王振国；金宁一；马鸣潇；金扩世；张洪勇；尹革芬
目的采用生物反应器微载体培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液.方法用5 L生物反应器培养Vero细胞,培养至4d时接种CTN株狂犬病毒,在培养全程对细胞生长所消耗的营养物质及代谢产物进行监测及分析.结果培养4d后细胞浓度可达1.2×107cells/ml,培养3周后的病毒液经ELISA检测A值可达0.21～1.06.病毒滴度达10-6.0～10-8.0LogLD50/ml.病毒液可连续收获5次.结论用微载体系统培养Vero细胞可生产高滴度的狂犬病毒液.
作者：王树君；代长海；张莹；王进；李宇辉；胡晓明；李光谱；于洪涛 刊期： 2004年第06期
目的研究重组人纽兰格林生物学活性检测方法,并制定其质量控制标准.方法采用激酶受体活化的酶联免疫吸附试验(KIRA-ELISA),通过优化细胞浓度、样品稀释梯度、药物刺激时间及细胞裂解方法等建立定量测定重组人纽兰格林体外生物学活性的方法,同时建立了一套完整可行的质量控制标准.结果重组人纽兰格林刺激MCF-7细胞表面ErbB2/ErbB3分子磷酸化的反应存在量-效关系,相关系数大于0.98,原液的平均比活性为8 510 U/mg±1 150 U/mg.并对原液设立肽图、纯度等检测项目,对成品设立热原质试验、鉴别试验等检测项目.结论 KIRA-ELISA可用于定量检测重组人纽兰格林的体外生物学活性,结果准确可靠,重复性好;建立的方法和标准可以有效控制重组人纽兰格林制品的质量.
作者：袁力勇；饶春明；郭莹；李响；刘长暖；张翊；王军志 刊期： 2004年第06期
目的克隆、表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白基因napA,为研究幽门螺杆菌致病机理提供材料.方法用PCR从幽门螺杆菌DNA中扩增出目的基因napA,定向插入原核表达载体pQE30中,测序分析确认后,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达,表达蛋白以NI2+-NTA柱进行纯化.结果 PCR扩增出435bp目的基因片段napA,克隆入pQE30质粒.工程菌诱导后SDS-PAGE显示新生表达蛋白带,相对分子质量为17000,与预期一致,约占菌体总蛋白的38%,经Ni2+-NTA柱纯化后可获得纯度为95.5%重组蛋白.Westem blot显示重组蛋白具有良好的抗原性.结论克隆napA基因成功,并在大肠杆菌DH5α中高效表达.
作者：林珊珊；杨致邦；吴利先；刘淼 刊期： 2004年第06期
目的提取23F型肺炎球菌溶血素(PLY),并对其免疫原性、抗原性及保护效果进行初步观察.方法通过离子交换层析、疏水共价层析和排阻层析,从23F型肺炎球菌中提取PLY,以20μg的PLY免疫小鼠(0、14及21 d),末次免疫后14 d用23F、9V和2型肺炎球菌从鼻腔粘膜攻击,观察保护效果.结果成功获得PLY,并能诱导小鼠产生较高水平的相应抗体;试验组小鼠存活率显著高于对照组小鼠.结论 PLY具有良好的免疫原性,对小鼠具有特异保护作用和交叉保护作用.
作者：刘梅影；王建华 刊期： 2004年第06期
目的建立一套等位基因特异性扩增(ASA)的检测体系,用于结核分支杆菌对利福平耐药性的快速检测.方法根据结核分支杆菌野生型基因设计ASA特异性引物,ASA PCR扩增39株结核杆菌利福平耐药株的rpoB基因,经琼脂糖凝胶电泳检测,进而推断利福平的耐药性;同时进行DNA序列测定以验证ASA法的检测结果,并分析上海地区结核杆菌rpoB基因的突变特点.结果在39株利福平耐药株中共检出36株,敏感性为92.3%;与DNA测序结果的符合率为87.2%,并鉴定了11种不同类型的41种突变形式,其中包括9种点突变和2种基因缺失.结论用等位基因特异性扩增法分析结核分支杆菌的rpoB基因突变具有较高的特异性与敏感性.该法快速、简便、可靠,可应用于临床利福平耐药性的检测.
作者：范小勇；徐帆洪；胡忠义；赵春女；李忠明；郭盛淇 刊期： 2004年第06期
目的为了解洪涝灾害对钩端螺旋体(钩体)病流行菌型的影响,在我国钩体病流行比较严重的省市地区进行菌株分离观察.方法采用经典的显微镜凝集试验和交叉凝集素吸收试验进行血清学分类比较.结果 6省市的28株钩体菌株分属7个血清群9个血清型,其中发现2个新的血清型,暂定为贺岩型和沅江型,代表菌分别为L231株和沅江27株.结论对流行区的28株钩体菌株进行了血清学分类,为钩体病的诊断提供了新的依据.
作者：秦进才；辛晓芳；薄淑英 刊期： 2004年第06期
目的构建HCV聚合酶基因重组原核表达质粒,研究高效表达聚合酶蛋白的适条件、表达产物的纯化方法以及佳变性和复性条件,同时分析其二级结构,为建立细胞外HCV聚合酶复制模型及筛选药物创造条件.方法采用高保真PfuDNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增,从我国HCV RNA阳性病人血清中扩增出HCV NS5b RNA聚合酶全长基因序列,构建原核表达载体.在多个载体中选取pET-30a作为表达载体,选择诱导表达条件.利用Ni2+金属离子螯和亲和层析将其纯化.同时对该酶蛋白的变性和复性条件进行研究,对其相关的分子生物学参数和二级结构进行分析.结果测序及读码框架分析结果表明,按照上述技术路线得到了相关HCVNS5bRNA聚合酶全基因序列.在佳表达条件下,诱导表达融合蛋白(相对分子质量65000),其高表达量为18.9%,纯度大于92.83%,Westem blot法检测,能与HCV NS5b单抗反应,证明其为NS5b蛋白.对其二级结构的分析表明,已获得了活性基团完整的HCV聚合酶.结论 HCV聚合酶的高效表达和纯化,为建立细胞外HCV聚合酶复制模型及筛选药物奠定基础.
作者：杨振；蒋建东；祁自柏；陈鸿珊；张华远；李河民 刊期： 2004年第06期
目的进行森林脑炎纯化疫苗实验室检定、人体反应及血清学效果观察.方法按2000年版<中国生物制品规程>要求对森林脑炎纯化疫苗进行全面的实验室检定,并按国家药品监督管理局临床研究批件的要求进行I期临床观察.结果疫苗经异常毒性试验、热原质试验、致敏性试验及有害物质检查均合格;并具有很好的免疫原性,小白鼠的免疫保护指数大于5.0×105.20名志愿者接种疫苗后无一例出现局部反应和全身反应,且血清中和抗体全部阳转.结论森林脑炎纯化疫苗安全性可靠,可继续进行Ⅱ-Ⅲ期临床观察.
作者：宋宗明；董关木；洪成龙；安祺；刘双军；赵洪丽；惠连；韩亮 刊期： 2004年第06期
目的建立人血浆蛋白C的纯化与鉴定方法.方法利用DEAE-Sephadex A-50代替氯化钡,对血浆进行预处理,再经DEAE-Sepharose FF离子交换和肝素-Sepharose CL 6B亲和层析进行分离纯化,用活化的部分凝血活酶时间(APTT)测定组分活性,非还原型SDS-PAGE测定其相对分子质量,Western blot鉴定其特异性.结果获得相对分子质量为62000的蛋白条带,此条带可与人蛋白C单克隆抗体发生特异性反应.结论已成功地从血浆中分离到蛋白C,为其规模化生产奠定了基础.
作者：沈永才；孙文种；吕茂民；章金刚；倪道明；裴雪涛 刊期： 2004年第06期
目的研究Vero细胞蛋白的过敏原性.方法取不同剂量Vero细胞宿主细胞蛋白和裂解蛋白致敏豚鼠,隔日1次,共3次,每组3只,以牛血清及生理盐水分别为阳性及阴性对照,末次致敏后21 d攻击,并观察攻击后的反应.结果攻击后30min,100ng/只以上剂量组均出现过敏反应,且反应强度与剂量呈正相关.24 h各剂量组过敏反应的恢复情况各不相同.结论 Vero细胞宿主细胞蛋白及裂解蛋白均可以引起过敏反应,裂解蛋白的反应强度高于宿主细胞蛋白.
作者：田博；靳萍；黄浩；丁志芬 刊期： 2004年第06期
目的克隆产气荚膜梭菌β2毒素基因,并选择可能影响其生物活性的氨基酸的相关碱基位点进行定点突变,构建β2毒素基因的突变体.方法利用PCR从C型产气荚膜梭菌基因组DNA中,扩增出约0.7kb的基因,将其克隆至pGEM-T载体上.经GOLDKEY软件分析抗原表位,PCR定点突变技术进行234位半胱氨酸→苷氨酸的定点突变.结果β2毒素基因核苷酸序列与报道的一致,其突变基因699位核苷酸由T→G.结论已成功克隆了β2毒素基因,并准确实施了预期定点突变.
作者：王玉炯；许崇波；蒋玉文；邓光存；曾瑾；马春燕 刊期： 2004年第06期
目的探讨新生鼠提取液(NRE)对急性血瘀模型大鼠血液流变学的影响.方法大鼠皮下注射0.1%肾上腺素0.2ml后放冰水中浸泡5 min复制急性血瘀模型,应用NRE进行治疗(NRE 2.0和4.0 mi/kg每天灌胃给药1次,连续7 d),测定大鼠血液流变学各参数变化.结果急性血瘀模型大鼠全血黏度、血浆黏度、血浆纤维蛋白原浓度、血沉、红细胞聚集指数及红细胞刚性指数均明显降低,红细胞电泳时间及红细胞压积则无明显影响.结论 NRE可明显改善急性血瘀模型大鼠血液流变学,对于防止动脉硬化的发展及并发症的发生均有益处.
作者：李井涛；薛洪伟；曲绍春；于小风；睢大员 刊期： 2004年第06期
干扰素鼻腔给药系统是目前研究的热点.干扰素作为细胞因子被用来治疗30多种疾病,其鼻腔内给药可预防和治疗呼吸道病毒感染,如病毒性感冒和病毒性肺炎等.鼻腔局部给药使干扰素通过和鼻粘膜上的相应受体结合而得到良好的吸收,具有吸收迅速、完全,能避免肝脏首过效应等优点,扩大了干扰素的应用范围,减少毒副作用的发生.
作者：郭桥；陈爽；盛军 刊期： 2004年第06期
目的表达相对分子质量18 000的截断型人可溶性CD40L.方法针对人CD40L(Glu108-Leu261)设计引物,以全长人CD40L为模板,扩增目的基因,经pGEM-T中间载体进一步连接到pQE-40载体,构建pQE/sCD40L表达载体.转化E.coliM15后经IPTG诱导表达,分离、洗涤包涵体,并利用Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白,经复性后检测对骨髓瘤细胞SP2/0细胞株的抑制作用.结果克隆的目的基因为480bp,经测序与文献报道一致,所构建的菌株(M15/PQE/sCD40L)经诱导表达目的蛋白量为26.7%,相对分子质量为18 000,纯化后蛋白纯度为96.5%,对SP2/0细胞有生长抑制作用.结论原核表达的截断型人可溶性CD40L具有抑制肿瘤细胞生长作用.
作者：易学瑞；孟凌华；邵光；袁有成；李斌；杨联萍；孔祥平 刊期： 2004年第06期
目的克隆葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其真核表达系统并表达目的蛋白.方法采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌FRIS6B株中扩增全长SEB,目的片段T-A克隆后测序.重组质粒pUCm-T-SEB经酶切获得的pUCm-T-SEB基因片段与真核表达载体pPIC9K连接.将重组真核载体pPIC9K-SEB转化入P.pastoris GS115株,经PCR筛选并鉴定pPIC9K-SEB-P.pastoris GS115.在0.5%(v/v)甲醇诱导下,采用SDS-PAGE检测重组SEB(rSEB)的表达,并对rSEB的N端氨基酸序列和诱导人脐静脉内皮EVC-304细胞分泌IL-1α和TNFα的作用进行了检测.结果所克隆的SEB基因核苷酸及氨基酸序列的同源性分别高达98.84%～100%和100%.表达的SEB在SDS-PAGE图谱的位置与预期相符.rSEB氨基末端氨基酸序列与预期完全相符.rSEB与SEB商品有相似的促人脐静脉内皮细胞EVC-304分泌IL-1α和TNFα的活性.结论已成功地构建了SEB的真核表达系统,为进一步分析SEB分子中毒性相关活性位点、定位突变获得减毒或无毒的突变体奠定了基础.
作者：孙爱华；毛亚飞；严杰 刊期： 2004年第06期
目的克隆H5N1亚型禽流感病毒HA基因并进行分子进化分析.方法应用RT-PCR方法,以2株H5N1亚型禽流感病毒RNA为模板,扩增了HA全基因cDNA.将HA cDNA基因克隆于pUCm-T载体,并对其进行了测序.结果所克隆的HA基因全长为1 731 bp,共编码568个氨基酸.将该毒株与其它10株H5亚型禽流感病毒HA基因序列核苷酸及氨基酸进行比较,其核苷酸同源性在80.5%～99.2%之间,氨基酸序列同源性在89.4%～98.6%之间.高致病性毒株HA基因裂解位点存在多个碱性氨基酸插入.结论为禽流感基因工程疫苗的研制奠定了基础,同时通过分子进化分析也揭示了各毒株间的亲缘关系.
作者：王振国；金宁一；马鸣潇；金扩世；张洪勇；尹革芬 刊期： 2004年第06期
目的在乳酸乳球菌中克隆与表达大鼠endostatin.方法采用RNA分离试剂盒从大鼠肾脏组织中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增其endostatin基因,将该基因克隆进pUC19质粒中,转化大肠杆菌DH5a,提取质粒,分离基因,酶切后与含有乳酸乳球菌启动子nisin的pLA141质粒连接,经电击转化,将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中,转化子在含有氯霉素的GM17培养基上培养.用nisin诱导endostatin表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果表达产物相对分子质量约为14 000,表达量约为10mg/L.结论在乳酸乳球菌中可以表达出正确的大鼠endostatin重组蛋白,为下一步进行重组蛋白的活性检测以及临床实验提供了依据.
作者：李充璧；闫宝山；李晓晨；孙克菲；王春香；周明海 刊期： 2004年第06期
目的观察抗金黄色葡萄球菌IgY的生物学效应及稳定性.方法将金黄色葡萄球菌稀释至适宜浓度,用微量凝集法测定IgY抗体的生物学效应及稳定性.结果抗体IgY(10mg/ml)溶液能明显抑制金黄色葡萄球菌生长,且能使感染性病灶症状消失,治愈病灶局部未检出葡萄球菌.抗体IgY在25℃、37℃条件下活性稳定;巴氏消毒64℃条件下15 min活性下降40%,15 min以后迅速下降;70℃作用15 min活性下降70%;在pH4.0～7.9环境中活性改变不显著.结论抗金黄色葡萄球菌IgY具有很好的生物学效应和高度稳定性.
作者：陈均华；杨丽风 刊期： 2004年第06期
目的观察不同采食方式对昆明小鼠寿命的影响.方法在昆明小鼠繁殖群中,随机抽取180只21日龄雌雄各半小鼠,根据不同采食方式分成3个组,观察其寿命长短.结果正常采食组平均寿命(582.50±177.73)d,限食采食组平均寿命(730.25±167.39)d,自由采食组平均寿命(548.75±148.66)d.总体平均(620.00±164.59)d.自由采食组与正常采食组差异无显著意义(P＞0.05),限食采食组比自由采食组和正常采食组寿命长,且差异有显著意义(P＜0.001).雄性鼠比雌性鼠寿命长,且差异有显著意义(P＜0.001).结论采食方式明显影响昆明小鼠的寿命.
作者：刘殿峰；刘秀霞；张静旭；杨淑萍；刘淑霞 刊期： 2004年第06期
目的分析人SARS特异性免疫球蛋白的抗体效价和S/D病毒灭活残留物含量.方法采用ELISA和蚀斑实验,检测SARS康复患者血浆及免疫球蛋白制品的SARS病毒IgG抗体和中和抗体效价;以HPLC和气相色谱检测制品中Triton X-100和TNBP残留量.结果由多人份SARS康复患者混合血浆制备的静脉注射用人SARS特异性免疫球蛋白样品IgG抗体和中和抗体效价提高5倍以上;Triton X-100和TNBP残留量均低于规定值.结论经S/D病毒灭活的静脉注射用人SARS特异性免疫球蛋白符合现行规程要求.
作者：白坚石；王威；杨鹏云；郝杰；陈继庭 刊期： 2004年第06期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
