的配方进行3次验证试验.结果 通过岭脊分析,获得培养基中3因素佳浓度为:葡萄糖12.0%,酵母粉1.4%,豆饼水解液4.0%,发酵液鸟苷高产量可达28.3 g/L.3次验证试验所测得的鸟苷产量分别为28.14、28.32和27.86 g/L,平均值为28.10 g/L,与预测结果基本一致.结论 利用响应面分析法可优化鸟苷发酵培养基,显著提高鸟苷的产量.
作者：盛翠；张一平；陆茂林 刊期： 2008年第11期
布鲁菌是严重危害人畜健康的病原菌之一,其鉴别诊断方法受到国内外的普遍关注.本文从布鲁菌感染与具有共同抗原的菌属细菌感染的鉴别以及人工免疫与自然感染的鉴别两方面作一综述.
作者：张付贤；王英超；王兴龙 刊期： 2008年第11期
目的 探讨塞来昔布促进顺铂诱导人骨肉瘤细胞MG-63凋亡的作用.方法 将人骨肉瘤细胞分为塞来昔布组、顺铂组和联合组,分别加入不同浓度的塞来昔布、顺铂和塞来昔布+顺铂,采用MTY法检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡比例;吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双染色观察细胞并计算凋亡率.结果 塞来昔布单独作用于MG-63细胞后,细胞抑制率随药物浓度的升高而升高;联合组细胞抑制率均较顺铂组明显升高;FCM分析联合组细胞凋亡比例明显上升;AO/EB染色结果显示,联合组的细胞凋亡率明显高于塞来昔布组和顺铂组.结论 塞来昔布和顺铂均可引起人骨肉瘤细胞的凋亡,两者联合使用可明显增强对人骨肉瘤细胞的凋亡作用.
作者：史晓红；黄朝梁 刊期： 2008年第11期
人防御素是一类人体内源性抗微生物阳离子短肽,富含精氨酸,以其广谱高效的抗菌活性和独特的作用机制,成为人体天然免疫体系的重要组成部分.在人防御素家族中,人β防御素-3(HBD-3)具有较强的抗菌活性和更广的抗菌谱,对盐浓度相对不敏感,对宿主细胞毒性低,这些特点使其成为当前研究的热点.本文就其结构特征、生物学功能及其在抗感染方面的应用前景等方面的研究进展作一概述.
作者：王远亮；赵长虹 刊期： 2008年第11期
目的 构建Lipocalin-2(Lcn-2)基凶真核表达质粒PL-2,并榆测其及前期原核表达的重组Lcn-2蛋白对人胚肾细胞HEK293增殖的影响.方法 利用RT-PCR从鼠巨噬细胞RAW264.7中扩增tcn-2基因,克隆人真核表达质粒pEGFP-C1中,构建蓖组质粒PL-2.转染HEK293细胞,通过荧光观察和RT-PCR鉴定Lcn-2基凶的表达.将重组质粒PL-2和前期原核表达的重组Lcn-2蛋白作用于HEK293细胞,通过MTT法检测细胞增殖情况,Western blot法检测细胞增殖核抗原(PCNA)的表达.结果 重组真核表达质粒PL-2经酶切和测序鉴定,证明构建正确.经荧光观察和RT-PCR鉴定,转染重组质粒PL-2的HEK293细胞中有Lcn-2基因的表达.加入重组Lcn-2蛋白后,HEK293细胞较对照组明显增殖,细胞中PCNA的表达也较对照组明显升高,而重组质粒PL-2对HEK293细胞增殖以及细胞中PCNA的表达均无影响.结论 已成功构建了Lcn-2基凶真核表达质粒,其对HEK293细胞的增殖无影响,而原核表达的重组Lcn-2蛋门对HEK293细胞的增殖有一定的促进作用,推测Lcn-2基因的表达产物可能通过与细胞膜受体结合促进HEK293细胞的增殖.
作者：帖儒修；朱道银；李娜；王爽 刊期： 2008年第11期
目的 分析不同代次S191纯化株麻疹病毒(MV)的主要蛋白基冈序列.方法 将S191纯化株MV在原代鸡胚细胞(CEC)上连续传4代,观察每代病毒培养特性.选择其中的CEC28、30和31代病毒,测定主要蛋白N、M、F和H基因序列,并与GenBank中标准株S191(1994)和S191(2008)序列进行比对.结果 S191纯化株病毒在CEC上连续传4代,其培养特性、致细胞病变效应(CPE)及病毒滴度均基本稳定.S191株病毒CEC各代与S191(1994)株比较,在15个核苷酸位点上有区别,其中N蛋白基因6个、M蛋白基因3个、H蛋白基因1个核苷酸的差异对其编码的氨基酸产生了影响;与S191(2008)株比较,在2个核苷酸位点上有区别,且均导致氨基酸的改变.各代之间主要蛋白基凶未见突变.结论 S191纯化株病毒在<中国药典>三部(2005版)规定的代次范围内比较稳定,在CEC30代内均可作为工作代毒种使用.
作者：魏树源；祁春华；陈晓琦；桂金柱；王珍 刊期： 2008年第11期
目的 探讨苏木精染色对冰冻切片组织RNA及蛋白质浓度和质量的影响.方法 将10份乳腺癌组织冰冻切片进行苏木精染色以及苏木精染色后酸洗处理,利用显微切割技术从冰冻切片中获取特定乳腺癌细胞,Trizol提取相应的RNA及总蛋白,琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR分析RNA质量,SDS-PAGE和Bandscan软件分析蛋白质电泳结果,并进行RNA和蛋白质的浓度测定.结果 从10份乳腺癌组织冰冻切片中提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳检测,苏木精染色组和苏木精染色后酸洗组的28S、18S、5S条带均有不同程度的降解,RT-PCR结果显示,RNA完整性较好;提取的蛋白电泳图谱处理前后无明显差异;苏木精染色以及苏木精染色后酸洗处理对乳腺癌组织中的RNA及蛋白质浓度无显著影响.结论 苏木精染色对乳腺癌冰冻切片组织中RNA及蛋白质浓度和质量无显著影响,为肿瘤蛋白质组学的进一步研究提供了理论支持.
作者：王秋悦；张西臣；宫鹏涛；李建华；杨举；曹利利；蔡亚南；续哲莉；Yan-gao Man 刊期： 2008年第11期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
