范新兰；孟春玲；麦友刚；徐令
目的:血小板源性生长因子对诱发视网膜色素上皮细胞移行、终导致增生性玻璃体视网膜病变起到了重要作用.构建人血小板源性生长因子A具有发夹结构小干扰RNA(shRNA)表达质粒,以观察其对人血小板源性生长因子A基因表达的沉默效果.方法:实验于2007-04/2007-07在吉林大学第一临床医院传染科研究室完成.根据血小板源性生长因子A基因mRNA序列,设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列,克隆到空载体pGPU6/GFP/Neo中,构建重组质粒,同时设计构建分别针对人GAPDH干扰质粒作为阳性对照,不针对任何特异基因的质粒作为阴性对照.通过酶切鉴定和测序验证阳性克隆.结果:经重组质粒筛选,重组质粒测序鉴定与设计的shRNA转录模板序列相同,均证实重组质粒构建成功.结论:利用RNA干扰技术路线可成功构建靶向人血小板源性生长因子A的发夹结构小干扰RNA表达载体.
作者：孙蕾；吴雅臻；于雷；冯相伟 刊期： 2007年第46期
目的:骨髓间充质干细胞可以分化成神经细胞替代受损组织,并可分泌生长因子和营养因子来促进其体内细胞的存活和分化.实验将体外扩增和Hoechst33342标记的骨髓间充质干细胞移植入缺血性大鼠侧脑室内,观察干细胞在大鼠脑内的生存、迁移、分化情况及对神经功能恢复的影响.方法:实验于2004-12/2007-06在南京大学医学院附属鼓楼医院科研部完成.①取体质量120～160 g的SD大鼠用于制备移植细胞;另取80只体质量250～300 g的SD大鼠用于制作大脑中动脉闭塞模型.实验方法符合动物伦理学要求.②应用直接贴壁法分离纯化及扩增大鼠骨髓间充质干细胞,荧光染料Hoechst33342标记.③将造模成功的75只大脑中动脉闭塞大鼠按随机数字表法分为3组:模型对照组15只;磷酸缓冲液组30只;骨髓间充质干细胞移植组30只,将骨髓间充质干细胞立体定向移植到大鼠缺血侧脑室中.④术后1,3,6,12,24 d测定大鼠神经功能损害评分,荧光显微镜下观察Hoechst33342标记的骨髓间充质干细胞在脑内的生存和迁移情况,采用免疫荧光法检测胶质原纤维酸性蛋白和微管相关蛋白2的表达.结果:①细胞移植后6 d,12 d骨髓间充质干细胞移植组大鼠的神经功能评分均显著低于磷酸缓冲液组(P＜0.05).②移植的骨髓间充质干细胞可在大鼠脑组织中存活,并向缺血区域迁移.③移植第24天Hoechst33342/微管相关蛋白2、Hoechst33342/胶质原纤维酸性蛋白双阳性细胞占Hoechst33342阳性细胞的百分率为(10.45±1.35)%,(8.73±1.38)%.结论:骨髓间充质干细胞可以在动脉闭塞局灶性脑缺血模型大鼠脑中存活,并向缺血区域附近迁移,在一定条件下可分化为神经元和星形胶质细胞,同时能促进局灶性脑缺血大鼠的神经功能恢复.
作者：朱文静；刘卓；杨振军；徐运 刊期： 2007年第46期
目的:观察腺病毒pAdEasy系统携带绿色荧光蛋白对骨髓间充质干细胞的标记效率及标记对骨髓间充质干细胞生长的影响,为进一步追踪研究骨髓间充质干细胞奠定基础.方法:实验于2006-11/2007-03在四川大学华西组织胚胎学与神经生物学实验室完成.①实验材料:成年雄性SD大鼠,体质量100～120 g,由四川大学实验动物中心提供.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增,应用免疫细胞化学方法对培养的骨髓间充质干细胞进行鉴定.将生长到约80%融合的第3代骨髓间充质干细胞随机分为绿色荧光蛋白标记组和对照组.绿色荧光蛋白标记组加入1:100稀释的腺病毒(pAdEasy-1-pAdTrack-CMV)上清液,对照组加入磷酸盐缓冲液.③实验评估:观察绿色荧光蛋白标记对骨髓间充质干细胞生长曲线的影响.结果:体外培养的原代骨髓间充质干细胞24 h内可见有少量贴壁细胞,8～10 d左右达到70%～80%汇合.免疫细胞化学检测第3代骨髓间充质干细胞显示,CD44和CD90表达阳性,而CD14和CD34表达阴性.生长曲线表明,绿色荧光蛋白标记对骨髓间充质干细胞增殖无明显影响.结论:腺病毒pAdEasy系统携带绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞效率高,标记后对细胞的生长无明显影响.
作者：杨朝鲜；周玲；马芳；夏庆杰；陈清英 刊期： 2007年第46期
目的:肝癌组织中可能存在具有表型和功能特殊的肝癌细胞,分离和鉴定这群细胞是否具有干细胞特征对阐明肝癌发病机制、揭示肝癌复发和转移具有重要的意义.寻求分离MHCC97肿瘤干细胞的有效方法,探讨角蛋白(CK-19)在不同肝癌细胞亚群中的表达差异.方法:实验于2006-11/2007-05在解放军第四军医大学免疫实验室和肝胆外科实验室完成.细胞来源:MHCC97肝癌细胞(人高转移肝癌细胞系)由上海复旦大学中山医院肝癌研究所提供.实验方法:MHCC97细胞常规消化,HBSS洗涤,制备成单细胞悬液,细胞密度为1×109 L-1.每份取1×106个细胞,参考Rho123对线粒体膜电位测定的0.1 mg/L质量浓度,分别做0.1 mg/L和0.05 mg/L两个质量浓度细胞梯度染色,对照组加入维拉帕米(终浓度50 mmol/L),以未加Rho123作为阴性对照.实验评估:采用免疫细胞化学方法观察细胞角蛋白19在0.05 mg/L Rho123细胞及0.1 mg/L Rho123两组中的表达和含量.结果:单纯加入Rho123组有一低荧光拖尾,而维拉帕米拮抗组无此区域,即0.05 mg/L Rho123细胞占总数的2.1%,其余为0.1 mg/L Rho123组细胞.两组细胞内均有细胞角蛋白19阳性表达,阳性反应为显示位于细胞质的棕黄色颗粒,两组比较有统计学差异(P＜0.05)结论:细胞角蛋白19在肝癌细胞亚群中表达有差异,强阳性多数分布在0.05 mg/L Rho123组中,Rho123结合流式细胞分选术可以有效地分选出癌细胞中的肿瘤干细胞.
作者：曹云新；千年松；杨安钢；胡金涛 刊期： 2007年第46期
目的:抑瘤素是一种肝细胞促分化因子,能够诱导胚胎肝细胞分化为具有各种代谢功能的成熟肝脏.构建以抑瘤素为主的肝干细胞体外诱导微环境,观察其诱导大鼠肝脏来源的干细胞WB-F344体外分化.方法:实验于2002-10/2004-07在解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所完成.①实验材料:表达抑瘤素的CHO-OSM-EGFP细胞株由李晓利等构建.WB-F344细胞由姚鹏博士惠赠.②实验方法:将终浓度为20%稳定表达抑瘤素的中国仓鼠卵巢细胞上清中加入浓度为1 U/mL胰岛素、1×10-7mol/L地塞米松,与WB-F344细胞共培养.空白对照组中未加入诱导分化成分CHO-OSM-EGFP细胞上清、胰岛素、地塞米松.③实验评估:采用流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡,光学显微镜观察细胞形态,RT-PCR分析白蛋白及甲胎蛋白基因表达.结果:①诱导后的WB-F344细胞较空白对照组G2/M+S期细胞所占比例明显减低,增殖指数下降约2.8倍,G0/G1细胞所占比例明显增加.②实验组WB-F344细胞形态发生明显改变,由初的多角形变为长梭性,细胞伸出小管状伪足,核质比例下调,形态趋于成熟大鼠肝脏实质细胞.③RT-PCR结果显示,诱导后WB-F344细胞表达白蛋白,不表达甲胎蛋白.诱导前WB-F344细胞表达甲胎蛋白,不表达白蛋白.结论:在以抑瘤素为主的诱导微环境中,WB-F344细胞表现出生长抑制,形态及功能趋于成熟的大鼠肝细胞
作者：李晓利；王强；赵士富；崔春萍；姚鹏；尉承泽 刊期： 2007年第46期
目的:多发性骨髓瘤患者的长期生存率没有得到提高,因此进一步明确多发性骨髓瘤的发病机制并寻找理想的治疗方法是当前研究的重要课题.实验观察多发性骨髓瘤细胞对骨髓间充质干细胞成骨分化的潜能及对其表达核因子κB受体激活剂配体/骨保护蛋白的影响.方法:选择2006-07/2007-06在苏州大学附属第二医院住院的7例多发性骨髓瘤患者,患者经骨髓细胞学检查、血液生化测定及免疫球蛋白定量分析等符合多发性骨髓瘤诊断标准.正常成人骨髓由苏州大学附属第二医院血液科研究生捐献.患者对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准.实验方法:常规分离培养两种来源骨髓间充质干细胞,采用直接免疫荧光标记及流式细胞术分析其表面标志.观察两种来源骨髓间充质干细胞在成骨诱导培养条件下向成骨细胞分化的潜能,并在诱导培养的第1天和3周时分别加入RPMI 8266或XG7多发性骨髓瘤细胞株,于培养28 d后行Von-Kossa及TRAP染色;多发性骨髓瘤细胞与正常骨髓间充质干细胞共培养24 h后,应用RT-PCR法检测核因子κB受体激活剂配体/骨保护蛋白的表达.结果:①两种骨髓间充质干细胞形态无明显区别,表型特征相似,均可在成骨诱导培养后向成骨细胞分化.②Von-Kossa染色后提示来源于多发性骨髓瘤患者的骨髓间充质干细胞成骨分化潜能较差,矿化基质沉积较正常来源骨髓间充质干细胞少.两种骨髓间充质干细胞共培养第28天行Von-Kossa染色后,可见矿化基质沉积较不加入多发性骨髓瘤细胞株组明显减少(P＜0.001),TRAP染色未发现破骨样细胞的存在.③RT-PCR结果显示,正常骨髓间充质干细胞不表达核因子κB受体激活剂配体,但表达骨保护蛋白,与骨髓瘤细胞共培养后,8226或XG7细胞可明显上调骨髓间充质干细胞表达核因子κB受体激活剂配体,相反骨保护蛋白表达明显受抑.结论:多发性骨髓瘤细胞抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化及上调骨髓间充质干细胞表达核因子κB受体激活剂配体,抑制骨保护蛋白的表达可能是多发性骨髓瘤患者骨病发病的主要原因.
作者：胡晓丽；冯磊；张晓慧；张建华；李炳宗；傅晋翔 刊期： 2007年第46期
目的:了解伊马替尼对慢性粒细胞性白血病患者体内BCR/ABL融合基因阳性的原始及定向白血病干/祖细胞分化及增殖的影响,从而更深入阐明部分慢性粒细胞性白血病患者在经历一段血液学甚至是细胞遗传学水平上的完全缓解后复发及对伊马替尼耐药的机制.方法:实验于2006-09/2007-06在河南省血液病研究所完成.①对象:选取10例慢性粒细胞白血病患者,患者对治疗及实验知情同意.实验经医学伦理委员会批准.实验过程中应用的伊马替尼为Novartis公司产品,批号B-1701-0001-000005;氟波酯为淅川制药公司产品,批号030321495.②实验方法:抽取慢性粒细胞性白血病患者骨髓10 mL,分离得到具有血液血管干细胞特性、BCR/ABL融合基因阳性的Flk1+CD31-CD34-细胞.以诱导造血集落的前48 h,96 h,120 h内培养体系中含5μmol/L伊马替尼分别作为伊马替尼1,2,3组,设立空白对照,均体外培养18 d,检测伊马替尼对造血集落培养基中的未分化及处于分化阶段的BCR/ABL融合基因阳性Flk1+CD31-CD34-细胞的增殖抑制作用.采用流式细胞术将BCR/ABL融合基因阳性Flk1+CD31-CD34-细胞分为3个亚群,即G0期、G1期及S/G2+M期,分别评估氟波酯、伊马替尼、氟波酯联合伊马替尼对3个亚群细胞的体外增殖及凋亡的影响.结果:①伊马替尼对处于分化阶段BCR/ABL融合基因阳性Flk1+CD31-CD34-细胞增殖及向血管内皮细胞分化的影响:与空白对照组比较,伊马替尼1组每1000个BCR/ABL融合基因阳性Flk1+CD31-CD34-细胞产生的粒-单系祖细胞集落数、红系爆式集落数无明显变化(P＞0.05),伊马替尼2,3组两种造血集落数均显著降低(P＜0.05).在内皮诱导体系中与空白对照组比较,伊马替尼3组CD31+/vWF+细胞出现率明显降低(P＜0.05),且分化形成血管样结构的时间延迟.②伊马替尼诱导BCR/ABL融合基因阳性Flk1+CD31-CD34-细胞及其分化细胞凋亡的比较:5 μmol/L伊马替尼作用48 h后,BCR/ABL融合基因阳性Flk1+CD31-CD34-细胞凋亡数量明显低于其分化的造血、血管内皮细胞(P＜0.05).③氟波酯联合伊马替尼对白血病干细胞体外分化及凋亡的影响:氟波酯联合伊马替尼能显著诱导处于G0期的BCR/ABL融合基因阳性Flk1+CD31-CD34-细胞分化为造血细胞,同时也能显著诱导其凋亡.单独应用氟波酯或伊马替尼均对处于G0期的BCR/ABL融合基因阳性Flk1+CD31-CD34-细胞凋亡无明显影响,进入G1期及S/G2+M期后有一定的促凋亡作用.结论:①临床所观察到的慢性粒细胞性白血病患者在运用伊马替尼一段时间后出现正常的造血恢复现象,可能仅仅是因为伊马替尼清除了定向恶性白血病祖细胞的增殖.②氟波酯联合伊马替尼可有效诱导原始白血病干细胞的分化及凋亡.
作者：房佰俊；宋永平；林全德；张艳莉；魏旭东 刊期： 2007年第46期
目的:家族性肌萎缩侧索硬化症转基因大鼠模型的鉴定及生物学特性的检测.方法:实验于2006-06/12在北京市虹天济神经科学研究院完成.从国外购来mSOD1转基因的肌萎缩侧索硬化症大鼠模型及其野生型进行繁殖扩增;PCR筛选mSOD1基因阳性鼠作为实验观察对象;观察其行为学变化、绘制生长曲线;记录神经传导速度及肌电情况;苏木精-伊红染色法观察股二头肌标本病理学变化;尼氏染色法进行中枢神经系统的神经元计数.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.结果:繁殖并扩增了肌萎缩侧索硬化症模型的种群;PCR法成功筛选出了mSOD1基因的阳性鼠,mSOD1阳性鼠在生长过程中逐渐出现四肢运动障碍、体质量急剧降低且很快死亡;发病鼠神经传导速度减慢、肌电显示出自发的纤颤电位;肌纤维发生萎缩;中枢神经系统的神经元丢失明显且有部分神经元发生空泡样变.结论:mSOD1转基因阳性的肌萎缩侧索硬化症模型大鼠可表现出与人类疾病的相似症状,生物学各项指标变化明显,是理想的肌萎缩侧索硬化症研究模型.
作者：包建玲；黄红云；刘彦；王洪美；王援朝；刘佳；曹敬丽；方明俊 刊期： 2007年第46期
目的:血红蛋白γ链包括Gγ和Aγ,基因图谱分析发现新生儿常有γ链基因的异常.实验测定延边朝鲜族新生儿血红蛋白Gγ/(Gγ+Aγ)比值,对于研究人类遗传变异和基因调节具有重要意义.方法:实验于2005-12/2007-04在延边大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学教研室完成.①材料来源:97例朝鲜族新生儿脐带血由延边大学医院妇产科产室提供,产妇均签署知情同意书.②实验方法:新生儿脐带血取样后立即冷冻于液氮之中,EDTA-Na2抗凝,进行血红蛋白解链,每500μL脐带血与0.9%的NaCl溶液1 000μL相混合稀释,离心去上清,分离血红蛋白.用酸性聚丙烯酰胺以凝胶电泳法分离血红蛋白中的Gγ和Aγ肽链,电压200 V,电泳50 min,电泳方向为正极到负极.电泳后凝胶用丽春红2R染色,乙酸脱色致本底无色.用UVP扫描凝胶成像分析系统对凝胶板上的Gγ和Aγ肽链进行扫描定量,测定血红蛋白中Gγ/(Gγ+Aγ)比值.结果:朝鲜族新生儿脐带血中的血红蛋白Gγ/(Gγ+Aγ)比值分布情况:1例处于30%～48%低Gγ区,占总例数的1.03%,平均值27.60%;96例处于50%～79%中间区,占总例数的98.97%,平均值(68.40±2.90)%,明显低于相关文献报道的新疆维吾尔族、广西壮族、北京市汉族、西藏藏族新生儿Gγ/(Gγ+Aγ)的整体均值(75.4±2.50)%,差异有显著性意义(P＜0.05);未发现＞80%高Gγ区者.结论:延边朝鲜族新生儿血红蛋白Gγ/(Gγ+Aγ)比值多分布于50%～79%中间区,其平均值与其他民族比较相对较低.
作者：李天洙；张学武；柳明洙 刊期： 2007年第46期
背景:脐血因所含的有核细胞数量有限,主要应用于儿童患者,近年来,人们尝试将两份脐血混合输入,用于成人血液系统疾病的治疗.目的:定量监测双份异基因脐血用于成人白血病患者移植后两份脐血的植入状态、嵌合体类型、相对数量的动态变化及演变规律.设计:以脐血干细胞移植的供受者为观察对象,供受者移植前及受者移植后不同时间段的系列血样提取DNA作为检测标本,短串联重复序列遗传位点为观察指标.单位:深圳市血液中心输血医学研究所免疫遗传重点实验室.对象:纳入2005-06在北京大学深圳医院住院治疗的急性髓细胞白血病患者,男性,43岁,体质量75 kg.首次化疗完全缓解后6个月移植两份人类白细胞抗原(HLA)各一个位点不合的非血缘脐血,脐血1有核细胞数为2.5×107 kg-1;脐血2有核细胞数为1.53×107 kg-1.脐血来源于广州脐血库.患者对治疗方案知情同意.方法:采用荧光标记复合扩增短串联重复位点嵌合体定量检测技术,对急性髓细胞白血病成人患者移植两份(脐血1有核细胞数为2.5×107 kg-1,脐血2有核细胞数为1.53×107 kg-1)HLA各一个位点不相合的异基因脐血前后的序列血样进行了9个短串联重复序列位点的检测,利用供、受者之间的差异位点定性判断脐血是否植入以及嵌合体类型;而后根据377XL DNA测序仪上荧光扫描后两供者差异基因检出峰的峰面积计算脐血植入后患者体内两份脐血的相对数量,定量分析供体细胞植入程度及演变规律.并与采用HLA差异基因对植入状态的分析结果进行对比.主要观察指标:在成人移植双份脐血后,观察患者及两供者9个位点的短串联重复序列基因在患者体内的转变过程,对植入状态进行定量及定性的描述.结果:移植后15 d两份脐血植入状态为完全双份供者嵌合体,患者体内脐血1的相对细胞数量占51.3%,脐血2占48.7%;30 d时脐血1上升为70.0%,脐血2下降为30.0%.52 d时只检测到脐血1的基因,植入状态转为完全单份供者嵌合体,有核细胞数少的一份脐血被排斥,有核细胞数多的一份长期植入.结论:荧光标记复合扩增短串联重复序列嵌合体定量检测可精确地描述两份脐血的植入程度及变化过程,为临床脐血的应用及供者的选择提供了一个准确、可靠的实验依据,证明双份HLA各一个位点不合的脐血同时用于成人的移植是可行的.
作者：李桢；邹红岩；孙革；程良红；邓志辉 刊期： 2007年第46期
目的:获得编码变形链球菌CH43变链素Ⅰ前体肽基因片段,构建Ⅰ型变链素的原核表达载体,优化表达条件.方法:实验于2004-09/2005-06在解放军第四军医大学秦都口腔医院牙体牙髓病实验室地点完成.①实验材料:streptococcus Mutan CH43菌株由Dr.P.g.Caufield惠赠.E.coliTOP10 E.coli DH5α及表达载体pProEX由秦都口腔医院牙体牙髓病实验室保存.②实验过程:厌氧条件下培养变形链球菌CH43,通过碱裂解法得到其基因组DNA.利用聚合酶链反应技术从变形链球菌CH43基因库中扩增出编码变链素Ⅰ前体肽mutA基因片段相应大小的DNA片段,将片段与pMD18-T载体连接后测序以检测序列正确性.将测序正确的Ⅰ型变链素mutA按照BamHI和HindIII酶切位点克隆人原核表达载体pProEX-HTb,将连接产物转化入Ecoli DH5α,挑出阳性克隆,以A600从0.406～1.666七个不同浓度,异丙基β-D硫代半乳糖苷(终浓度设成1.0,1.4,1.8,2.0,2.5 mmol/L 5个梯度)诱导表达重组的带有6个组氨酸标签的融合蛋白,诱导时间分别3,6,18 h.③实验评估:观察mutA片段的扩增及序列测定结果;表达载体的构建结果;融合蛋白在大肠杆菌中的表达及表达条件的优化.结果:①聚合酶链反应获得的mutA序列与GenBank报道的一致(为147 bp).②Ⅰ型变链素的mutA基因片断被成功克隆入原核表达载体pProEX-HTb中,在A600达到1.000以上,异丙基β-D硫代半乳糖苷终浓度1.2 mmol/L,30℃诱导6 h,蛋白表达量较佳,稳定可重复.结论:成功克隆变形链球菌CH43变链素Ⅰ mutA基因片段,构建表达了Ⅰ型变链素的融合蛋白.
作者：石馨；倪龙兴；田宇；牛忠英；施生根；张震芳 刊期： 2007年第46期
目的:急性冠脉综合征患者T淋巴细胞活化增殖以及细胞因子分泌增加.实验拟进一步验证阿托伐他汀干预急性冠脉综合征患者炎症细胞因子和CD4+CD28+T淋巴细胞的变化.方法:选择2006-03/2006-07在南方医科大学附属珠江医院心内科住院患者30例.患者对治疗均知情同意,并经医院伦理委员会批准.急性冠脉综合征组20例(急性心肌梗死10例,不稳定心绞痛10例),稳定性心绞痛组10例作为对照.所有患者在随访的6个月中,除按照入院前冠心病治疗常规服用阿司匹林、玻立维、硝酸酯类等药物外,加用阿托伐他汀20 mg,1次/d,持续服用到随访日期.采用ELISA检测各组患者治疗前后外周血清以及培养的外周血单个核细胞上清中肿瘤坏死因子α和干扰素-γ的水平,采用流式细胞仪检测患者治疗前后CD4+CD28+T淋巴细胞的数量.结果:30例患者均进入结果分析.阿托伐他汀治疗前后对比,急性冠脉综合征组外周血清以及培养的单个核细胞上清中肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ的水平均明显下降(P均＜0.001),而稳定性心绞痛组无明显变化(P＞0.05),急性冠脉综合征组外周血CD4+CD28+T淋巴细胞数量明显减少(P＜0.001),稳定性心绞痛组无明显变化.结论:急性冠脉综合征患者促炎症细胞因子以及外周血CD4+CD28+T淋巴细胞的数量接受阿托伐他汀干预可下调.
作者：钟文亮；李志梁；刘映峰；付强；菅颖 刊期： 2007年第46期
目的:探讨培养基中表皮生长因子与血清两者浓度一定的条件下,不同浓度的脑源性神经生长因子对成年大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的影响.方法:实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成.①材料:清洁级雄性成年SD大鼠1只,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.实验过程中应用的表皮生长因子、脑源性神经生长因子均由R&D公司提供.②实验方法:无菌条件下分离大鼠脑海马组织,剪碎后胰蛋白酶消化,过滤、离心、弃上清,加入含2%B27、20 μg/L表皮生长因子、20 μg/L碱性成纤维生长因子的DMEM/F12无血清条件培养基体外培养神经干细胞,传至第4代时利用有限稀释法进行单克隆培养,100倍镜下克隆球直径约为200μm时制备单细胞悬液,稀释后滴加于96孔板内,设立两组,全量新鲜培养基组加入刚配置未使用过的DMEM/F12无血清培养基100μL,半量条件培养基组加入上述曾用于神经干细胞培养且含有其代谢产物的1/2 DMEM/F12无血清培养基100μL.③实验评估:观察神经干细胞的单克隆培养增殖情况.对克隆球行巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色.按培养基中脑源性神经生长因子终浓度的不同将所培养细胞设立0,50,100,150,200 μg/L组,各组均加入20μg/L表皮生长因子和体积分数为0.1的胎牛血清,1周后行神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色,检测神经干细胞向神经元分化情况.结果:①神经干细胞单克隆培养结果:单克隆培养开始时神经干细胞增殖缓慢,半量条件培养基组细胞增殖速度快于全量新鲜培养基组,随着细胞数的增多,两组细胞增殖速度也相应加快,分别在培养后第12天、第15天形成直径为200μm的克隆球.②神经干细胞免疫细胞化学染色结果:单克隆培养后克隆球表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白均呈阳性表达.③各组神经干细胞分化为神经元的比例:与0 μg/L脑源性神经生长因子组比较,50,100 μg/L脑源性神经生长因子组的神经干细胞分化为神经元比例均明显增高(t=2.502～5.025,P＜0.05);而浓度为150,200 μg/L时均无明显变化(t=0.420～1.857,P＞0.05).结论:向含有B27、表皮生长因子、碱性成纤维生长因子的DMEM/F12条件培养基中加入20 μg/L表皮生长因子和体积分数为0.1胎牛血清的情况下,脑源性神经生长因子促使神经干细胞向神经元分化的较佳浓度为50 μg/L.
作者：季丽莉；佟雷；唐源远；赵久红；王振宇 刊期： 2007年第46期
目的:染色体畸变是反映电离辐射损伤的敏感指标之一.分析观察长期接触射线的石油化工工作人员染色体畸变和细胞微核率变化.方法:①选择2000-10/2007-03延安地区的石油作业人员142人,男102人,女40人;年龄25～36岁;其中从事石油化工工作10年以下共86人,10年以上者56人.另选身体健康的企业人员114人做对照,年龄20～38岁.所有受检者对检测项目均知情同意.②检测方法:采用微量全血培养法做染色体培养,常规培养法做微核测定.③评估:进行染色体畸变分析和细胞微核率分析.结果:①石油化工工作人员组(＜10年和≥10年者)染色体型畸变明显高于对照组(1.07%,1.36%,0.14%,P＜0.01).＜10年和≥10年者间差异无显著性(P＞0.05).②石油化工工作人员组(＜10年和≥10年者)微核率明显高于对照组(1.782%,2.098%,0.022%,P＜0.01).＜10年和≥10年者差异不显著(P＞0.05).结论:放射组的微核率随染色体畸变率的增高而增加,两者间存在着密切的相关性.辐射对人体造成的危害不容忽视,应加强对石油工作人员的健康防护.
作者：慕明涛；霍满鹏；刘文秀；刘俊俊；蒲力群；张静 刊期： 2007年第46期
目的:Graves病被认为是一种淋巴细胞介导的自身免疫性疾病,细胞间黏附因子1在白细胞由血液至炎症部位的趋化及免疫介导细胞信号传导中起重要作用.探讨细胞间黏附因子1与Graves病的相关性.方法:①对象:为202例中国北方汉族人,其中2004-02/12青岛市中心医院内分泌科住院或门诊初诊未治疗Graves病患者139例,同期体检健康成人63人.②分组:按Graves病发病年龄分为早发Graves病组(发病年龄＜40岁)78例和晚发Graves病组(发病年龄≥40岁)61例;健康对照组63例.所有受试者对检测项目知情同意.正常对照组与Graves病组的年龄、性别构成比差异均无显著性.③方法及评估:运用酶联免疫吸附法技术,检测各组血清游离T3,游离T4,促甲状腺素,促甲状腺素受体抗体,甲状腺球蛋白抗体,甲状腺过氧化物酶抗体,细胞间黏附因子1水平变化.结果:①与正常对照组比较,Graves病组游离T3,游离T4,超敏促甲状腺素,促甲状腺素受体抗体,甲状腺过氧化物酶抗体,甲状腺球蛋白抗体差异均有显著性(P＜0.05).②早发Graves病组和晚发Graves病组的游离T3,游离T4,超敏促甲状腺素,促甲状腺素受体抗体,甲状腺过氧化物酶抗体,甲状腺球蛋白抗体差异均无显著性(P＞0.05).③Graves病组血清细胞间黏附因子1的水平高于正常对照组(P＜0.05);晚发Graves病组血清细胞间黏附因子1的水平高于早发Graves病组(P＜0.05).结论:Graves病患者外周血中细胞间黏附因子1水平增高;且晚发患者更明显.
作者：李盈；徐海霞 刊期： 2007年第46期
目的:血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在血管再生和骨组织再生过程中起着重要的调节作用.观察hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞分泌VEGF的功能及转染后细胞的成骨活性.方法:实验于2004-07/2005-12在江苏省血液研究所国家重点实验室完成.①体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞,传代培养后以1 μg PcDNA3.1-hVEGF165:3μL阳离子脂质体Lipofectamine的比例转染,通过免疫组织化学SP方法检测转染后细胞中外源性VEGF的表达.②体外分离、培养大鼠肾微血管内皮细胞,分别加入hVEGF165基因转染48 h及1周后细胞上清、空载体转染及未转染组细胞上清,MTT法观察细胞增殖情况,以了解转染后细胞培养上清中VEGF的生物学活性.③测定在正常条件培养和成骨条件培养下,转染后细胞上清中碱性磷酸酶、骨钙素的水平.结果:①hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF蛋白.②hVEGF165基因转染48 h组大鼠肾微血管内皮细胞A值高于空载体转染及未转染组(P＜0.05),但低于hVEGF165基因转染1周组.③成骨条件培养下,基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的分泌量明显高于未转染组(P＜0.05);而在正常条件培养下,基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的表达分泌量较低.结论:①采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF,且这种生物学活性呈剂量依赖性.②在成骨条件培养下,转染hVEGF165基因后骨髓间充质干细胞的成骨能力增强.
作者：刘伯龄；张锡庆 刊期： 2007年第46期
选择36例失代偿期肝硬化患者,年龄37～59岁,患者在无菌条件下,从髂后上棘抽取骨髓100～200 mL,在体外分离纯化骨髓干细胞后,局部麻醉下经股动脉插管经肝动脉将分离的骨髓干细胞移植于肝脏.自移植后12周,25例(69.4%)患者谷丙转氨酶逐渐降低,由平均(2788.56±357.90)nkat/L降至(1077.05±440.25)nkat/L;22例(61.1%)患者总胆红素逐渐下降,由平均(151.47±25.77)μmol/L降至(69.93±18.86)μmol/L;27例(75%)患者白蛋白逐渐升高,由平均(25.17±11.79)g/L升至(30.87±12.17)g/L.在干细胞移植后凝血酶原活动度逐渐上升,由术前平均(25.89±12.67)%上升至术后12周的(50.39±19.38)%,患者凝血机制明显改善.移植后大多数患者身体状况有明显的改善;移植后12周腹水减轻的19例(52.7%),食欲改善的28例(77.7%),体力好转20例(58.3%),腹胀减轻17例(47.2%),36例干细胞移植患者未出现严重并发症.
作者：王娟；邵丽春；郭庆；孔欣；朱丹；李晓惠 刊期： 2007年第46期
目的:异基因造血干细胞移植治疗急性淋巴细胞白血病的疗效已不容置疑,在不具备异基因造血干细胞移植条件下,评价白体造血干细胞移植治疗急性淋巴细胞白血病的疗效.方法:选取1989-05/2000-07解放军总医院血液科43例急性淋巴细胞白血病患者,所有患者均同意行自体造血干细胞移植.中位年龄24.5(11～48)岁.单次移植29例,其中移植前首次完全缓解期23例,二次缓解期5例,未缓解期1例.双次移植14例,其中首次移植和第二次移植前为二次缓解期各1例,其余移植前均为首次完全缓解期.预处理方案:包括含全身放疗(26例)、全淋巴放疗(14例)与不含全身放疗的高剂量化疗方案(3例).移植后治疗:化疗长春新碱+泼尼松/6-巯基嘌呤+甲氨蝶呤方案和白细胞介素2免疫维持治疗.结果:单次自体造血干细胞移植29例5年无病存活10例,其中移植前首次完全缓解期9例,二次缓解期1例.5年无病存活率34.5%.双次移植14例5年无病存活6例,5年无病存活率为42.9%.两次移植前均为首次完全缓解期.结论:在不具备异基因造血干细胞移植条件下,可采用自体造血干细胞移植治疗急性淋巴细胞白血病,双次自体造血干细胞移植疗效较好.
作者：靖彧；于力；刘海川；楼方定；姚善谦；张伯龙；高春记；李红华；赵瑜；王全顺；薄剑；朱海燕 刊期： 2007年第46期
背景:通过体外培养人角膜缘干细胞并进行传代、建系研究可为角膜缘干细胞移植的基础与临床研究提供足够的细胞储备.目的:探讨一种体外培养人角膜缘干细胞传代、建系的方法.设计:随机对照观察.单位:赣南医学院.材料:实验于2003-06/2004-04在赣南医学院科研中心与中山大学医学院眼科医院国家重点实验室完成.新鲜人角膜缘组织块分别取自2名健康人角膜组织供体,均经过供体者知情同意.RPMI-1640(Sigma R8755,含L-谷氨酰胺),200 g/L胎牛血清(Gibco 16140-071).DMEM培养基、硫酸软骨素、人表皮生长因子购自美国Sigma公司,HEPES、DMSO购自美国Gibco公司,100%甘油购自上海运佳黄浦制药有限公司,戊二醛购自德国E.Merk公司,乙醇、盐酸、丙酮、甲醛等购自北京化学试剂公司,0.25%胰蛋白酶液购自上海新华制药厂,上述试剂均为分析纯级.方法:人角膜缘深部色素区组织块经消化后,分别在含有RPMI-1640、200 g/L胎牛血清的培养瓶与以羊膜细胞外基质为培养载体的培养皿中进行体外培养.光镜及扫描电镜观察原代及传代培养细胞的生长情况;采用台盼蓝排斥实验计算冻存细胞逐代冻存处理后的复苏率.主要观察指标:①人角膜缘干细胞体外原代及传代培养观察结果.②细胞冻存复苏率.结果:①原代培养结果:经PRMI-1640培养基中培养1 d后,倒置相差显微镜下可见培养瓶中细胞多已贴壁,均匀稀疏排列成单层并贴于培养瓶底部.②传代培养结果:传第2代时添加人表皮生长因子后,细胞分散成单层,贴壁生长旺盛.所有细胞传至第30代后形态的变异性增加明显,细胞体积明显增大,形态呈圆形或不规则圆形,密集成群.在培养液中传33代后,细胞仍然保持旺盛的分化、增殖能力,并且更适宜在羊膜细胞外基质上生长.③细胞冻存复苏率:冻存细胞的复苏率为82.2%.结论:将人角膜缘干细胞经体外培养33代并逐代冻存后初步建立了人角膜缘干细胞系,人角膜缘干细胞更适合在含有羊膜细胞外基质为底物的培养基中生长.
作者：李舒梅；罗晓婷；文道源；曾祥云；陈水亲；黄勤；胡利群 刊期： 2007年第46期
目的:目前在5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化领域中,对用于诱导的细胞代次选择不一.实验选择第2,9代骨髓间充质干细胞,观察比较经5-氮胞苷体外诱导后其各自向心肌细胞分化过程中心肌特异性肌钙蛋白cTnT和早期分化基因的表达.方法:实验于2005-07/2007-07在天津中医药大学病理三级实验室完成.①实验方法:清洁级Wistar雄性大鼠,脱颈处死后取双侧股骨、胫骨,采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞进行原代培养.去掉原代细胞瓶内的培养液,D-Hank's液冲洗去除血清,胰蛋白酶+乙二胺四乙酸消化,制备单细胞悬液,按1:3传代.用10 μmol/L的5-氮胞苷分别诱导第2,9代骨髓间充质干细胞,诱导4周,并设立未加诱导剂的阴性对照.②实验评估:倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况及形态变化;免疫组织细胞化学法检测心肌特异性肌钙蛋白cTnT的表达,胞浆出现棕黄色颗粒状物质为阳性;嵌合荧光法检测心肌早期基因NKx2.5、GATA-4、Desmin、α-actin的相对表达量.结果:①细胞形态学观察:5-氮胞苷诱导前细胞生长较快,诱导后死亡细胞较多且生长较慢.诱导后2,3,4周,第9代骨髓间充质干细胞无论在形态和细胞活力方面均优于第2代.②心肌特异性肌钙蛋白cTnT的表达:5-氮胞苷诱导4周后,第9代骨髓间充质干细胞心肌特异性肌钙蛋白cTnT阳性表达率明显高于第2代[(22.42±9.97),(11.22±5.62)%,P＜0.05],阴性对照无阳性表达.③心肌早期基因的表达:反转录-聚合酶链反应结果显示,5-氮胞苷诱导4周后,第9代骨髓间充质干细胞心肌早期基因NKx2.5、GATA-4、Desmin、α-actin的相对表达量均明显高于第2代(P＜0.05).结论:经5-氮胞苷诱导后,骨髓间充质干细胞表达心肌特异性肌钙蛋白cTnT及4种心肌早期基因,证实其能够向心肌细胞分化,且传至第9代时向心肌细胞分化的能力要强于第2代.
作者：郭茂娟；范英昌；徐秀梅；赵旭 刊期： 2007年第46期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
