焦艳；江家骥
背景:黄芪可促进骨髓间充质干细胞向神经元方向分化,但对于诱导机制的报道较少,目前普遍认为诱导作用可能与其具有抗氧化功能有关.目的:观察黄芪注射液诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化早期进程中细胞内钙调蛋白mRNA转录水平的变化.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-10/12在河北北方学院实验中心完成.材料:清洁级6周龄雄性大鼠1只,购自中国医科院实验动物中心.黄芪注射液为大理药业有限公司产品,批号060105.方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代按4×105L-1密度按种于12孔板,加入含200 g/L黄芪注射液、体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基进行诱导分化,制备的细胞爬片行免疫细胞化学染色.传至第5代细胞平均分配到4个离心管内,1管为对照组,另外3管加入上述诱导培养基分别作用30,60,120 min,消化获取的细胞采用RT-PCR技术检测钙调蛋白mRNA的转录水平.主要观察指标:黄芪对骨髓间充质干细胞的诱导作用,诱导后钙调蛋白mRNA的转录水平.结果:黄芪诱导5 h后,可见少量细胞形态发生改变,胞体变圆,自胞体伸出细长突起,免疫细胞化学染色后可见巢蛋白阳性细胞和神经元特异性烯醇化酶阳性细胞,少量细胞呈微管相关蛋白2阳性,而神经胶质纤维酸性蛋白呈弱阳性.RT-PCR实验显示,在黄芪诱导骨髓间充质干细胞分化的早期,钙调蛋白基因进行了转录,随着诱导时间的延长,钙调蛋白mRNA的相对含量运渐增加,诱导30,60,120 min组与对照组钙调蛋白mRNA的相对含量比较差异有显著性意义(F=153.315,P=0.000).结论:黄芪诱导骨髓间充质干细胞向神经元方向分化初期细胞内钙调蛋白转录水平上调,提示其诱导作用可能与钙调蛋白介导的信号转导途径有关.
作者：王新生；李海峰；赵荧；赵铁军；张晓丽；薄爱华 刊期： 2009年第23期
背景:已证实骨形态蛋白9是骨形态蛋白家族具潜力的促骨分化生长的因子之一,目前国内在成骨方面对骨形态蛋白9的报道非常少.目的:探讨腺病毒介导的人骨形态蛋白9基因转染兔脂肪干细胞的可行性,及其转染后的成骨作用.设计、时间及地点:细胞摹因学体外观察,于2007-08/2008-08在重庆医科大学附属儿童医院儿研所外科研究室完成.材料:新西兰大白兔5只,由重庆医科大学实验动物中心提供.携带人全长骨形态蛋白9基因的腺病毒载体由重庆医科大学附属儿童医院罗庆研究员构建并惠赠.方法:取兔颁后部脂肪组织,体外分离纯化脂肪干细胞.取生长良好的第3代细胞,以1×108 L-1密度接种于6孔板,转染组经感染复数为100的载有人骨形态蛋白9基因的腺病毒转染脂肪于细胞,并设立未转染对照组.主要观察指标:细胞形态及生长曲线变化,荧光显微镜及RT-PCR检测转染后人骨形态蛋白9基因mRNA的表达,碱性磷酸酶及钙茜索红染色测定转染后成骨活性.结果:转染1周后细胞汇合呈铺路石状,2周后形成钙化结节:未转染对照组细胞形态较前无明显变化,无明显的钙化结节形成.与未转染对照组比较,转染组细胞停滞期延长,数量轻度下降,倍增时间延长.脂肪干细胞转染骨形态蛋白9基因后12 h后即有荧光表达,转染3,6,9,12 d后人骨形态蛋白9 mRNA均呈阳性表达且逐渐增强,未转染对照组呈阴性.转染组碱性磷酸酶活性随转染时间的延长呈升高趋势,钙茜素红染色可见钙化结节;未转染对照组碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色均呈弱阳性表达.结论:携带人全长骨形态蛋白9基因的腺病毒可成功转染兔脂肪干细胞,转染后脂肪干细胞高表达骨形态蛋白9,且具有明显的成骨作用.
作者：张强；傅跃先；康权；甘立强；罗庆；刘燕 刊期： 2009年第23期
背景:组织多普勒超声心动图被证明可以用来评价心脏的整体和局部功能,但用于评价骨髓基质细胞移植对阿霉素所致兔心肌病的连续观察研究较少.目的:利用组织多普勒超声心动图评价骨髓基质细胞直接注射治疗阿霉素所致心肌病心肌功能的变化.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2002-09/2003-12在华中科技大学同济医学院附属协和医院超声科实验室完成.材料:雄性成年日本大耳白兔28只,体质量(2.0±0.2)kg,利用阿霉素诱导其中20只制备扩张型心肌病模型.方法:造模成功后,20只白兔分为细胞移植组和PBS组,每组10只.8只生理盐水处理组作为假手术组.细胞移植组于实验开始第8周每只兔分别取其骨髓进行骨髓基质细胞培养.第12周进行细胞荧光标记后,于心外膜直接注射回各自兔的左室侧壁心肌处.PBS组于第12周注射相同剂量的PBS培养液作为对照.另外8只作为假手术组仅开胸,每次给予相同剂量生理盐水.主要观察指标:细胞移植前及移植后4周利用常规和组织多普勒超声心动图评价左室整体和局部功能;组织学和荧光检测观察心肌细胞形态变化.结果:①细胞移植组组织多普勒发现局部注射区组织速度增高,由[4.0±1.1)cm/s到(5.3±1.2)cm/s(P＜0.05),而整体功能未见明显改善.PBS组及假手术组整体和局部心肌功能均未见改善.②细胞移植后4周存活的细胞仍可见DAPI荧光标记.组织学检查发现注射区附近心肌损伤减轻.凋亡较少.结论:骨髓基质细胞治疗扩张型心肌病可以改善局部心肌功能,组织多普勒可以检测出局部心肌功能的改善,为细胞移植提供了一种有效的评价手段.
作者：费洪文；王新房；谢明星；周诚；何亚乐 刊期： 2009年第23期
背景:三七总皂甙对骨髓基质细胞向神经样细胞分化的效应及相关信号通路目前尚不明确.目的:探讨细胞外信号调节蛋白激酶1/2信号通路对三七总皂甙调节大鼠骨髓基质细胞向神经细胞增殖、分化的作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-05/10在汕头大学医学院分子生物学实验室完成.材料:4～6周龄雄性SD大鼠9只,由汕头大学医学院实验动物中心提供.三七总皂甙为广西梧州制药集团股份有限公司产品,细胞外信号调节蛋白激酶的抑制剂PD98059为Cell Signaling Tech公司产品.方法:全骨髓法体外分离纯化大鼠骨髓基质细胞,取传至第3代细胞进行诱导分化,设立3组:单纯诱导组向培养液中加入10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,预诱导24 h后全量换为正式诱导液(含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2%DMSO、200 μ mol/L丁羟回醚的α-MEM培养基),每24 h半量换诱导液1次;三七总皂甙组向预诱导液和正式诱导液内加入终浓度100 mg/L三七总皂甙:PD98059组在三七总皂甙组培养液基础上加入10 μ mol/L PD98059.主要观察指标:细胞形态学观察,MTT法检测细胞增殖情况,免疫组织化学方法鉴定细胞Nestin的表达.结果:诱导6 h后,少数细胞呈锥形,细胞突起增多伸长,类似神经元,继续诱导培养后细胞突起增多,突起相瓦连接成网状.与单纯诱导组、PD98059组比较,诱导6,12,24 h三七总皂甙组细胞均明显增殖(P＜0.05),且随诱导时间延长呈递增趋势(P＜0.05):单纯诱导组、PD98059组间比较无明显差异(P＞0.05).与单纯诱导组比较,诱导24 h后三七总皂甙组Nestin阳性率明显升高(P＜0.05),PD98059组Nestin阳性率明显降低(P＜0.05).结论:三七总皂甙可以促进骨髓基质细胞的神经分化和分化后增殖,细胞外信号调节蛋白激酶1/2的特异性抑制剂PD98059能够拮抗三七总皂甙促增殖分化作用,提示细胞外信号调节蛋白激酶1/2信号通路是三七总皂甙促进骨髓基质细胞向神经细胞分化和增殖的重要环节.
作者：张震宇；曾艳；李学东；刘东宁 刊期： 2009年第23期
背景:由于心肌细胞自身增殖能力有限,急性心肌梗死后细胞移植是目前流行的再生心肌方法.骨髓间充质干细胞的存活受心肌微环境的影响,而内皮祖细胞参与血管新生,可为骨髓间充质干细胞提供微环境. 目的:探讨骨髓间充质干细胞联合中药丹酚酸B预处理的内皮祖细胞共移植后,对急性心肌梗死大鼠心功能改善及骨髓间充质干细胞分化早期基因表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-01/2008-03在天津中医药大学完成.材料:清洁级雄性Wistar大鼠45只,由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供.丹酚酸B为天津天士力现代中药资源有限公司产品,批号 20060601.方法:分别取2只和1只大鼠,采用密度梯度离心法+贴壁筛选法分离培养纯化内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞.剩余42只大鼠随机分为4组:假手术组9只、模型组11只、骨髓间充质干细胞组12只、共移植组10只.假手术组只开胸穿线,不结扎左冠状动脉;其余3组结扎左冠状动脉建立心肌梗死模型.结扎冠状动脉15 min后再次开胸,共移植组吸取骨髓间充质干细胞悬液250 μL(浓度1×1010L-1)+8mg/L丹酚酸B预处理的内皮祖细胞悬液250 μL(浓度1×108L-1),于结扎区附近心肌组织分5点注射:骨髓间充质干细胞组同法注射单纯骨髓间充质干细胞悬液500μL,模型组注射等量细胞培养液.主要观察指标:采用超声心动仪测定左室功能,Real-time PCR检测心肌分化基因Nkx2.5,GATA-4的表达.结果:细胞移植4周后与模型组比较,骨髓间充质干细胞组左室结构有改善趋势,但差异无显著性意义(P>0.05);共移植组左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、舒张末期室间隔厚度、收缩末期室间隔厚度均明显改善(P＜0.05),心室收缩功能指标射血分数、心输出量均明显改善(P<0.05).细胞移植4周后与模型组比较,骨髓间充质干细胞组、共移植组Nkx2.5及GATA-4 mRNA表达均明显增加,且共移植组Nkx2.5 mRNA增加幅度明显大于骨髓间充质干细胞组(P<0.05).结论:骨髓间充质干细胞联合丹酚酸B预处理的内皮祖细胞共移植方式,可上调骨髓间充质干细胞向心肌分化过程中Nkx2.5,GATA-4基因的表达,改善急性心肌梗死大鼠心室结构,增强心功能.
作者：李庆雯；南亚昀；谭俊珍；范英昌 刊期： 2009年第23期
背景:研究证实多数造血生长因子通过JAKs-STATs途径转导信号,调节血细胞的增殖与分化.人参总皂苷能够促进早期的造血干/祖细胞向红系细胞分化,具有类似造血生长因子的功效,在红系血细胞发生中造血细胞膜表面红细胞生成素受体起着关键性的作用.目的:通过红细胞生成素及其受体介导的JAK2/STAT5信号转导途径,分析人参总皂苷定向诱导红系血细胞发生的分子机制.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-05/2008-10在在重庆医科大学基础医学研究所、组织胚胎学教研室完成.材料:脐血细胞来源于正常足月妊娠产妇分娩脐带血,由重庆医科大学第一附属医院提供.人参总皂苷由重庆中药研究所惠赠,纯度95%以上,添加MI-1640培养液配成1g/L的工作液.方法:①集落形成实验:取5×106L-1脐血单个核细胞,添加含马血清的RPMI-1640培养液,10,25,50,75,100 mg/L人参总皂苷组分别加入对应终浓度的人参总皂苷,并设立空白对照组.在96孔板上培养,0.2 mL/孔,14 d计数早期红系祖细胞,6 d计数晚期红系祖细胞.②取脐血单个核细胞悬液100 μL(5×108L-1),进行MTT检测.③分别将0,25,50,100 mg/L人参总皂苷与脐血造血细胞1×109L-1共培养24 h,进行Western blot检测.④取脐血造血细胞1×109L-1,对照组加入含体积分数为10%马血清的RPMI-1640培养液,人参总皂苷组在常规培养体系中加入终浓度25 mg/L人参总皂苷.分别用5 U/mL红细胞生成素诱导0,2,5,30min后终止反应,进行免疫沉淀检测.主要观察指标:人参总皂苷刺激红系造血祖细胞增殖的能力,红细胞生成素对脐血细胞增殖的影响,人参总皂苷对造血细胞红细胞生成素受体表达的影响,JAK2、STAT5蛋白酪氨酸磷酸化情况.结果:10～75 mg/L人参总皂苷均能提高脐血细胞形成早期红系祖细胞、晚期红系祖细胞的集落产率,以25 mg/L提高幅度为明显.2～50 U/mL红细胞生成素均能促进脐血细胞的增殖,以5 U/mL促进增殖效果为明显.0～100 mg/L人参总皂苷作用脐血细胞24 h后,红细胞生成素受体的表达无明显变化.人参总皂苷作用造血细胞24 h后,加入红细胞生成素继续刺激0～30 min,JAK2和STAT5的酪氨酸磷酸化程度均明显增强.结论:人参总皂苷在促进造血细胞增殖的过程中,尽管对造血细胞红细胞生成素受体的表达无明显影响,但可能通过在红细胞生成素受体介导的信号转导过程中增强JAK2和STAT5的酪氨酸磷酸化程度发挥作用.
作者：李春莉；王建伟；姜蓉；王亚平；柯大智 刊期： 2009年第23期
背景:超声辐射微泡已被大量应用于临床心肌微循环诊断,其安全性已得到证实.研究显示超声靶向破坏微泡可以便骨骼肌毛细血管破坏和局部红细胞渗出,可以促进细胞穿过内皮生理屏障.目的:探讨超声辐射微泡是否可以增加骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的效果.设计、时间及地点:随机对照动物观察,于2006-10/2008-05在东南大学医学院完成.材料:2月龄中国家猪20只,随机分为超声微泡组12只,细胞对照组8只.超声微泡对比剂SonoVue,国药准字J20030117,为上海博莱信谊药业有限责任公司产品.方法:无菌条件下抽取猪骨髓液,密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞.两组动物均建立急性心肌梗死模型,造模后14 d,超声微泡组通过OTW球囊导管先把2.4 mL超声微泡对比剂SonoVue经冠状动脉注入左前降支中段,同时在体表给予1 MHz,2W/cm2超声辐射心肌梗死区,连续辐射90 S后,再注入超顺磁性氧化铁标记的骨髓间充质干细胞5×108个;细胞对照组同法仅单纯输注骨髓间充质干细胞.主要观察指标:采用64层螺旋CT检查心功能变化,光镜观察心肌组织学检测结果,电镜观察血管内皮细胞超微结构.结果:与移植前1 d比较,移植后6周两组左心室射血分数均明显增加,且超声微泡组增加幅度高于细胞对照组(P＜0.01).与细胞对照组比较,超声微泡组普鲁士蓝阳性细胞数明显增多(P＜0.01),且多数分布于心肌梗死周边区,有2例标本可见普鲁士蓝阳性细胞分化为新生血管内皮细胞;梗死周边区毛细血管密度明显升高(P＜0.05).两组心肌血管内皮细胞超微结构无差异,但移植后0 h超声微泡组可见血管内皮间隙增宽.结论:超声辐射微泡可促进梗死心肌内猪自体骨髓间充质干细胞的移植,促进心肌血管新生,从而改善因心肌梗死而受损的心功能.
作者：李金鹆；童嘉毅；冯毅；杨芳 刊期： 2009年第23期
背景:现有治疗手段不足以补充梗死心肌,研究表明干细胞移植有可能促使心肌和血管再生,改善心功能和预后.目的:观察急性心肌梗死区中心和周边移植胚胎干细胞后心肌组织形态学及血液动力学的变化.设计、时间及地点:随机对照动物观察,于2007-03/2008-10在中南大学湘雅医学院人体解剖学与神经生物学系神经生物学实验室完成.材料:SPF级Wistar大鼠40只,随机分为4组:正常对照组、梗死模型组、中心移植组、周边移植组,10只/组.胚胎干细胞-D3株(embryonic stem cells-D3,ES-D3)、布法罗大鼠肝细胞均由中国科学院上海细胞所提供.方法:ES-D3细胞复苏后,以(2.0～5.0)× 107L-1种植于培养瓶中,加入含布法罗大鼠肝细胞的条件培养基体外培养分化.除正常对照组外,余3组结扎冠状动脉左前降支建立急性心肌梗死模型.造模后1周接受细胞移植,ES-D3细胞于移植前1 d进行BrdU标记,以胚胎干细胞培养基调整密度至1×109L-1.中心移植组在梗死区选3个点,每点注入10 μL细胞悬液(含104个细胞)至心室壁内;周边移植组在梗死区周边选3个点同法注入等量细胞悬液.主要观察指标:免疫组化及血流动力学指标检测结果.结果:布法罗大鼠肝细胞条件培养基体外培养的ES-D3细胞,呈相对规则的巢状集落样生长,分化8d即可见部分拟胚体出现自发的节律性收缩活动,心肌肌钙蛋白T免疫染色呈阳性,电镜下可见肌管、肌纤维等肌性结构,证实已分化为心肌细胞.周边移植组BrdU免疫荧光染色呈阳性,而中心移植组呈阴性,进一步对BrdU免疫荧光染色阳性细胞行双抗染色,可见心肌肌钙蛋白T呈阳性表达.移植后4周与正常对照组比较,梗死模型组左室收缩、dp/dtmax均减小(P＜0.01),左室舒张末期压上升(P＜0.01),左室质量、左室质量指数均升高(P＜0.01).与梗死模型组比较,中心移植组各项血流动力学指标无明显变化(P＞0.05);周边移植组左室收缩压、±dp/dtmax均显著升高(P＜0.01),左室舒张末期压显著减小(P＜0.01),左室质量、左室质量指数,梗死面积均显著减小(P＜0.01).结论:急性心肌梗死后于梗死周边区移植胚胎干细胞可以阻止心室重构、减少瘢痕面积、改善心功能.
作者：蒙艳斌；贺莉萍；钱海燕；王歧本；邝满元；潘爱华 刊期： 2009年第23期
背景:目前仍没有合适的标记方法追踪观察兔骨髓间充质干细胞组织修复及基因治疗的效果.目的:观察重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达,及转染后干细胞活性的变化,以寻找稳定标记兔骨髓间充质干细胞的方法. 设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/05在南京市第一医院骨科干细胞实验室完成. 材料:健康2月龄纯种新西兰大白兔4只,由南京医科大学实验动物基地提供.重组腺病毒Ad5/F35-EGFP为北京本元正阳基因有限公司产品. 方法:用密度梯度离心法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,贴肇法纯化扩增.取传至第4代细胞,流式细胞仪检测细胞标志的表达,消化离心重悬后进行计数,平均分成5组,每组细胞数5.0×105个,接种于25 m2培养瓶,空白组加入50 μL的PBS液,剩余4组加入重组腺病毒Ad5/F35-EGFP进行转染,感染复数(MOI)分别为10,20,50,100,继续传代培养.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的生长状态及表面标志鉴定,转染后骨髓间充质干细胞增强型绿色荧光蛋白的表达及活性变化.结果:原代培养48 h后见细胞贴壁,8 d时细胞铺满瓶底80%以上,绝大多数呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,三四天即可传代,第4代细胞CD29和CD44呈阳性表达,CD34与CD45呈阴性表达.转染后24 h可见绿色荧光,7 d时荧光强,细胞转染率与感染复数值的呈线性增长关系,至49 d时仍可见绿色荧光.转染后0,7,14,28,49 d,感染复数=50组的骨髓间充质干细胞数量均与空白组基本相似(P均>0.05),即转染后细胞增殖能力无明显变化. 结论:重组腺病毒载体能高效标记骨髓间充质干细胞,感染复数为50时较为理想,增强型绿色荧光蛋白基因可持续表达49 d,且标记后不影响骨髓间充质干细胞的增殖活性.
作者：张全彬；王黎明；徐燕 刊期： 2009年第23期
背景:目前细胞因子支持的脐血体外扩增是安全性较高、有可能运用于临床的方法之一.目的:比较白血病抑制因子、白细胞介素6及脂多糖对脐血干,祖细胞体外增殖的影响.设计、时间及地点:细胞学体外对照实验,于2003-08/2004-05在广东医学院附属医院中心实验室完成.材料:10例正常脐血标本取自广东医学院附属医院妇产科及湛江市妇幼保健院妇产科,白血病抑制因子为达科为试剂公司产品,白细胞介素6为晶美试剂公司产品,脂多糖由广东医学院附属医院李延平教授自制.方法:密度梯度法体外分离培养脐血单个核细胞,应用磁分选器和单克隆抗体免疫磁珠(阳性)分选法提取脐血CD34+细胞.建立液体培养体系,为含体积分数为40%的胎牛血请、20 g/L牛血清白蛋白、20 μg/L粒巨集落刺激因子、20 μg/L干细胞因子、20 μg/L白细胞介素3的RPMI 1640培养液.取2×108 L-1脐血CD34+细胞,加入配制的液体培养体系50 μL,设立8组:第1组仅加入RPMI 1640作为对照,第2～4组分别单独加入脂多糖、白血病抑制因子、白细胞介素6,第5～7组分别加入脂多糖、白血病抑制因子、白细胞介素6的两两混合液,第8组加入3种刺激因子的混合液,上述各组脂多糖、自血病抑制因子、白细胞介素6的终浓度分别为10 U/mL,10 μg/L,10 mg/L.主要观察指标:MTT法测定不同刺激因子在液体培养体系中对脐血CD34+细胞增殖的影响.结果:培养3d后与对照组比较,单用白血病抑制因子对脐血CD34+细胞具有促增殖作用(F=3.33,P＜0.01),单用脂多糖或白细胞介素6的效果均不显著(F=2.14,1.83.P＞0.05):刺激因子两两联用及3种刺激因子联用时,对脐血CD34+细胞均具有促增殖作用(F=3.54～4.06,P均<0.01),且3种刺激因子联用时的促增殖效果尤为显著.结论:在特定的液体培养体系中,单独使用白血病抑制因子可明显促进脐血干,祖细胞体外增殖,联合情况下白细胞介素6、脂多精与白血病抑制因子具有促增殖协同作用.
作者：张宇明；江黎明；李庆华；熊丹；杨志刚 刊期： 2009年第23期
背景:P21CIp/WAF1、P27Kip1是两种重要的细胞周期的负调控因子,增殖细胞核抗原是反映干细胞增殖的指标.目的:观察体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中P21Cip/WAF1,P27KIp1及增殖细胞核抗原的表达变化.设计、时间及地点:细胞学基因水平观察,于2006-12/2007-06在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心实验室完成.材料:骨髓来源于中山大学附属第二医院行骨髓穿刺的健康供者.方法:全骨髓贴壁筛选法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第5代后,加入含20 μg/L肝细胞生长因子、10 μg/L成纤维细胞生长因子4的opti-MEM I低血清培养基向肝细胞诱导分化.主要观察指标:诱导后RT-PCR检测细胞内P21Cip/WAF1,P27 KIp1及增殖细胞核抗原基因mRNA的表达.结果:骨髓间充质干细胞向肝细胞定向诱导后0,1,3,5,7 d,细胞内P21CIp/WAF1 mRNA表达的相对量逐渐升高(P＜0.01),P27Kip1 mRNA表达的相对量无明显差异(P＞0.05),增殖细胞核抗原mRNA表达的相对量除诱导后0,1 d无明显差异(P＞0.05)外,其余各时间点均逐渐降低(P＜0.01).结论:P21 CIp/WAF1高表达抑制了骨髓间充质干细胞增殖,同时在其向肝细胞分化过程中起一定调控作用,P27KIp1可能并不起作用,增殖细胞核抗原的表达则与P21Cip/WAF1相反,呈逐步减少趋势.
作者：汤志华；闵军；陈积圣；叶林；余杰雄 刊期： 2009年第23期
背景:目前对于移植后的骨髓间充质干细胞在肝组织中的分化途径以及能够在多大程度上修复损伤的肝细胞等问题,尚未达成统一共识.目的:观察经尾静脉移植的骨髓间充质干细胞在急性肝损伤大鼠肝组织中的定植分化情况.设计、时间及地点:细胞学体内对照观察,于2007-12/2008-06在兰州大学中心实验室地点完成.材料:清洁级6～8周龄雄性SD大鼠47只,取5只用于制各骨髓间充质干细胞,剩余42只随机分为3组:肝正常细胞移植组15只、肝损伤细胞移植组14只、肝损伤盐水对照组13只.方法:肝损伤细胞移植组、肝损伤盐水对照组大鼠通过腹腔注射D-氨基半乳糖建立急性肝损伤模型.造模后24 h,肝损伤细胞移植组、肝正常细胞移植组经尾静脉注入BrdU标记的第3代大鼠骨髓间充质干细胞悬液1 mL,含(1.5～2.0)×106个细胞:肝损伤盐水对照组大鼠同法注入等量生理盐水.主要观察指标:移植后肝功能恢复情况,肝脏免疫组织化学检测结果.结果:与造模后24 h比较,移植后2,3周肝正常细胞移植组、肝损伤盐水对照组血清谷丙转氨酶活性无明显变化(P>0.05);肝损伤细胞移植组血清谷丙转氨酶活性明显降低(P＜0.05),肝功能恢复较好.与肝正常细胞移植组比较,肝损伤细胞移植组Brdu+细胞数明显增多(P＜0.01),多分布在汇管区及中央静脉周围,但随着时间延长BrdU+细胞数逐渐减少.结论:经尾静脉移植的骨髓间充质干细胞可促进急性肝损伤大鼠的肝功能恢复,并能够在受损肝脏及正常肝脏中定植分化,且定植与分化的程度可能与肝脏损伤程度有关.
作者：何琼；朱陇东；陈红 刊期： 2009年第23期
背景:目前普遍认为骨髓间充质干细胞是一类高度黏附的成纤维样细胞,但也有研究显示处于非黏附状态的骨髓间质细胞也具有自我复制及多向分化潜能.目的:探讨表皮生长因子对骨髓中存在的非黏附骨髓间充质干细胞产生成纤维细胞集落形成单位的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-07/12在南京医科大学骨与干细胞研究中心完成.材料:4周龄雄性C57/BL6小鼠6只,由南京医科大学实验动物中心提供.表皮生长因子为美国Sigma公司产品.方法:全骨髓法体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,调整细胞浓度为2×109L-1.收集第3代细胞,分别接种于向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞分化的培养液中进行诱导.取30 mL骨髓间充质干细胞悬液,平均分到两管中,表皮生长因子处理组加入终浓度为10 μg/L表皮生长因子,空白对照组加入普通完全培养基,采用反复转移非黏附骨髓细胞培养法,每天将非黏附骨髓细胞转移到新的培养皿,原来的皿中为总骨髓来源的贴壁细胞,转移第1次定义PO1,第2次为PO2,依次类推,培养12 d终止.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的鉴定结果,亚甲基蓝染色显示每皿细胞克隆的形成情况,计算克隆形成区域占皿底面积的百分比及克隆数目.结果:非黏附骨髓间充质细胞在第4天转移到新的培养皿后,继续培养仍能够贴壁生长,并逐渐扩增形成克隆;诱导后能够分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞.给予表皮生长因子处理后,无论是总骨髓来源的贴壁细胞,还是反复转移的非黏附骨髓间充质干细胞,均能够不断产生成纤维细胞集落形成单位,且数量明显多于空白对照组(P<0.05).表皮生长因子处理组总骨髓来源的贴壁细胞、PO1-PO5非黏附骨髓间充质干细胞所形成的贴壁细胞数分别是空白对照组的1.54倍,4.25倍,2.51倍,1.56倍,1.25倍,2.01倍:所产生的克隆数分别是空白对照组的1.2倍,1.8倍,1.4倍,1.4倍,1.1倍.结论:表皮生长因子能有效促进骨髓中的非黏附骨髓间充质干细胞在悬浮状态下增殖,明显提高了骨髓间充质干细胞的富集效率.
作者：王燕；陈燕玲；贲晓明；苗登顺 刊期： 2009年第23期
背景:新生神经元可诱导产生长时程增强,NMDA受体亚基NR2B的激活在成熟神经元诱导的长时程增强中有重要作用,但其对由新生神经元诱导的长时程增强的影响尚未见报道.目的:观察NR2B受体拮抗剂Ro25-6981在大鼠齿状回新生神经元诱导的长时程增强中的作用.设计、时间及地点:脑片电生理实验,于2007-02/06在山西医科大学神经生物实验室完成.材料:3月龄雄性Wistar大鼠26只,由山西医科大学实验动物中心提供.方法:大鼠麻醉后断头取脑,分离海马,制备400μmol/L脑片.采用细胞外微电极记录技术,于海马齿状回分子层内侧1/3处采用双极钨电极进行低频刺激,获得稳定的刺激曲线后,在高频强直刺激下诱导长时程增强.长时程增强的诱导程序为每串刺激频率100 Hz,持续500 ms,间隔20 s,共4串刺激,记录到兴奋性突触后电位＞1 mV以上的脑片用于下述两项实验.①NR2B拮抗剂R025-6981阻断人工脑脊液诱导的长时程增强:脑片分为2组,人工脑脊液组持续通以含有95%O2和5%CO2的人工脑脊液,人工脑脊液+Ro25-6981组在强直刺激前应用3 μmol/L NR2B拮抗剂Ro25-6981作用10 min,后续步骤同上组.②NR2B拮抗剂Fo25-6981抑制荷包牡丹碱诱导的长时程增强:脑片分为2组,荷包牡丹碱组在强直刺激前给予10 μ mol/L荷包牡丹碱灌流10 min,荷包牡丹碱+Ro25-6981组在强直刺激前同时给予3 μ mol/L Ro25-6981和10 μmol/L荷包牡丹碱灌流10 min.主要观察指标:长时程增强记录结果.结果:①强直刺激后50～60 min,人工脑脊液组长时程增强(107.85±1.34)%,人工脑脊液+Ro25-6981组长时程增强(100.75±2.75)%,两组比较差异有显著性意义(P＜0.05).②强直刺激后50～60 min,荷包牡丹碱组长时程增强(164.67±2.40)%,荷包牡丹碱+Ro25-6981组长时程增强(147.56±6.63)%,两组比较差异有显著性意义(P＜0.05).结论:在大鼠海马齿状回区域,NR2B受体拮抗剂Ro25-6981阻断了人工脑脊液诱导的长时程增强,并部分抑制了荷包牡丹碱诱导的长时程增强,提示NR2B受体拮抗荆可以抑制新生神经元诱导的长时程增强.
作者：张文平；张亘瑷；仇玉兰；张策 刊期： 2009年第23期
背景:目前,国内外有关肌源性干细胞移植的研究主要集中在治疗肌营养不良性萎缩症方面,尚未见涉及将肌源性干细胞应用于失神经肌萎缩综合治疗的报道.目的:探讨大鼠肌源性干细胞移植对失神经腓肠肌萎缩进程的影响.设计、时间及地点:随机对照动物观察,于2007-02/2008-07在沈阳医学院完成.材料:成年健康雄性Wister大鼠19只,由沈阳医学院实验动物中心提供.方法:取3只大鼠,无菌条件下切取肱三头肌,体外分离培养肌源性干细胞,贴壁法纯化扩增.余16只大鼠均切断右后肢胫神经,建立失神经腓肠肌模型,分为2组:细胞移植组于已切断的胫神经支配的腓肠肌的内外侧注射经DAPI标记的肌源性干细胞悬液0.2 mL,模型对照组于相同位置注射等量生理盐水,培养4周.主要观察指标:采用计算机生物信号采集处理系统测定反映肌张力的腓肠肌阈强度恢复率和适强度恢复率变化,通过电子天平计算肌湿质量残存率,应用图像分析系统测定肌纤维横截面积残存率.结果:与模型对照组比较,细胞移植组失神经腓肠肌的阈强度恢复率、适强度恢复率均明显降低(P＜0.01,P＜0.05),肌湿质量残存率、肌纤维横截面积残存率均明显升高(P<0.01).结论:肌源性干细胞移植对大鼠失神经肌萎缩进程有较明显的延缓作用.
作者：张庭深；赵建文；苏秋香；牛犁 刊期： 2009年第23期
背景:移植的骨髓间充质干细胞能向损伤病灶部位定向迁移,进而发挥治疗作用,但关于其向病灶定向迁移的具体机制还不十分清楚.目的:观察低氧对人骨髓间充质干细胞趋化因子受体CXCR4和CX3CR1表达的影响.设计、时间和地点:细胞学体外观察,于2008-02/2009-02在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室进行.材料:骨髓标本取自解放军第三军医大学附属新桥医院血液科收治的15～40岁正常或原发病未累及骨髓患者.方法:穿刺采集骨髓,密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化人骨髓间充质干细胞.取生长良好的第3代细胞接种于25 cm2培养瓶中,培养至70%～80%融合后,置于37℃、体积分数分别为3%O2、5%CO2、92%N2的饱和湿度孵育箱内培养48 h,以常氧培养作为对照.主要观察指标:相差显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面标记物,Real time荧光定量PCR法检测CXCR4和CX3CR1 mRNA的表达,免疫细胞化学和Western blot法检测CXCR4和CX3CR1蛋白的表达.结果:体外分离纯化的人骨髓间充质干细胞呈成纤维细胞样,培养12～14 d达90%汇合,呈极性排列,集落呈漩涡状;CD105和CD29阳性率分别为99.38%和99.13%,而CD14,CD45均呈阴性表达.在体积分数为3%的O2培养条件下,人骨髓间充质干细胞CXCR4和CXCR1 mRNA的表达分别是常规培养条件下的2.130倍和2.361倍,CXCR4和CX3CR1蛋白的表达分别是常规培养条件下的1.69倍和1.93倍,CXCR4和CX3CR1主要表达于人骨髓间充质干细胞的胞膜和胞浆.结论:体积分数为3%的O2低氧条件能够促进入骨髓间充质干细胞趋化因子受体CXCR4和CX3CR1mRNA及蛋白的表达,这可能是体内移植的骨髓间充质干细胞向损伤病灶定向迁移的机制之一.
作者：朱洁；周竹娟；龚自力；郑健 刊期： 2009年第23期
背景:前期实验已证实骨髓间充质干细胞表面存在整合素受体,但血管生成素1是否能通过整合素受体促进骨髓间充质干细胞的生存、抗凋亡目前尚不明确. 目的:探讨血管生成素1对大鼠骨髓间充质干细胞黏附、活力、抗凋亡的影响,并初步分析其信号转导机制.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-01/10在厦门大学附属中山医院开放实验室完成.材料:清洁级SD大鼠40只,由中科院上海实验动物中心提供.人血管生成素1为R&D公司产品.方法:密度梯度离心结合贴壁分离法体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞,第3～6代细胞用于实验.分别以不同的基质包被24孔培养板1 h,清洗后再加入单细胞悬液,设立7组:第1组作为对照,以含0.1%牛血清白蛋白的PBS包被:第2～4组分别以玻粘连蛋白、纤维粘连蛋白、血管生成素1包被;第5～7组单细胞悬液预先分别与乙二胺四乙酸、β1抗体、RGD抗体孵育10 min后再加入24孔板,行血管生成素1包被.主要观察指标:通过黏附测定、锥虫蓝染色、MTT试验、Hoechst染色和Annexin V/PI法检测血管生成素1对骨髓间充质干细胞的黏附、活力、抗凋亡等生物学效应,结合整合亲抗体和信号转导阻滞剂通过Western blotting法检测磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B、总丝氨酸/苏氩酸蛋白激酶B、Bcl-2和B-actin水平.结果:成功分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪鉴定其纯度达98.3%.黏附试验显示与对照组比较,培养1,2,3 d血管生成索1均能促进骨髓间充质干细胞的黏附(P<0.01),该效应能被乙二胺四乙酸、整合素亚单位β1抗体和RGD抗体所抑制(P＜0.01).血管生成素1能促进骨髓间充质干细胞在血清饥饿下的存活(P<0.01)、增殖(P＜0.01)和提高磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B、Bcl-2的表达来拮抗紫杉醇诱导的凋亡(P＜0.01),RGD抗体能抑制上述作用.结论:血管生成素1可与整合素受体结合促进骨髓间充质干细胞的黏附、存活和增殖,并通过上调磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B和Bcl-2的表达发挥抗凋亡作用.
作者：陈国欢；王挹青；郭晋村 刊期： 2009年第23期
背景:对于嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的疗效目前尚无共识.或许单一细胞移植可能并不是修复脊髓损伤的佳选择.如何选择适当的干预手段予以联合应用,并使之实现从实验室走向临床应用是细胞移植策略中的重点问题.目的:探讨大鼠嗅鞘细胞移植与督脉电针联合应用修复大鼠脊髓损伤的可行性.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-08/2008-08在清华大学二附院脑神经病研究所实验室完成.材料:成年雄性Wistar大鼠70只,取10只用于制备嗅鞘细胞.剩余60只随机分为4组:模型对照组、嗅鞘细胞移植组、督脉电针组、联合组,15只/组.方法:各组大鼠均建立脊髓全横断模型.造模后暴露脊髓,嗅鞘细胞移植组、联合组向填入脊髓横断处的明胶海绵内缓慢注射嗅鞘细胞悬液10 μL;模型对照组、督脉电针组同法注射等量DMEM-F12培养液.从造模成功后第2天开始,督脉电针组、联合组动物接受1次/d的督脉电针治疗,选大椎穴(DU14)、命门穴(DU4)进行针刺,针刺深度5 mm,大椎穴接正极,命门穴接负极,电针15 min,电针频率20 Hz,持续脉冲电流12～15 mV,连续7 d为1个疗程,疗程间隔2 d.主要观察指标:造模后BBB运动功能评分的变化,脊髓诱发电位检测结果.结果:各组动物均成活10周.与模型对照组比较,造模后4～10周嗅鞘细胞移植组、督脉电针组、联合组BBB运动功能评分均明显升高(P<0.05),且联合组升高幅度明显高于嗅鞘细胞移植组、督脉电针组(P＜0.05).与模型对照组比较,造模后4～10周嗅鞘细胞移植组、督脉电针组、联合组波幅电压明显升高(P＜0.05或P＜0.01),反应潜伏期均明显降低(P＜0.05或P＜0.01),且联合组差异变化尤为显著.嗅鞘细胞移植组与督脉电针组各指标之间比较无明显差异(P>0.05).结论:嗅鞘细胞移植和督脉电针联合应用可促进脊髓损伤大鼠神经突触的再生,改善其肢体运动功能.
作者：彭忠勇；陈志斌；修波；赵振强；袁昆雄；孙朝晖 刊期： 2009年第23期
冠状动脉粥样硬化性心脏病可引起心肌细胞的不可逆性改变,干细胞移植治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病能改善心脏功能,但其机制尚不完全清楚,可能与心肌再生、血管新生、心脏结构重建和干细胞旁分泌等作用相关联.文章针对干细胞移植技术、生物学特点、移植途径等进行综述,并具体分析了干细胞移植成功的判断,干细胞改善心脏功能的机制以及干细胞移植的安全性等问题.
作者：谢杰睿 刊期： 2009年第23期
背景:针对帕金森病进行细胞移植治疗的研究进程中,除寻求合适的细胞系外,如何将各种有分化潜能的细胞诱导为含量丰富、有功能的多巴胺能神经元尤为关键.目的:观察不同浓度抗坏血酸对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-01/12在广西医科大学科学实验中心完成.材料:清洁级新生24 h内SD大鼠30只,由广西医科大学实验动物中心提供.抗坏血酸为Sigma产品.方法:取新生鼠脑组织,组织块胰蛋白酶消化法体外分离培养神经干细胞,传至第2代以5×108L-1密度接种.设立4组:空白对照组不给予抗坏血酸,仅加入含体积分数为10%的胎牛血清、2%B27的DMEM/F12培养基;剩余3组在此基础上分别加入50,100,200 μmol/L抗坏血酸进行诱导,10 d后终止诱导.主要观察指标:RT-PCR检测诱导后细胞酪氨酸羟化酶基因mRNA的表达,免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞,检测神经干细胞向多巴胺能神经元分化率.结果:各浓度抗坏血酸诱导组均得到795 bp的扩增片断,即均表达酪氨酸羟化酶mRNA.神经球具有自我更新和表达巢蛋白的能力,诱导分化后的细胞能表达神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞特异性抗原.与空白对照组比较,50,100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组酪氨酸羟化酶阳性细胞率均明显升高(P<0.05);且100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组升高幅度明显高于50 μ mol/L(P<0.05),100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组间比较无明显差异(P>0.05).结论:从新生鼠脑组织分离出的神经干细胞在体外具有自我更新、多向分化潜能及表达巢蛋白的能力.50～200 μ mol/L抗坏血酸均能促进神经干细胞向多巴胺能神经元分化,抗坏血酸浓度从100 μmol/L增加至200 μmol/L时酪氨酸羟化酶阳性细胞率无明显变化.
作者：沈岳飞；陈梅玲；罗彦妮；范瑞芳；莫雪安 刊期： 2009年第23期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
