安春厚；程扬；原泉；李建军
背景:目前人胚胎干细胞建系的技术路线主要有囊胚法、核移植法和胚胎单卵裂球法,但由于破坏胚胎,涉及诸多伦理问题.目的:探讨利用冷冻胚胎建立人类胚胎干细胞系的可行性.设计、时间及地点:细胞学体内外实验,于2005-01/2006-08在沈阳市妇婴医院生殖中心完成.材料:妊娠13.5 d的ICR鼠20只用于制备小鼠胚胎成纤维细胞饲养层,10周龄SICD鼠2只用于人胚胎干细胞体内分化实验.行IVF/ICSI助孕患者自愿捐献的冷冻胚胎,由沈阳市妇婴医院生殖中心提供.方法:复苏冷冻的胚胎,采用序贯培养法进行囊胚培养,用免疫外科方法去除滋养细胞,将得到的胚胎内细胞团接种于丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞上培养并传代.主要观察指标:取不同代次的培养细胞,分别进行生长特性、碱性磷酸酶染色、转录因子OCT-4、阶段特异性胚胎抗原SSEA-4、SSEA-1、肿瘤排斥抗原TRA-1-60、TAR-1-81、核型及体内分化全能性鉴定.结果:20个解冻卵裂期胚胎,获得9个囊胚,分离完整的内细胞团共7个,从7个内细胞团培养出2个人胚胎干细胞系,其中一个细胞系连续培养76代(20个月).所培养的细胞具有人胚胎干细胞的共同生物学特性,即细胞呈扁平或圆形,可见1～3个核仁;碱性磷酸酶以及SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-81,TRA-1-60,OCT-4均呈阳性表达,而SSEA-1呈阴性;核型正常,为46,XX核型;将细胞注射入SCID鼠皮下形成肿瘤,病理切片显示为成熟畸胎瘤;短串联重复分型结果显示所形成的畸胎瘤与人胚胎干细胞为相同的遗传背景.结论:实施体外受精-胚胎移植的夫妇怀孕后,多余的冷冻保存胚胎所分离培养的细胞具备人胚胎干细胞的所有特性,是建立人胚胎干细胞系很好的材料来源.
作者：谭季春；李扬；曲文玉；孙开来；刘丽英；蒋丽；郭帅帅 刊期： 2009年第23期
背景:目前普遍认为骨髓间充质干细胞是一类高度黏附的成纤维样细胞,但也有研究显示处于非黏附状态的骨髓间质细胞也具有自我复制及多向分化潜能.目的:探讨表皮生长因子对骨髓中存在的非黏附骨髓间充质干细胞产生成纤维细胞集落形成单位的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-07/12在南京医科大学骨与干细胞研究中心完成.材料:4周龄雄性C57/BL6小鼠6只,由南京医科大学实验动物中心提供.表皮生长因子为美国Sigma公司产品.方法:全骨髓法体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,调整细胞浓度为2×109L-1.收集第3代细胞,分别接种于向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞分化的培养液中进行诱导.取30 mL骨髓间充质干细胞悬液,平均分到两管中,表皮生长因子处理组加入终浓度为10 μg/L表皮生长因子,空白对照组加入普通完全培养基,采用反复转移非黏附骨髓细胞培养法,每天将非黏附骨髓细胞转移到新的培养皿,原来的皿中为总骨髓来源的贴壁细胞,转移第1次定义PO1,第2次为PO2,依次类推,培养12 d终止.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的鉴定结果,亚甲基蓝染色显示每皿细胞克隆的形成情况,计算克隆形成区域占皿底面积的百分比及克隆数目.结果:非黏附骨髓间充质细胞在第4天转移到新的培养皿后,继续培养仍能够贴壁生长,并逐渐扩增形成克隆;诱导后能够分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞.给予表皮生长因子处理后,无论是总骨髓来源的贴壁细胞,还是反复转移的非黏附骨髓间充质干细胞,均能够不断产生成纤维细胞集落形成单位,且数量明显多于空白对照组(P<0.05).表皮生长因子处理组总骨髓来源的贴壁细胞、PO1-PO5非黏附骨髓间充质干细胞所形成的贴壁细胞数分别是空白对照组的1.54倍,4.25倍,2.51倍,1.56倍,1.25倍,2.01倍:所产生的克隆数分别是空白对照组的1.2倍,1.8倍,1.4倍,1.4倍,1.1倍.结论:表皮生长因子能有效促进骨髓中的非黏附骨髓间充质干细胞在悬浮状态下增殖,明显提高了骨髓间充质干细胞的富集效率.
作者：王燕；陈燕玲；贲晓明；苗登顺 刊期： 2009年第23期
背景:目前细胞因子支持的脐血体外扩增是安全性较高、有可能运用于临床的方法之一.目的:比较白血病抑制因子、白细胞介素6及脂多糖对脐血干,祖细胞体外增殖的影响.设计、时间及地点:细胞学体外对照实验,于2003-08/2004-05在广东医学院附属医院中心实验室完成.材料:10例正常脐血标本取自广东医学院附属医院妇产科及湛江市妇幼保健院妇产科,白血病抑制因子为达科为试剂公司产品,白细胞介素6为晶美试剂公司产品,脂多糖由广东医学院附属医院李延平教授自制.方法:密度梯度法体外分离培养脐血单个核细胞,应用磁分选器和单克隆抗体免疫磁珠(阳性)分选法提取脐血CD34+细胞.建立液体培养体系,为含体积分数为40%的胎牛血请、20 g/L牛血清白蛋白、20 μg/L粒巨集落刺激因子、20 μg/L干细胞因子、20 μg/L白细胞介素3的RPMI 1640培养液.取2×108 L-1脐血CD34+细胞,加入配制的液体培养体系50 μL,设立8组:第1组仅加入RPMI 1640作为对照,第2～4组分别单独加入脂多糖、白血病抑制因子、白细胞介素6,第5～7组分别加入脂多糖、白血病抑制因子、白细胞介素6的两两混合液,第8组加入3种刺激因子的混合液,上述各组脂多糖、自血病抑制因子、白细胞介素6的终浓度分别为10 U/mL,10 μg/L,10 mg/L.主要观察指标:MTT法测定不同刺激因子在液体培养体系中对脐血CD34+细胞增殖的影响.结果:培养3d后与对照组比较,单用白血病抑制因子对脐血CD34+细胞具有促增殖作用(F=3.33,P＜0.01),单用脂多糖或白细胞介素6的效果均不显著(F=2.14,1.83.P＞0.05):刺激因子两两联用及3种刺激因子联用时,对脐血CD34+细胞均具有促增殖作用(F=3.54～4.06,P均<0.01),且3种刺激因子联用时的促增殖效果尤为显著.结论:在特定的液体培养体系中,单独使用白血病抑制因子可明显促进脐血干,祖细胞体外增殖,联合情况下白细胞介素6、脂多精与白血病抑制因子具有促增殖协同作用.
作者：张宇明；江黎明；李庆华；熊丹；杨志刚 刊期： 2009年第23期
背景:近年来关于骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤修复方面的研究较多,但目前相关机制尚不清楚.目的:观察间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后脑源性神经营养因子表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2003-04/07在中国医科大学神经解剖学实验室完成.材料:选取鼠龄3个月的SD大鼠64只,雌雄不拘,体质量250～300 g,随机抽取4只大鼠用于骨髓间充质干细胞的分离与培养,其余60只用于制备脊髓横断损伤模型.方法:60只大鼠随机抽签法分为3组,细胞移植组(n=24):脊髓损伤后第7天,无菌条件下以微量注射缓慢注入含骨髓间充质干细胞(1×109L-1)的培养液5μL至脊髓损伤区;PBS组(n=24):注入等量(5μL)磷酸盐缓冲液体;空白对照组(n=12):注入生理盐水5μL.主要观察指标:分别于造模后7,14,28 d取材,观察骨髓间充质干细胞的形态变化;免疫组织化学法检测间充质干细胞移植后大鼠脊髓损伤区脑源性神经营养因子的表达.结果:60只SD大鼠均进入结果分析.10代以后细胞增殖能力有所减弱,胞体变得扁平,若加入碱性成纤维细胞生长因子,则可维持其增殖能力和形态.大鼠脑源性神经营养因子在正常大鼠脊髓组织中有一定表达,细胞移植后第7,14,28天,细胞移植组脑源性神经营养因子表达均高于PBS组和空白对照组(P＜0.05);空白对照组与PBS组脑源性神经营养因子表达无明显差异(P＞0.05).结论:骨髓间充质干细胞在移植后通过上调脑源性神经营养因子的表达从而促进轴突的再生,可能是治疗脊髓损伤的重要机制.
作者：陈晓春；牛庆飞；杨爽 刊期： 2009年第23期
背景:针对帕金森病进行细胞移植治疗的研究进程中,除寻求合适的细胞系外,如何将各种有分化潜能的细胞诱导为含量丰富、有功能的多巴胺能神经元尤为关键.目的:观察不同浓度抗坏血酸对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-01/12在广西医科大学科学实验中心完成.材料:清洁级新生24 h内SD大鼠30只,由广西医科大学实验动物中心提供.抗坏血酸为Sigma产品.方法:取新生鼠脑组织,组织块胰蛋白酶消化法体外分离培养神经干细胞,传至第2代以5×108L-1密度接种.设立4组:空白对照组不给予抗坏血酸,仅加入含体积分数为10%的胎牛血清、2%B27的DMEM/F12培养基;剩余3组在此基础上分别加入50,100,200 μmol/L抗坏血酸进行诱导,10 d后终止诱导.主要观察指标:RT-PCR检测诱导后细胞酪氨酸羟化酶基因mRNA的表达,免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞,检测神经干细胞向多巴胺能神经元分化率.结果:各浓度抗坏血酸诱导组均得到795 bp的扩增片断,即均表达酪氨酸羟化酶mRNA.神经球具有自我更新和表达巢蛋白的能力,诱导分化后的细胞能表达神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞特异性抗原.与空白对照组比较,50,100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组酪氨酸羟化酶阳性细胞率均明显升高(P<0.05);且100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组升高幅度明显高于50 μ mol/L(P<0.05),100,200 μ mol/L抗坏血酸诱导组间比较无明显差异(P>0.05).结论:从新生鼠脑组织分离出的神经干细胞在体外具有自我更新、多向分化潜能及表达巢蛋白的能力.50～200 μ mol/L抗坏血酸均能促进神经干细胞向多巴胺能神经元分化,抗坏血酸浓度从100 μmol/L增加至200 μmol/L时酪氨酸羟化酶阳性细胞率无明显变化.
作者：沈岳飞；陈梅玲；罗彦妮；范瑞芳；莫雪安 刊期： 2009年第23期
背景:颅神经嵴干细胞可以作为颌面部各种组织和器官分化研究的重要细胞来源,如何使其获得永生化具有重要意义.人类细胞自发永生化的频率非常低,而一些永生化的基因可以显著增加这种频率.目的:观察人端粒酶催化亚基基因在大鼠颅神经嵴干细胞永生化过程中的作用.设计、时间及地点:观察性实验,于2007-09/2008-06在解放军第四军医大学完成.材料:选择清洁级孕8.5 d SD大鼠3只,6周,体质量180 g:先天性细胞免疫缺陷动物雄性Balb/c裸小鼠,体质量18～21 g,均由解放军第四军医大学实验动物中心提供.质粒PCIneo-hTERT由解放军第四军医大学口腔医院牙体牙髓科提供.方法:原代培养大鼠颅神经嵴干细胞后,将含有人端粒酶催化亚基基因的质粒PCIneo-hTERT转入大鼠颅神经嵴干细胞.经G418筛选后扩增,并连续培养.采用免疫细胞化学法观察转染细胞内人端粒酶催化亚基基因和颅神经嵴干细胞的特异标志物P75的表达,检测细胞的端粒酶活性,绘制细胞生长曲线观察其增殖能力,并通过裸鼠移植实验了解转染细胞的特性.主要观察指标:细胞克隆、特异性蛋白P75表达、端粒酶活性、增殖能力及致瘤性实验结果.结果:①质粒PCIneo-hTERT转染细胞后24 h,有少量细胞死亡.加G418后48 h,细胞逐步开始大量死亡.12 d后出现抗性细胞克隆,共有3个细胞克隆生长良好.分别命名为克隆1、2、3.克隆1和克隆2经过20～25代的传代后,细胞发生衰老、死亡;而克隆3在体外长期培养条件下生长状态良好,稳定表达人端粒酶催化亚基和P75.经转染后颅神经嵴干细胞的端粒酶活性明显升高,且能持续表达.②人端粒酶催化亚基基因转染后,3个细胞克隆在初期的增殖能力较强,随后克隆1、2的增殖速度逐渐变慢,出现死亡,克隆3越过衰老期,且无致瘤性.结论:人端粒酶催化亚基基因转染大鼠颅神经嵴干细胞后,细胞得以永生化,其表型稳定,可作为颅颌面部细胞分化和组织工程研究的种子细胞.
作者：吕红兵；王捍国；吴甘茶；闫福华 刊期： 2009年第23期
背景:新生神经元可诱导产生长时程增强,NMDA受体亚基NR2B的激活在成熟神经元诱导的长时程增强中有重要作用,但其对由新生神经元诱导的长时程增强的影响尚未见报道.目的:观察NR2B受体拮抗剂Ro25-6981在大鼠齿状回新生神经元诱导的长时程增强中的作用.设计、时间及地点:脑片电生理实验,于2007-02/06在山西医科大学神经生物实验室完成.材料:3月龄雄性Wistar大鼠26只,由山西医科大学实验动物中心提供.方法:大鼠麻醉后断头取脑,分离海马,制备400μmol/L脑片.采用细胞外微电极记录技术,于海马齿状回分子层内侧1/3处采用双极钨电极进行低频刺激,获得稳定的刺激曲线后,在高频强直刺激下诱导长时程增强.长时程增强的诱导程序为每串刺激频率100 Hz,持续500 ms,间隔20 s,共4串刺激,记录到兴奋性突触后电位＞1 mV以上的脑片用于下述两项实验.①NR2B拮抗剂R025-6981阻断人工脑脊液诱导的长时程增强:脑片分为2组,人工脑脊液组持续通以含有95%O2和5%CO2的人工脑脊液,人工脑脊液+Ro25-6981组在强直刺激前应用3 μmol/L NR2B拮抗剂Ro25-6981作用10 min,后续步骤同上组.②NR2B拮抗剂Fo25-6981抑制荷包牡丹碱诱导的长时程增强:脑片分为2组,荷包牡丹碱组在强直刺激前给予10 μ mol/L荷包牡丹碱灌流10 min,荷包牡丹碱+Ro25-6981组在强直刺激前同时给予3 μ mol/L Ro25-6981和10 μmol/L荷包牡丹碱灌流10 min.主要观察指标:长时程增强记录结果.结果:①强直刺激后50～60 min,人工脑脊液组长时程增强(107.85±1.34)%,人工脑脊液+Ro25-6981组长时程增强(100.75±2.75)%,两组比较差异有显著性意义(P＜0.05).②强直刺激后50～60 min,荷包牡丹碱组长时程增强(164.67±2.40)%,荷包牡丹碱+Ro25-6981组长时程增强(147.56±6.63)%,两组比较差异有显著性意义(P＜0.05).结论:在大鼠海马齿状回区域,NR2B受体拮抗剂Ro25-6981阻断了人工脑脊液诱导的长时程增强,并部分抑制了荷包牡丹碱诱导的长时程增强,提示NR2B受体拮抗荆可以抑制新生神经元诱导的长时程增强.
作者：张文平；张亘瑷；仇玉兰；张策 刊期： 2009年第23期
背景:研究证实多数造血生长因子通过JAKs-STATs途径转导信号,调节血细胞的增殖与分化.人参总皂苷能够促进早期的造血干/祖细胞向红系细胞分化,具有类似造血生长因子的功效,在红系血细胞发生中造血细胞膜表面红细胞生成素受体起着关键性的作用.目的:通过红细胞生成素及其受体介导的JAK2/STAT5信号转导途径,分析人参总皂苷定向诱导红系血细胞发生的分子机制.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-05/2008-10在在重庆医科大学基础医学研究所、组织胚胎学教研室完成.材料:脐血细胞来源于正常足月妊娠产妇分娩脐带血,由重庆医科大学第一附属医院提供.人参总皂苷由重庆中药研究所惠赠,纯度95%以上,添加MI-1640培养液配成1g/L的工作液.方法:①集落形成实验:取5×106L-1脐血单个核细胞,添加含马血清的RPMI-1640培养液,10,25,50,75,100 mg/L人参总皂苷组分别加入对应终浓度的人参总皂苷,并设立空白对照组.在96孔板上培养,0.2 mL/孔,14 d计数早期红系祖细胞,6 d计数晚期红系祖细胞.②取脐血单个核细胞悬液100 μL(5×108L-1),进行MTT检测.③分别将0,25,50,100 mg/L人参总皂苷与脐血造血细胞1×109L-1共培养24 h,进行Western blot检测.④取脐血造血细胞1×109L-1,对照组加入含体积分数为10%马血清的RPMI-1640培养液,人参总皂苷组在常规培养体系中加入终浓度25 mg/L人参总皂苷.分别用5 U/mL红细胞生成素诱导0,2,5,30min后终止反应,进行免疫沉淀检测.主要观察指标:人参总皂苷刺激红系造血祖细胞增殖的能力,红细胞生成素对脐血细胞增殖的影响,人参总皂苷对造血细胞红细胞生成素受体表达的影响,JAK2、STAT5蛋白酪氨酸磷酸化情况.结果:10～75 mg/L人参总皂苷均能提高脐血细胞形成早期红系祖细胞、晚期红系祖细胞的集落产率,以25 mg/L提高幅度为明显.2～50 U/mL红细胞生成素均能促进脐血细胞的增殖,以5 U/mL促进增殖效果为明显.0～100 mg/L人参总皂苷作用脐血细胞24 h后,红细胞生成素受体的表达无明显变化.人参总皂苷作用造血细胞24 h后,加入红细胞生成素继续刺激0～30 min,JAK2和STAT5的酪氨酸磷酸化程度均明显增强.结论:人参总皂苷在促进造血细胞增殖的过程中,尽管对造血细胞红细胞生成素受体的表达无明显影响,但可能通过在红细胞生成素受体介导的信号转导过程中增强JAK2和STAT5的酪氨酸磷酸化程度发挥作用.
作者：李春莉；王建伟；姜蓉；王亚平；柯大智 刊期： 2009年第23期
背景:三七总皂甙对骨髓基质细胞向神经样细胞分化的效应及相关信号通路目前尚不明确.目的:探讨细胞外信号调节蛋白激酶1/2信号通路对三七总皂甙调节大鼠骨髓基质细胞向神经细胞增殖、分化的作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-05/10在汕头大学医学院分子生物学实验室完成.材料:4～6周龄雄性SD大鼠9只,由汕头大学医学院实验动物中心提供.三七总皂甙为广西梧州制药集团股份有限公司产品,细胞外信号调节蛋白激酶的抑制剂PD98059为Cell Signaling Tech公司产品.方法:全骨髓法体外分离纯化大鼠骨髓基质细胞,取传至第3代细胞进行诱导分化,设立3组:单纯诱导组向培养液中加入10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,预诱导24 h后全量换为正式诱导液(含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2%DMSO、200 μ mol/L丁羟回醚的α-MEM培养基),每24 h半量换诱导液1次;三七总皂甙组向预诱导液和正式诱导液内加入终浓度100 mg/L三七总皂甙:PD98059组在三七总皂甙组培养液基础上加入10 μ mol/L PD98059.主要观察指标:细胞形态学观察,MTT法检测细胞增殖情况,免疫组织化学方法鉴定细胞Nestin的表达.结果:诱导6 h后,少数细胞呈锥形,细胞突起增多伸长,类似神经元,继续诱导培养后细胞突起增多,突起相瓦连接成网状.与单纯诱导组、PD98059组比较,诱导6,12,24 h三七总皂甙组细胞均明显增殖(P＜0.05),且随诱导时间延长呈递增趋势(P＜0.05):单纯诱导组、PD98059组间比较无明显差异(P＞0.05).与单纯诱导组比较,诱导24 h后三七总皂甙组Nestin阳性率明显升高(P＜0.05),PD98059组Nestin阳性率明显降低(P＜0.05).结论:三七总皂甙可以促进骨髓基质细胞的神经分化和分化后增殖,细胞外信号调节蛋白激酶1/2的特异性抑制剂PD98059能够拮抗三七总皂甙促增殖分化作用,提示细胞外信号调节蛋白激酶1/2信号通路是三七总皂甙促进骨髓基质细胞向神经细胞分化和增殖的重要环节.
作者：张震宇；曾艳；李学东；刘东宁 刊期： 2009年第23期
背景:为明确细胞移植后症状改善是否由移植所致,既往多采用侵袭性方法,但是这种方法不适用于动态追踪及人体研究.如果能够在合适示踪剂的帮助下,采用无创伤性影像学技术在活体识别、跟踪移植后细胞的存活状态,将显著提高细胞移植疗法的学术价值.目的:初步探讨菲立磁-多聚赖氨酸复合物体外磁性标记兔骨髓基质细胞的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/08在珠江医院神经外科实验室完成.材料:2月龄新西兰大白兔8只,由广州中医药大学实验动物中心提供.菲立磁为Advanced Magnetic公司产品,多聚赖氨酸为sigma公司产品.方法:无菌条件下穿刺抽取兔股骨骨髓,梯度密度离心法分离获取骨髓基质细胞,收集第2代细胞,加入含白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子及胎牛血清的神经干细胞培养摹诱导5 d.将50 mg/L菲立磁和1.5 mg/L多聚赖氨酸混合,振荡30 min后,将复合物加入到细胞培养基中进行标记,孵育细胞24 h.主要观察指标:骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化情况,细胞内铁的鉴定,菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记对细胞增殖或分化的影响.结果:骨髓基质细胞诱导后可见少量细胞的胞体变圆变大,突起缩短,随时间延长,圆形细胞逐渐增多,部分聚集成簇、成球,FITC荧光染色示巢蛋白呈阳性表达.普鲁士蓝染色结果显示99%以上骨髓基质细胞的胞质内出现细小的蓝色铁颗粒.在含菲立磁-多聚赖氨酸复合物的培养基中,骨髓摹质细胞可继续增殖和分化,但增殖分裂后细胞质内铁颗粒数量较增殖前有所减少,经鉴定部分为神经元特异性烯醇化酶阳性细胞.结论:菲立磁-多聚赖氨酸复合物可在体外高效标记骨髓基质细胞,且标记后细胞的活性、增殖和分化能力不受影响.
作者：何骁；李贵涛；唐晓军；金勋杰；罗狄鑫；齐勇 刊期： 2009年第23期
背景:前期实验已证实骨髓间充质干细胞表面存在整合素受体,但血管生成素1是否能通过整合素受体促进骨髓间充质干细胞的生存、抗凋亡目前尚不明确. 目的:探讨血管生成素1对大鼠骨髓间充质干细胞黏附、活力、抗凋亡的影响,并初步分析其信号转导机制.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-01/10在厦门大学附属中山医院开放实验室完成.材料:清洁级SD大鼠40只,由中科院上海实验动物中心提供.人血管生成素1为R&D公司产品.方法:密度梯度离心结合贴壁分离法体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞,第3～6代细胞用于实验.分别以不同的基质包被24孔培养板1 h,清洗后再加入单细胞悬液,设立7组:第1组作为对照,以含0.1%牛血清白蛋白的PBS包被:第2～4组分别以玻粘连蛋白、纤维粘连蛋白、血管生成素1包被;第5～7组单细胞悬液预先分别与乙二胺四乙酸、β1抗体、RGD抗体孵育10 min后再加入24孔板,行血管生成素1包被.主要观察指标:通过黏附测定、锥虫蓝染色、MTT试验、Hoechst染色和Annexin V/PI法检测血管生成素1对骨髓间充质干细胞的黏附、活力、抗凋亡等生物学效应,结合整合亲抗体和信号转导阻滞剂通过Western blotting法检测磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B、总丝氨酸/苏氩酸蛋白激酶B、Bcl-2和B-actin水平.结果:成功分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪鉴定其纯度达98.3%.黏附试验显示与对照组比较,培养1,2,3 d血管生成索1均能促进骨髓间充质干细胞的黏附(P<0.01),该效应能被乙二胺四乙酸、整合素亚单位β1抗体和RGD抗体所抑制(P＜0.01).血管生成素1能促进骨髓间充质干细胞在血清饥饿下的存活(P<0.01)、增殖(P＜0.01)和提高磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B、Bcl-2的表达来拮抗紫杉醇诱导的凋亡(P＜0.01),RGD抗体能抑制上述作用.结论:血管生成素1可与整合素受体结合促进骨髓间充质干细胞的黏附、存活和增殖,并通过上调磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B和Bcl-2的表达发挥抗凋亡作用.
作者：陈国欢；王挹青；郭晋村 刊期： 2009年第23期
背景:P21CIp/WAF1、P27Kip1是两种重要的细胞周期的负调控因子,增殖细胞核抗原是反映干细胞增殖的指标.目的:观察体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中P21Cip/WAF1,P27KIp1及增殖细胞核抗原的表达变化.设计、时间及地点:细胞学基因水平观察,于2006-12/2007-06在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心实验室完成.材料:骨髓来源于中山大学附属第二医院行骨髓穿刺的健康供者.方法:全骨髓贴壁筛选法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第5代后,加入含20 μg/L肝细胞生长因子、10 μg/L成纤维细胞生长因子4的opti-MEM I低血清培养基向肝细胞诱导分化.主要观察指标:诱导后RT-PCR检测细胞内P21Cip/WAF1,P27 KIp1及增殖细胞核抗原基因mRNA的表达.结果:骨髓间充质干细胞向肝细胞定向诱导后0,1,3,5,7 d,细胞内P21CIp/WAF1 mRNA表达的相对量逐渐升高(P＜0.01),P27Kip1 mRNA表达的相对量无明显差异(P＞0.05),增殖细胞核抗原mRNA表达的相对量除诱导后0,1 d无明显差异(P＞0.05)外,其余各时间点均逐渐降低(P＜0.01).结论:P21 CIp/WAF1高表达抑制了骨髓间充质干细胞增殖,同时在其向肝细胞分化过程中起一定调控作用,P27KIp1可能并不起作用,增殖细胞核抗原的表达则与P21Cip/WAF1相反,呈逐步减少趋势.
作者：汤志华；闵军；陈积圣；叶林；余杰雄 刊期： 2009年第23期
背景:已证实放射性神经干细胞损伤是放射性脑损伤的可能途径之一,而碱性成纤维细胞生长因子对放射性损伤具有保护作用,但其机制尚不清楚.目的:观察外源性碱性成纤维细胞生长因子对放射诱导C17.2神经干细胞凋亡的抑制作用.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2006-11/2008-06在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.材料:C17.2神经干细胞系为小鼠小脑祖细胞永生化后构建的神经干细胞系.方法:以直线加速器进行总量为8 Gy外照射C17.2神经干细胞建立离体放射性损伤模型,以1×107L-1的细胞浓度接种C17.2神经干细胞悬液至96孔板,每孔加细胞悬液200 μL,按0,25,50,100 μg/L(0 μg/L作对照)分别加入碱性成纤维细胞生长因子干预.主要观察指标:四甲基偶氮唑盐法检测细胞活性并拟合生存曲线,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:随碱性成纤维细胞生长因子浓度升高,C17.2神经干细胞增殖比明显增加(P＜0.01),呈现明显剂量-效应关系.碱性成纤维细胞生长因子浓度为100 μg/L时活性强,未显示细胞毒性.流式细胞仪检测结果显示:对照组细胞凋亡率高于25,50 μg/L碱性成纤维细胞生长因子组(P<0.01),25,50,100μg/L碱性成纤维细胞生长因子组组间相比,差异具有显著性意义(P<0.05～0.01).结论:外源性碱性成纤维细胞生长因子对放射诱导的C17.2神经干细胞凋亡具有明显抑制作用.
作者：周海红；刘运林；刘军；肖颂华；邢诒刚；赵斌 刊期： 2009年第23期
背景:超声辐射微泡已被大量应用于临床心肌微循环诊断,其安全性已得到证实.研究显示超声靶向破坏微泡可以便骨骼肌毛细血管破坏和局部红细胞渗出,可以促进细胞穿过内皮生理屏障.目的:探讨超声辐射微泡是否可以增加骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的效果.设计、时间及地点:随机对照动物观察,于2006-10/2008-05在东南大学医学院完成.材料:2月龄中国家猪20只,随机分为超声微泡组12只,细胞对照组8只.超声微泡对比剂SonoVue,国药准字J20030117,为上海博莱信谊药业有限责任公司产品.方法:无菌条件下抽取猪骨髓液,密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞.两组动物均建立急性心肌梗死模型,造模后14 d,超声微泡组通过OTW球囊导管先把2.4 mL超声微泡对比剂SonoVue经冠状动脉注入左前降支中段,同时在体表给予1 MHz,2W/cm2超声辐射心肌梗死区,连续辐射90 S后,再注入超顺磁性氧化铁标记的骨髓间充质干细胞5×108个;细胞对照组同法仅单纯输注骨髓间充质干细胞.主要观察指标:采用64层螺旋CT检查心功能变化,光镜观察心肌组织学检测结果,电镜观察血管内皮细胞超微结构.结果:与移植前1 d比较,移植后6周两组左心室射血分数均明显增加,且超声微泡组增加幅度高于细胞对照组(P＜0.01).与细胞对照组比较,超声微泡组普鲁士蓝阳性细胞数明显增多(P＜0.01),且多数分布于心肌梗死周边区,有2例标本可见普鲁士蓝阳性细胞分化为新生血管内皮细胞;梗死周边区毛细血管密度明显升高(P＜0.05).两组心肌血管内皮细胞超微结构无差异,但移植后0 h超声微泡组可见血管内皮间隙增宽.结论:超声辐射微泡可促进梗死心肌内猪自体骨髓间充质干细胞的移植,促进心肌血管新生,从而改善因心肌梗死而受损的心功能.
作者：李金鹆；童嘉毅；冯毅；杨芳 刊期： 2009年第23期
背景:一系列研究发现,骨髓基质干细胞可在体外经人工诱导分化为神经元样细胞,有望用以移植治疗神经退行性疾病,但是其分化的分子机制尚不明了.目的:观察骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化前后基因表达谱的变化.设计、时间及地点:观察性实验,于2006-12/2007-12在苏州大学附属第二医院神经外科脑肿瘤研究室完成.材料;健康成年近交系Wistar大鼠,体质量约300 g.方法:体外培养和纯化大鼠骨髓基质干细胞,用碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对其进行诱导,分别于诱导前和诱导后第7天抽提RNA后利用Affymetrix基因芯片检测分析诱导前后差异基因表达谱,并有选择地对其中的一些重要基因进行实时定量PCR验证.主要观察指标:①骨髓基质干细胞的培养及诱导分化.②诱导分化后神经细胞的鉴定.③诱导分化前后基因芯片的检测.④基因芯片结果的分析.⑤实时定量PCR的验证.结果:骨髓基质干细胞经诱导后形态上呈神经元样细胞改变,免疫荧光证实β-TubulinIII染色后阳性率为(69.04±5.63)%.基因芯片共发现差异基因215条,其中上调基因125条,下调基因90条.明确与神经元发育密切相关的基因有13条,其中上调7条,下调6条.挑选重要的4条基因Bmp4、Robo2、Numb、Enc1进行实时定量PCR验证,其结果与基因芯片结果相符.结论:骨髓基质干细胞在体外诱导分化为神经元样细胞的相关基因表达谱中,有一些明确与神经元分化密切相关的基因存在差异表达,深入研究这些基因可能为基因工程改造骨髓基质干细胞奠定基础.
作者：张荣俊；贡志刚；闫西刚；兰青；黄强 刊期： 2009年第23期
背景:目前,国内外有关肌源性干细胞移植的研究主要集中在治疗肌营养不良性萎缩症方面,尚未见涉及将肌源性干细胞应用于失神经肌萎缩综合治疗的报道.目的:探讨大鼠肌源性干细胞移植对失神经腓肠肌萎缩进程的影响.设计、时间及地点:随机对照动物观察,于2007-02/2008-07在沈阳医学院完成.材料:成年健康雄性Wister大鼠19只,由沈阳医学院实验动物中心提供.方法:取3只大鼠,无菌条件下切取肱三头肌,体外分离培养肌源性干细胞,贴壁法纯化扩增.余16只大鼠均切断右后肢胫神经,建立失神经腓肠肌模型,分为2组:细胞移植组于已切断的胫神经支配的腓肠肌的内外侧注射经DAPI标记的肌源性干细胞悬液0.2 mL,模型对照组于相同位置注射等量生理盐水,培养4周.主要观察指标:采用计算机生物信号采集处理系统测定反映肌张力的腓肠肌阈强度恢复率和适强度恢复率变化,通过电子天平计算肌湿质量残存率,应用图像分析系统测定肌纤维横截面积残存率.结果:与模型对照组比较,细胞移植组失神经腓肠肌的阈强度恢复率、适强度恢复率均明显降低(P＜0.01,P＜0.05),肌湿质量残存率、肌纤维横截面积残存率均明显升高(P<0.01).结论:肌源性干细胞移植对大鼠失神经肌萎缩进程有较明显的延缓作用.
作者：张庭深；赵建文；苏秋香；牛犁 刊期： 2009年第23期
背景:对于神经干细胞的分离培养,目前多采用胰蛋白酶对组织细胞予以消化,但消化时间较难把握.目的:采用胰酶消化与机械分离法相结合的方式对昆明种小鼠胚胎脑神经干细胞进行分离、培养,并进行初步的免疫组织化学检测.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-10/2007-09在广西医科大学基础医学实验室完成.材料:孕14～16d的昆明种小鼠由广西医科大学实验动物中心提供.方法:分离昆明种小鼠胎鼠的脑组织,经胰酶消化加机械吹打后,在加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子的B27无血清DMEM/F12培养基中培养.主要观察指标:用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞.结果:培养24 h后,细胞以悬浮方式生长,聚集成团;48 h后形成由数十个细胞组成的细胞球,形态规则,体积大小不等,细胞无突起,形成典型的神经球,可传代扩增.免疫细胞化学染色结果示细胞巢蛋白呈阳性表达.结论:在含有表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的无血清B27培养基条件下,有利于小鼠胚胎神经干细胞的体外培养和传代增殖.
作者：宫晓洁；孙莉；黎靖宇；袁路；刘琦；陈维平 刊期： 2009年第23期
背景:目前仍没有合适的标记方法追踪观察兔骨髓间充质干细胞组织修复及基因治疗的效果.目的:观察重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达,及转染后干细胞活性的变化,以寻找稳定标记兔骨髓间充质干细胞的方法. 设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/05在南京市第一医院骨科干细胞实验室完成. 材料:健康2月龄纯种新西兰大白兔4只,由南京医科大学实验动物基地提供.重组腺病毒Ad5/F35-EGFP为北京本元正阳基因有限公司产品. 方法:用密度梯度离心法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,贴肇法纯化扩增.取传至第4代细胞,流式细胞仪检测细胞标志的表达,消化离心重悬后进行计数,平均分成5组,每组细胞数5.0×105个,接种于25 m2培养瓶,空白组加入50 μL的PBS液,剩余4组加入重组腺病毒Ad5/F35-EGFP进行转染,感染复数(MOI)分别为10,20,50,100,继续传代培养.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的生长状态及表面标志鉴定,转染后骨髓间充质干细胞增强型绿色荧光蛋白的表达及活性变化.结果:原代培养48 h后见细胞贴壁,8 d时细胞铺满瓶底80%以上,绝大多数呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,三四天即可传代,第4代细胞CD29和CD44呈阳性表达,CD34与CD45呈阴性表达.转染后24 h可见绿色荧光,7 d时荧光强,细胞转染率与感染复数值的呈线性增长关系,至49 d时仍可见绿色荧光.转染后0,7,14,28,49 d,感染复数=50组的骨髓间充质干细胞数量均与空白组基本相似(P均>0.05),即转染后细胞增殖能力无明显变化. 结论:重组腺病毒载体能高效标记骨髓间充质干细胞,感染复数为50时较为理想,增强型绿色荧光蛋白基因可持续表达49 d,且标记后不影响骨髓间充质干细胞的增殖活性.
作者：张全彬；王黎明；徐燕 刊期： 2009年第23期
背景:研究发现肝纤维化环境是骨髓间充质干细胞适宜的分化环境,提示通过骨髓间充质干细胞移植治疗肝纤维化成为可能.目的:探讨骨髓间充质干细胞不同移植时期及移植时间长短对大鼠肝纤维化进程的影响.设计、时间及地点:细胞学体内实验,于2007-11/2008 08在福建医科大学及福建省科研所完成.材料:普通级五六周龄雄性SD大鼠5只用于制备骨髓间充质干细胞;清洁级成年雌性SD大鼠68只,分别于造模10周、12周后处死,前者分为对照组、造模第6周细胞移植组2个亚组,12只/组;后者分为对照组、造模第6周细胞移植组、造模第8周细胞移植组3个亚组,动物数量分别为16只,16只,12只.方法:各组大鼠均通过腹腔注射四氯化碳建立肝纤维化模型.取体外分离培养的第4代骨髓间充质干细胞悬液0.2 mL(含5×106个细胞),分别于造模后第6,8周经尾静脉注入各细胞移植组大鼠体内,对照组同法注入L-DMEM培养基,各组于培养对应时间点处死.主要观察指标:大鼠一般情况及肝纤维化和炎症程度.结果:①造模10周后处死:与对照组比较,造模第6周细胞移植组肝纤维化评分均值明显降低(t=-2.45,P=-0.023),炎症程度方面无明显差异(t=-0.60,P=-0.554).②造模12周后处死:对照组、造模第8周细胞移植组的肝纤维化及炎症程度评分均值均基本相似(t=-0.21,P=0.84;t=-0.18,P=0.86),2组均明显高于造模第6周细胞移植组(t=-6.17,t=-8.61,P＜0.01).③造模10周后处死与造模12周后处死比较:随细胞移植时间的延长,造模第6周细胞移植组肝纤维化及炎症程度评分均值均明显降低(t=-6.98,t=-9.78,P＜0.01).结论:早期移植骨髓间充质干细胞可以减轻CCl4引起的肝脏炎症程度,同时改善大鼠的肝纤维化程度,此作用与移植时间成正相关.
作者：焦艳；江家骥 刊期： 2009年第23期
冠状动脉粥样硬化性心脏病可引起心肌细胞的不可逆性改变,干细胞移植治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病能改善心脏功能,但其机制尚不完全清楚,可能与心肌再生、血管新生、心脏结构重建和干细胞旁分泌等作用相关联.文章针对干细胞移植技术、生物学特点、移植途径等进行综述,并具体分析了干细胞移植成功的判断,干细胞改善心脏功能的机制以及干细胞移植的安全性等问题.
作者：谢杰睿 刊期： 2009年第23期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
