方军；李华壮；高克海；陈景春
背景:骨髓基质干细胞具有扩增迅速、分化潜能广泛等特点,因此建立骨髓基质干细胞的体外定向诱导模型有利于组织工程学研究.目的:探讨应用5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化的可能性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-06/2008-06在辽宁医学院附属第一医院中心实验室完成.材料:SD大鼠20只,由辽宁医学院实验动物中心提供.5-氮胞苷为Sigma公司产品.方法:大鼠麻醉后,分离股骨和胫骨,全骨髓法+贴壁法分离培养骨髓基质干细胞,待细胞生长融合至90%后传代扩增.取P3代骨髓基质干细胞,以2×10~4/孔密度接种于24孔培养板,分别加入5,10,15,20 μmol/L 5-氮胞苷诱导培养,同时设立不加诱导剂的空白对照,诱导24 h后更换为正常培养液继续培养至3周.主要观察指标:细胞形态及生长曲线,诱导后细胞形态变化,诱导后细胞连接蛋白43和α-横纹肌肌动蛋白的表达.结果:①培养的骨髓基质干细胞大多呈梭形,有时可见细胞融合,P3代细胞接种后第1,2天为静止生长期,从第3天开始进入对数生长期,第9天达高峰,以后进入平台期,第12天细胞数量开始减少.②5 μmol/L 5-氮胞苷诱导后,骨髓基质干细胞形态无明显变化;10 μmol/L 5-氮胞苷诱导后骨髓基质干细胞变长,宽大,并朝一个方向延伸,具有肌管形成细胞的形态特点;15 μmol/L 5-氮胞苷诱导后,24孔板周边区有少量细胞存活;20 μmol/L 5-氮胞苷诱导后细胞死亡.③经10 μmol/L5-氮胞苷诱导3周后.骨髓基质干细胞胞浆内可见连接蛋白43和α-横纹肌肌动蛋白的表达;空白对照组均呈阴性表达.结论:骨髓基质干细胞自身无法向心肌细胞方向转化,体外经5-氮胞苷诱导后具有向心肌细胞分化的潜能.5-氮胞苷浓度过低不能起到诱导分化作用,浓度过高则会造成细胞大量死亡,10 μmol/L为较适宜的诱导浓度.
作者：张凤香；李树青；孙大鹏；司忠义 刊期： 2009年第49期
目的:观察心肌梗死后在不同时间点经冠状动脉自体移植骨髓间充质干细胞后对心功能的影响,并初步探讨其机制.方法:30只健康太湖梅山猪(分为6组)建立心肌梗死模型,并分离培养自体骨髓间充质干细胞.3组(每组5只)分别在心肌梗死后3 h、2周及4周(分别简称为G1、G2、G4)经冠状动脉移植骨髓间充质干细胞.每组设立对照组(5只)在各对应时间点经冠状动脉注射DMEM培养基.在心肌梗死前,移植前及实验终点(心肌梗死8周)时对每只猪行MRI及心超检查以观察心功能的改变.在细胞移植前后不同时间点检测血清血管内皮生长因子值.实验终点时获取猪心,通过免疫组织化学检测移植细胞在心肌内定植及分化情况,并检测心肌血管密度.结果:G1组心功能与各对照组相比无显著性差异.G2、G4组与相应对照组相比,心功能指标有改善,且G4优于G2(P<0.05).G1及各对照组心肌梗死面积减小百分比绝对值差异无显著性意义,G4组较 G2组心肌梗死面积减小百分比绝对值大,差异有显著性意义(P<0.05).G2、G4组血清血管内皮生长因子水平上升明显,而G1及各对照组血清血管内皮生长因子水平无明显变化,G4组上升幅度较G2组高(P<0.05).G1及各对照组心肌切片免疫组织化学未见移植细胞定植及分化,G2、G4组心肌切片免疫组织化学显示有移植细胞定植及分化,且G4.较G2优(P<0.05).G1及各对照组心肌血管密度差异无显著性意义,心肌血管密度各实验组比较有显著性差异,G4组高于G1及G2组(P<0.05).结论:心肌梗死后不同时间点移植骨髓间充质干细胞对心功能影响效果有差异;急性期移植对心功能无明显影响,非急性期移植能改善心功能.心肌梗死后4周移植治疗效果较优.MRI可以显示梗死心肌的部位及范围,并可以反映心功能的变化.
作者：刘永浩；郭亮；陈剑华；郭世强；虞桂平；沈振亚 刊期： 2009年第49期
背景:碱性成纤维细胞生长因子对于创伤修复具有明显的促进作用,但局部应用难以持久地发挥作用.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞后的表达情况.设计、时间及地点:细胞基因学体外观察,于2009-03/08在云南大学生命科学院完成.材料:日本大耳白兔1只,购于昆明医学院动物科.pCDNA3.1质粒为美国Invitrogen产品.方法:抽取兔髂前上棘骨髓,采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,待细胞融合至培养瓶底80%时消化传代.参考GeneBank碱性成纤维细胞生长因子cDNA序列设计合成基因,电泳纯化后xhol I、BamH I双酶切回收凝胶,以限制性核酸内切酶对PcDNA Vector质粒进行酶切、电泳和凝胶回收,连接碱性成纤维细胞生长因子DNA与PcDNA Vector质粒,构建pCDNA-碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体,运用脂质体转染法将重组体转染至兔骨髓间充质干细胞中,并筛选稳定转染株.主要观察指标:骨髓间充质干细胞表面抗原的表达,Western blot法检测目的蛋白的表达.结果:流式细胞仪检测结果示所培养细胞表面抗原呈CD90,CD44阳性,CD45呈阴性;免疫组化检测结果示骨髓间充质干细胞血管源性细胞表面抗原CD34呈阴性,而相对特异性标记物CD44呈阳性.转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞提取的细胞裂解液中,在M_r 23 000处有一条明显阳性杂交带;而转染pCDNA3.1(-)空载体的骨髓间充质干细胞提取蛋白未见阳性条带.结论:实验成功地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞,该目的基因可稳定表达.
作者：王少云；吴迪；朱晓松；杨浩；赵宏斌；董坚；李世和 刊期： 2009年第49期
背景:不同来源饲养层条件下,人胚胎干细胞是否具有相同或相似的生物学特性尚不清楚,该问题的解决有利于建立标准化的饲养层体系.目的:观察比较人胚胎干细胞在人源和鼠源饲养层上的生长特性是否相同?设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-09,2009-02在中国科学院昆明动物所完成.材料:清洁级孕12.5～13.5 d的ICR小鼠2只,由昆明医学院动物中心提供.永生化人成纤维细胞由美国约翰霍普金斯大学医学院建系并赠送,人胚胎干细胞株BG02由中国科学院昆明动物所提供.方法:无菌条件下取ICR胎鼠,组织块胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,永生化人成纤维细胞按常规培养,两种细胞经γ射线处理后,以2.5×10~4/cm~3接种在明胶包被的6孔板中.取人胚胎干细胞,分别接种在小鼠胚胎成纤维细胞或永生化人成纤维细胞饲养层上,加入含β-巯基乙醇的DMEM/F12培养基,使用前添加碱性成纤维细胞生长因子.主要观察指标:两种饲养层上的人胚胎干细胞的形态、特异性标记表达、Oct-4阳性率、细胞倍增时间.结果:培养在小鼠胚胎成纤维细胞和永生化人成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞,其形态相似,呈圆形或椭圆形集落;均表达SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81和Sct-4,但不表达SSEA-1.与小鼠胚胎成纤维细胞饲养层比较,永生化人成纤维细胞饲养层上人胚胎干细胞Oct-4阳性细胞率明显升高(P<0.05),倍增时间明显延长(P<0.05).结论:人源和鼠源成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞体外培养生物学特性存在明显差异.
作者：胡智兴；周轶平；吴兰鸥；罗敏；郑存兰；李玛琳 刊期： 2009年第49期
背景:小鼠非黏附骨髓间充质干细胞在体外可以不断形成成纤维细胞集落形成单位,并且可诱导分化为脂肪细胞、成骨细咆和软骨细胞,表现出一定的多分化潜能.目的:探讨小鼠非黏附骨髓间充质干细胞移植到缺血损伤脑内后分化为神经细胞的能力.方法:取β-Gal转基因小鼠,分离双侧股骨、胫骨,全骨髓法分离总骨髓细胞,采用反复转移非黏附的骨髓细胞培养法收集纯化后的第5代非黏附骨髓间充质干细胞,调整细胞浓度为1×10~(12)L~(-1)备用.两组C57BL/6J小鼠均建立大脑中动脉阻塞模型,造模后7 d,细胞移植组将第5代非黏附骨髓间充质干细胞悬液3 μL定向移植到小鼠脑损伤处,模型组注射等量生理盐水.移植8周后观察供体细胞在缺血脑内微环境中的存活、分布及分化能力.结果与结论:LacZ组织化学染色发现,8周后供体细胞仍可以表达β-Gal蛋白,在缺血侧供体细胞能够存活.免疫组织化学单染和双染后发现,在缺血模型的坏死区及坏死边缘区均可检测到β-Gal阳性的供体细胞,部分细胞还同时表达神经细胞特异性蛋白NeuN及神经胶质细胞特异性标记GFAP.提示小鼠非黏附骨髓间充质干细胞在缺血动物模型的脑内能够存活、迁移,部分细胞还能分化为成熟的神经元样细胞或神经胶质细胞,参与脑损伤修复.
作者：吴玉新；王燕；贲晓明 刊期： 2009年第49期
背景:目前,冲击波疗法被广泛的用于治疗骨不连、骨折延迟愈合和股骨头坏死以及运动系统慢性劳损性疾病,取得了很好的疗效,但其作用机制并不明确.目的:观察体外冲击波作用于骨髓间充质干细胞后c-Fos、c-Jun蛋白表达的变化情况.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2007-03/2008-03在吉林大学基础医学院病理学国家重点实验室完成.材料:骨髓来源于健康志愿者.方法:体外培养人骨髓间充质干细胞,取P4代细胞,加入2.5 g/L胰蛋白酶消化制成细胞悬液,用无血清低糖DMEM培养基调整细胞密度在1.0×10~9L~(-1)的水平,然后取6 mL细胞悬液,分装入6个1.5 mL.的Eerrendorf管内,1管为对照组,5管为诱导组.将诱导组Eerrendorf管置入体外液电冲击波碎石机中,采用佳冲击波强度(工作电压8.5 kV,脉冲次数为120次)作用于细胞,分别在作用后5,15,30 min,1,2 h提取蛋白质.主要观察指标:倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞形态变化:四甲基偶氮唑盐法测定细胞生长曲线;Western Blot检测细胞内c-Fos、c-Jun蛋白表达的变化.结果:①骨髓间充质干细胞接种于培养板,细胞呈圆形,24 h后,细胞开始缓慢分裂、增殖,半量换液后见贴壁细胞形态 呈梭形.第3天后细胞增殖加快,呈团簇集落样生长.10～14 d各个细胞克隆增大,直至铺满培养板底面达到融合状态.传代培养的骨髓间充质干细胞呈圆形,24 h内完全贴壁,形态与原代培养的细胞类似,1周左右达到完全融合,呈漩涡状排列.传至10代以后,细胞分裂增殖速度明显减慢,细胞逐渐老化.②四甲基偶氮唑盐结果显示:原代及P2、P3代的人骨髓间充质干细胞生长曲线呈S型,在第3-5天为增殖旺盛期.⑨体外冲击波诱导后,人骨髓间充质干细胞中c-Fos、c-Jun的磷酸化水平开始增高,分别于30,15 min后达高峰,分别为对照组的2.56倍,1.68倍(P<0.01),之后逐渐下降;c-Fos、c-Jun的总量未见明显变化(P>0.05).结论:体外冲击波作用于体外培养的人骨髓间充质干细胞后,呈现了细胞内c-Fos、c-Jun蛋白活性增高的变化.
作者：罗杨；刘一；于铁成；张科强 刊期： 2009年第49期
背景:间充质干细胞的增殖分化缺乏可调控性,结合适当载体后不能高效增殖分化是阻碍其进入临床的瓶颈.脉冲电磁场若能有效调控干细胞向骨源细胞分化将具有重要的临床价值.目的:观察脉冲电磁场刺激后,小鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化情况.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2004-0512007-10在华中科技大学同济医学院附属普爱医院骨科实验室完成.材料:BALB/C小鼠20只,由同济医学院实验动物中心提供.脉冲电磁场发生器由海军工程大学电机系设计与制造.方法:无菌分离小鼠双侧股骨,Percoll密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,再用贴壁筛选法纯化扩增.取生长良好的第3代细胞,调整细胞密度为2×10~7L~(-1)接种于6孔板,分成4组:空白对照组加入完全培养基组;脉冲电磁场组给予50 Hz、正弦波形、强度1 mT的脉冲电磁场辐射,2次/d,30 min/次,间隔12 h,共10 d;成骨诱导组加入含地塞米松、甘油磷酸钠、VitC的完全诱导培养基;脉冲电磁场+成骨诱导组给予相同的脉冲电磁场辐射后加入完全诱导培养基.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的分化情况.结果:碱性磷酸酶染色结果显示,干预10 d后,空白对照组为阴性;脉冲电磁场组呈弱阳性:成骨诱导组呈阳性;脉冲电磁场+成骨诱导组呈强阳性.与空白对照组比较,成骨诱导组、脉冲电磁场+成骨诱导组I型胶原免疫组化染色吸光度值均明显升高(P<0.05,P<0.01).结论:50 Hz、正弦波形、强度1 mT脉冲电磁场干预一定时间后,能够增强小鼠骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶及I型胶原的表达,促进其分化成骨.
作者：方真华；陈明；谢鸣；郑琼；勘武生 刊期： 2009年第49期
背景:间充质干细胞的增殖和分化与富血小板血浆中的血小板浓度密切相关,浓集倍数过小可能达不到应有效应,太大则对骨再生产生抑制作用.目的:观察不同体积分数的富血小板血浆对犬骨髓间充质干细胞增殖的影响.设计:细胞学体外观察.材料:健康12月龄雄性比格犬,由中南大学湘雅医学院实验动物部提供.方法:取生长良好的第5代犬骨髓间充质干细胞,调整细胞浓度至3×10~8L~(-1),以200μL/孔接种于96孔板,常规培养24 h后,弃原培养液及未贴附的细胞.取制备好的富血小板血浆凝胶,加入含青霉素、链霉素的无血清低糖DMEM培养基分别稀释成5%,6.25%,7.5%,8.75%,10%共5个体积分数,向上述96孔板中每孔加入200μL,放入培养箱内,并设立空白对照.主要观察指标:MTT法观察不同体积分数富血小板血浆对犬骨髓间充质干细胞增殖活性的影响.结果:与空白对照组比较,干预早期各体积分数的富血小板血浆组均可促进犬骨髓间充质干细胞增殖.随干预时间的延长,体积分数为8.75%,10%富血小板血浆组在第6天增殖速度开始呈缓慢上升,进入平台期;体积分数为5%,6.25%富血小板血浆组细胞数量呈快速增殖,尤以体积分数为6.25%富血小板血浆组为甚.结论:富血小板血浆可在干预早期显著促进犬骨髓间充质干细胞增殖,其增殖强度与富血小板血浆体积分数相关,低体积分数条件下普遍取得较佳的增殖效应.
作者：钟达；廖前德；卢吉平；尹科；周星；严安；翁晓军 刊期： 2009年第49期
背景:胶质细胞源性神经营养因子与内皮素B受体基因的缺失将导致肠神经系统发育异常.神经干细胞移植不仅可以从解剖和功能上修复神经系统,还可以作为基因转染的载体.目的:拟将携带胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因的重组腺病毒转染至小鼠神经干细胞,并观察目的基因的表达.设计:细胞-基因学观察.材料:新生昆明小鼠由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供.jetPEI转染试剂为PolyPlus公司产品;携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子、内皮素B受体基因共表达腺病毒由本室孙念峰博士和张景辉博士构建并惠赠.方法:无菌条件下取新生小鼠脑组织,制备单细胞悬液.取携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因共表达腺病毒,溶解于NaCI中制备JetPEI/DNA复合体.用DMEM/F12完全培养基调整次代神经干细胞密度为5×10~8L~(-1),向24孔板中每孔加入400 μL细胞悬液、100 μL、JetPEI/DNA复合体,置37℃、体积分数为5%的CO_2培养箱中,分别于转染24,48,72 h后收集神经干细胞.主要观察指标:采用荧光显微镜、流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR检测目的基因在神经干细胞内的表达.结果:转染24 h后即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达,转染24,48,72 h后绿色荧光蛋白阳性率分别为15.36%,24.67%,25.73%.各转染时间点神经干细胞均表达胶质细胞源性神经营养因子及内皮素B受体基因,转染24 h条带亮度较低,72 h时外源基因表达水平高.结论:运用jetPEI试剂成功将目的基因转染至小鼠神经干细胞内,且胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因在靶细胞中得到有效转录和表达.
作者：陈景波；王国斌；孙念峰；陶凯雄；舒晓刚；张景辉 刊期： 2009年第49期
背景:人骨髓内间充质干细胞含量稀少,且随着年龄增加或体质衰弱细胞数量会逐渐减少,因此进行大量扩增非常必要,但目前关于扩增后各代骨髓间充质干细胞的生物学特性是否相同仍无准确定论.目的:分析比较不同传代人骨髓间充质干细胞的生物学特性,着眼于推荐其应用于临床组织工程的实际需求.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/10在北京中医药大学附属东直门医院骨科和中心实验室完成.材料:骨髓间充质干细胞来源于非造血系统疾病的患者骨髓,由北京中医药大学附属东直门医院骨科提供.方法:从患者髂后上棘抽取骨髓,Percoll法分离培养骨髓间充质干细胞.当细胞融合至90%以上时胰酶消化传代,定期在倒置显微镜下观察各代细胞形态变化,取第2代细胞用于指标检测.主要观察指标:细胞形态及免疫表型,MTT检测细胞活性,流式细胞仪分析细胞分裂及凋亡坏死比例.结果:传代培养的骨髓间充质干细胞形态均一,呈梭形、纺锤形,克隆样生长,培养至9代后生长减慢,并出现胞浆空泡化、胞体变大等老化现象.第2代细胞表面标志CD44,CD106,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45则呈阴性.骨髓间充质干细胞增殖到第9代MTT值达到高,从第10代开始MTT值下降.细胞增殖到1 1代,分裂期细胞数量仍呈上升趋势,但从第6代开始凋亡细胞数量明显增加,第8代以后凋亡细胞数量达到60%以上.结论:通过对各代骨髓间充质干细胞生物学特性分析,推荐使用第3～6代骨髓间充质干细胞用于临床治疗使用.
作者：胡炜；俞兴；朱陵群；徐林；王硕仁 刊期： 2009年第49期
背景:相对于成体干细胞和胚胎干细胞自身存在的问题,羊水来源的干细胞系的建立,能为每一个个体建立一份自身的、具有高度增殖分化能力的干细胞储备,有望成为神经性退行性疾病细胞治疗的理想细胞来源.目的:观察Noggin和碱性成纤维细胞生长因子对人羊水来源干细胞向神经细胞分化的影响.方法:羊水标本来自怀孕16-22周行产前诊断的孕妇,在超声引导下行羊膜腔穿刺取得.利用CD117抗体,选用免疫磁珠法从人孕中期羊水标本中分离获得羊水干细胞,培养扩增后,通过流式细胞仪检测表面抗原表达进行鉴定.选取生长状态良好的第3代羊水干细胞,利用无血清的神经诱导培养液诱导其向神经细胞分化,分为空白对照组、基础诱导液组、Noggin诱导组和碱性成纤维细胞生长因子诱导组.倒置相差显微镜观察诱导后细胞形态的变化,细胞免疫荧光检测巢蛋白、β-Ⅲtubulin和神经丝蛋白在诱导后细胞中的表达.结果与结论:利用免疫磁珠方法分离出的羊水干细胞呈CD44和HLA-ABC表达阳性,CD45和HLA-DR表达阴性.诱导2周后,碱性成纤维细胞生长因子诱导组光镜下细胞形态发生显著变化,免疫荧光染色巢蛋白、β-Ⅲ tubulin和神经丝蛋白表达阳性率较高.Noggin诱导组细胞形态和染色结果与基础诱导液组无显著性差异.提示利用羊水来源的干细胞诱导分化为神经细胞的过程中碱性成纤维细胞生长因子的作用远优于Noggin.
作者：张胜利；陈柏松；吴齐全；马晓荣；高同斌；陈方；周君梅 刊期： 2009年第49期
背景:CD58是一种糖蛋白,属于免疫蛋白超家族成员,广泛表达于人体各种免疫细胞和红细胞,是红细胞调控T细胞免疫功能的重要天然免疫物质基础.目的:通过在神阙、关元等传统保健穴上施灸,观察对健康人群红细胞CD58表达的影响.设计、时间及地点:前后对照、调查分析.于2008-03/12在山西中医学院实验中心完成.对象:选择山西中医学院在校健康大学生40例,男女各20例,平均年龄21.08岁.受试者均知情同意.方法:将以熟地、山药、山茱萸等为主方的药物制成药饼置于受试者神阙、关元、足三里、脾俞、肾俞等穴施灸,隔日1次,共灸10次,进行施灸前后的对比.主要观察指标:在施灸前、后分别进行血细胞的常规检查,流式细胞仪测定红细胞表面CD58分子的阳性百分率和平均荧光强度.结果:施灸后红细胞、白细胞数量较施灸前显著升高(均为P<0.01);与施灸前相比,红细胞CD58分子的阳性百分率和平均荧光强度均明显高于施灸前(均为P<0.01).其中,红细胞CD58荧光强度的变化尤为突出.结论:红细胞CD58分子数量表达与艾灸密切相关,隔药饼灸增强了机体的免疫调节功能.
作者：李雷勇；田岳凤；王格洪；王军；张斌仁；王旭；孟颖霞 刊期： 2009年第49期
背景:移植物抗宿主病是导致异基因外周血造血干细胞移植失败的主要原因,口服耐受是研究治疗移植物抗宿主病的新模式.目的:探讨骨髓移植前供鼠经口服受鼠脾淋巴细胞诱导耐受是否能增加异基因骨髓移植后受鼠对供者移植物的免疫耐受,从而减轻移植物抗宿主病,并与目前常用于预防移植物抗宿主病的免疫抑制药物比较作用效果.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-12在东南大学医学院中心实验室完成.材料:供鼠为雄性纯种近交系小鼠C57BL/6J(H-2~b),受鼠为雌性纯种近交系小鼠BALB/c(H-2~b).方法:用主要组织相容性抗原完全不合的纯种近交系小鼠建立异基因骨髓移植,移植物抗宿主病动物模型,小鼠共分5组,分别给予不同的急性移植物抗宿主病预防方案:①口服耐受组:移植前口服受鼠脾淋巴细胞相当于10 μg蛋白,隔天1次,共3次.②雷帕霉素组:1.5 mg/(kg·d)灌胃,从移植后第1天(+1 d)开始用药.③环孢索Al+甲氨蝶呤组:环孢素A 1.5 mg/(kg·d)腹腔注射,从移植后+1 d开始用药,当小鼠的胃肠功能逐渐恢复后,改为环孢素A 5 mg/(kg·d)灌胃,甲氨蝶呤0.4 mg/(kg·d)腹腔注射,移植后+1,+3,+6,+11 d用药.④空白对照组:移植后未用药.⑤辐照不移植组:照射后未予骨髓移植.主要观察指标:各组小鼠骨髓移植后移植物抗宿主病的出现情况及免疫耐受指标差异.结果:移植后小鼠出现典型的移植物抗宿主病症状,空白对照组小鼠死亡高峰在移植后第14-18天,死亡率接近100%.口服耐受组、雷帕霉素组和环孢素A+甲氨蝶呤组小鼠急性移植物抗宿主病症状明显减轻,平均生存时间较空白对照组显著延长(P<0.05);小鼠急性移植物抗宿主病病理表现减轻,口服耐受组病理变化少于其他各组;流式细胞仪监测CD4~+/CD8~+比值增加,CD4~+CD25~+细胞增加,口服耐受组增加明显;ELISA检测移植物抗宿主病产生相应细胞因子减低,且口服耐受组明显减轻.MTT结果显示,口服耐受组免疫耐受显著增强,淋巴细胞增殖明显降低.结论:口服耐受可以显著抑制体外T淋巴细胞增殖效应,增强小鼠对骨髓移植的免疫耐受,减轻移植物抗宿主病症状和病理损害程度,延长平均生存时间;与目前常用于预防移植物抗宿主病的免疫抑制药物比较,减轻移植物抗宿主病的作用更强.
作者：赵刚；陈宝安；丁家华；顾炎；王珏琼；邓晓静；吴亚男 刊期： 2009年第49期
背景:肝细胞自身增殖能力有限,近几年关于各类干细胞向肝细胞分化的成功报道很多,包括胚胎干细胞、骨髓细胞、胰腺干细胞、神经干细胞及各种来源的间充质干细胞等.目的:探讨应用多种生长分化因子体外联合诱导人脐血间充质干细胞向肝样细胞分化的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-10/2006-04在暨南大学医学院血液病研究所完成.材料:胎儿脐带血来源于顺产及剖腹产的健康孕妇,由暨南大学第一附属医院产科提供,产妇均签署知情同意书.方法:体外分离培养人脐血间充质干细胞,胰酶-EDTA消化传代.取传至第3代细胞,按5×10~4/cm~2接种,48 h后去除原培养基,PBS洗涤后,第1阶段用含地塞米松、肝细胞生长因子、表皮生长因子、ITS的F12培养基诱导2周,第2阶段用含地塞米松、肝细胞生长因子、致瘤素M、ITS的F12培养基继续诱导2周.主要观察指标:流式细胞仪检测脐血间充质干细胞表面标志的表达,RT-PCR检测肝细胞相关基因的表达,免疫荧光染色检测肝细胞相关蛋白的表达,透射电镜观察细胞超微结构.结果:培养的细胞不表达造血细胞系标志CD34,CD45,CDl4;亦不表达CD54,CD49f,HLA-DR;部分表达内皮细胞标志CD106;强表达CD29,CD44及CDl3.诱导4周后,甲胎蛋白、白蛋白、ck-18及tat基因均呈阳性表达;免疫荧光染色显示细胞浆中甲胎蛋白、白蛋白、ck-18均呈阳性;细胞胞浆中出现脂滴及糖原的沉积,细胞表面有微绒毛,出现双核细胞,初步具备了肝细胞的超微结构特征.结论:联合应用地塞米松、肝细胞生长因子、表皮生长因子、致瘤素M及ITS等多种生长分化因子,可在体外成功诱导人脐血间充质干细胞向肝样细胞分化.
作者：迟作华；张洹；陆琰 刊期： 2009年第49期
目的:观察人脐带间充质干细胞体外长期培养的生物学特性,探讨其向肝样细胞分化的可能性.方法:脐带来源于天津市第三中心医院住院的健康足月产妇,采用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,待细胞生长至80%-90%融合时传代.取传至第9代细胞接种于12孔板内,调整细胞浓度为5×10~(10)L~(-1),加入含肝细胞生长因子、成纤维生长因子4、抑瘤素的DMEM培养基,诱导28 d.MTT法测定细胞生长活性,流式细胞仪检测细胞周期,免疫细胞化学及流式细胞仪鉴定细胞表型;免疫细胞化学染色鉴定诱导后肝细胞特异表面标志物的表达,以及糖原染色结果.结果:从人脐带中分离得到的间充质干细胞贴壁生长,形态类似于成纤维细胞,80%以上处于G_0/G_1期,具有良好的生长活性,可在体外稳定传代20次以上;CD29,CD90,CD105,Vimentin呈阳性表达,基本不表达造血细胞标志CD34和内皮细胞标志CD31.随诱导时间的延长,圆形细胞逐渐增多,形态似肝细胞;诱导1周时细胞开始表达肝细胞表面标志物甲胎蛋白、细胞胶蛋白18、细胞胶蛋白19;诱导3周时开始表达成熟肝细胞标志白蛋白;诱导4周时白蛋白表达增强,且诱导细胞糖原染色呈阳性.结论:从人脐带中可成功分离出间充质干细胞,实现体外长期培养,并可诱导分化为肝样细胞.
作者：朱争艳；阎俊卿；韩涛；杜智；骆莹；王鹏；高英堂；刘彤 刊期： 2009年第49期
背景:目前细胞移植治疗缺血性心脏病的大部分临床试验是针对急性心肌梗死患者梗死相关冠状动脉再通后骨髓单个核细胞的移植,结合外科手术同期予以细胞移植治疗陈旧性心肌梗死的报道相对较少.目的:探讨冠状动脉旁路移植术中骨髓单个核细胞经桥血管进行移植的可行性及安全性.设计:自身前后对照,病例分析.对象:2004-11/2005-06阜外心血管病医院收治的冠状动脉旁路移植手术患者10例,既往有陈旧性心肌梗死,需要进行冠状动脉旁路移植,术前左心室射血分数低于40%.方法:患者进行手术的同时,抽取自体骨髓血,采用Ficoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞.在桥血管远端吻合口完成后,将骨髓单个核细胞悬液10 mL注射到前降支,其他桥血管经近心端将骨髓单个核细胞悬液10 mL分别注射到回旋支和右冠状动脉内.主要观察指标:术后通过心脏超声、磁共振评价心功能.结果:10例患者术后均恢复顺利,术中采集骨髓血45～60 mL,分离骨髓单个核细胞数量平均为4.1×10~7个,锥虫蓝排斥试验测定细胞活性>95%.心脏超声检查结果显示,与术前比较,术后1周及1,3个月患者左心室射血分数明显提高;术后心肌酶、肌钙蛋白T未见异常增高,心电图未发现围手术期心肌梗死改变.磁共振扫描结果显示,与术前比较,术后3个月左心室射血分数明显增加(P<0.01);左室舒张末期直径、左室收缩末期直径均明显缩小(P<0.05).手术过程中及术后均未见与骨髓血采集以及细胞经冠状动脉桥血管内移植的相关并发症发生.结论:作为一种辅助性治疗手段,骨髓单个核细胞通过桥血管进行心肌内移植是安全可行的.
作者：何庚戌；张浩；要彤；胡盛寿；张晓玲；魏英杰 刊期： 2009年第49期
背景:间充质干细胞的生物学特性及影响分化调控因子的研究认为,体外原代培养的间充质干细胞自然分化为肝细胞的比例较低,选择一种合适的诱导剂提高其分化为肝细胞的比例尤为必要.目的:以肝细胞生长因子、表皮生长因子及成纤维生长因子体外联合,验证其诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-08在潍坊医学院实验中心完成.材料:Sprague-Dawley大鼠40只,由潍坊医学院实验动物中心提供.方法:采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,取传至第3代细胞,设立2组:空白对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基;联合诱导组在此基础上,另加入10 μg/L成纤维生长因子、8 pg/L.肝细胞生长因子、8 μg/L表皮生长因子.主要观察指标:倒置显微镜观察诱导后细胞形态变化,免疫荧光染色观察甲胎蛋白及白蛋白的表达,PAS检测糖原的表达,靛青绿摄入情况,酶学检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的水平.结果:联合诱导组细胞呈多角形、卵圆形或圆形细胞的特征性改变,空白对照组骨髓间充质干细胞仍保持梭形或纺锤形.联合诱导组培养14 d可见白蛋白和甲胎蛋白免疫反应阳性细胞:诱导7 d时偶见PAS阳性细胞与靛青绿阳性细胞,随诱导时间延长,阳性细胞逐渐增多;诱导14 d时开始检测到谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的合成,21 d达高峰,之后下降.上述各指标空白对照组细胞均呈阴性.结论:成纤维生长因子、肝细胞生长因子与表皮生长因子体外联合应用,能够成功诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化.
作者：吴金生；朱建祥；蒋吉英；王晓萃；丁洁；于树娜；魏德全；王宝松 刊期： 2009年第49期
背景:近年来,部分学者证明骨髓基质细胞移植可促进轴突再生,改善脊髓损伤引起的运动功能障碍,但目前关于移植骨髓基质细胞如何促进轴突再生,移植细胞与再生轴突的关系尚不清楚.目的:通过免疫荧光组织化学和免疫电镜的方法,探讨移植骨髓基质细胞促进脊髓全横断损伤区轴突再生的机制.设计、时间及地点:随机对照动物实验,细胞学体内观察,于2006-03/2007-06在新加坡国立大学解剖系完成.材料:清洁级Wistar新生大鼠1只,用于骨髓基质细胞培养.清洁级成年雌性Wistar大鼠36只,无菌条件下显露、切断脊髓T_(10),制备脊髓全横断损伤模型.方法:通过传代法培养、纯化骨髓基质细胞.36只成年Wistar雌性大鼠随机投币法分为移植组和对照组,每组18只.移植组大鼠脊髓全横断损伤9 d后以1×10~(11)L~(-1)的密度移植骨髓基质细胞,缺损区5μL,损伤区上、下1 mm处各2.5 μL,对照组动物在相同部位注射等量DMEM完全培养基,注射速度1 μL/min.主要观察指标:①移植骨髓基质细胞存活、分化情况.②轴突再生情况.③移植组和对照组宿主自身的nestin、NF200、GFAP和CNP阳性细胞在脊髓损伤区存活情况.④内源性CNP阳性细胞和再生纤维关系.结果:骨髓基质细胞移植2周时,脊髓损伤区可见大量CFDA-SE标记的移植细胞,随时间延长,存活的移植细胞数目逐渐降低,考虑脊髓损伤区内大量的0×42阳性吞噬细胞,激活小胶质细胞及空洞可能影响移植细胞的存活.虽然骨髓基质细胞数目逐渐降低,骨髓基质细胞移植可促进损伤区轴突的再生,而且还可促进宿主自身的nestin、NF200、GFAP和CNP阳性细胞在脊髓损伤区存活.宿主自身CNP和许旺细胞促进损伤轴突的再生和髓鞘形成.结论:移植骨髓基质细胞移植可促进宿主自身CNP和许旺细胞在脊髓损伤区存活,后者具有促进损伤轴突再生和髓鞘形成的作用.
作者：丁鹏；薛黎萍；宋晓斌；李玉；龙江；王伟民；杨智勇；王进昆；林荣安 刊期： 2009年第49期
背景:以骨髓间充质干细胞作为种子细胞,把干细胞和基因治疗结合起来是研究中枢神经系统损伤和肿瘤治疗新的思路和趋势.目的:观察腺病毒载体绿色荧光蛋白基因(Ad-GFP)在兔骨髓问充质干细胞转染和表达的量效关系及对细胞生物学特性的影响,探讨用该载体构建基因修饰骨髓间充质干细胞的可行性.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-08/2009-03在南方医科大学完成.材料:新西兰大白兔,雌雄不拘,质量2.0-3.0 kg.方法:体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞免疫表型,293细胞包装制备病毒,以不同滴度的Ad.GFP(1×10~3～1×10~(10)PFU/mL)转染骨髓间充质干细胞,细胞计数法分析转染率.主要观察指标:倒置显微镜观察细胞形态学改变,CCK8法检测细胞增殖活性,用血清撤离加入β-巯基乙醇诱导感染Ad-GFPBMSCs向神经样细胞的定向分化.结果:3-6代骨髓间充质干细胞表面标志CD34、CD45阴性,而CD29、CD44阳性.当病毒滴度为1×10~7PFU/mL时感染率为55%,1×10~9,1 ×10~(10)PFU/mL感染率均为85%,但1×10~(10)PFU/mL时出现细胞病理现象,7 d荧光表达强,28 d仍可见荧光表达.感染Ad-GFP的骨髓间充质干细胞经β-巯基乙醇诱导可分化为神经元样细胞,神经元特异性烯醇化酶表达阳性.结论:合适滴度的Ad-GFP可以高效感染骨髓间充质干细胞,对细胞的生物学特性影响较小,不影响诱导分化功能,骨髓间充质干细胞可以作为Ad-GFP载体系统进行基因治疗研究的种子细胞.
作者：黄锐；王宇；李坤；梅继文；姜晓丹 刊期： 2009年第49期
背景:组织工程技术的发展给修复关节软骨缺损带来了希望,近的比较研究证实骨髓间充质干细胞是修复全层软骨缺损的佳细胞源.目的:在体外团状培养系统中,以Ad-hTGF-β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向分化,并对分化后的细胞进行鉴定.设计、时间及地点:以细胞为对象的重复观察测量实验,于2007-06/2008-01在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成.材料:2月龄日本大耳白兔由解放军第三军医大学实验动物中心提供.方法:兔骨髓间充质干细胞体外分离培养扩增,Ad-hTGF-β1转染后,在团状培养系统中培养.通过组织学、免疫组化及反转录-聚合酶链反应方法检测其成软骨分化.主要观察指标:组织学染色观察细胞形态改变,免疫组化方法及反转录-聚合酶链反应检测蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达.结果:组织学染色显示,诱导后细胞呈软骨细胞样形态.免疫组化方法及反转录-聚合酶链反应结果显示,诱导后的细胞表达蛋白多糖和Ⅱ型胶原.结论:骨髓间充质干细胞经Ad-hTGF-β1诱导后在团状培养系统中可分化为软骨细胞.
作者：方军；李华壮；高克海；陈景春 刊期： 2009年第49期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
