学术投稿

VEGF165和VEGF165b真核表达质粒的构建和鉴定

陈静;李振宇;朱芳;陈叶珊;罗鸣

关键词:血管内皮生长因子, 基因克隆, 表达载体
摘要:目的:构建人血管内皮生长因子(VEGF)165和VEGF165b真核表达质粒,为VEGF165和VEGF165b功能研究奠定基础.方法:应用RT-PCR方法从人肺腺癌A549细胞中获得并扩增VEGF165 cDNA,双酶切后与真核表达载体pcDNA3.0连接,构建重组质粒pcDNA3.0-VEGF165,酶切、PCR及测序鉴定.以pcDNA3.0-VEGF165为模板,酶切重组的方法定点突变,获得VEGF165b cDNA全长,构建pcDNA3.0-VEGF165b,酶切、PCR和测序鉴定.将构建的VEGF165b真核表达质粒转染A549细胞,检测细胞内VEGF165b的表达变化.结果:酶切PCR和测序结果显示pcDNA3.0-VEGF165产物大小约690 bp,pcDNA3.0-VEGF165b为597 bp,两个重组质粒插入基因片段序列正确,无突变.VEGF165b转染A549细胞后,VEGF165b的表达增加.结论:成功构建了VEGF165和VEGF165b的真核表达质粒.
武汉大学学报(医学版)杂志相关文献
  • 当归补血汤对高糖条件下系膜细胞增殖及乙酰肝素酶表达的影响

    目的:研究当归补血汤对高糖条件下肾小球系膜细胞(GMC)增殖及其乙酰肝素酶(HPA)表达的影响,探讨其在糖尿病肾病(DN)防治中的意义.方法:①利用透射电镜观察各组中GMC的增殖情况;②采用免疫组织化学方法检测各组肾小球中HPA的表达.结果:高糖能明显促进肾小球GMC增殖,也相应的增加系膜细胞中HPA表达(P<0.05);而当归补血汤能够明显抑制GMC增殖和相应减少HPA在肾小球中的表达(P<0.05),且效果优于格列奇特组.结论:高糖可以加强GMC增殖及细胞中HPA表达,当归补血汤能够明显抑制GMC增殖及细胞中HPA表达,从而预防肾小球硬化的发生、发展和恶化,进而延缓DN的进展.

    作者:张贤梅;张莹雯 刊期: 2011年第05期

  • 经皮椎体后凸成形术的并发症及预防策略

    目的:分析经皮椎体后凸成形术并发症产生的原因,探讨其预防策略.方法:回顾性分析经皮椎体后凸成形术82例患者的临床资料,病变椎体胸7-骶1,骨质疏松性骨折55例,脊柱转移瘤20例,椎体血管瘤7例,所有患者均行经皮椎体后凸成形术治疗.结果:发生并发症12例,其中包括骨水泥渗漏6例,胸12腰1节段脊髓损伤1例,穿刺局部血肿2例,术后疼痛加重1例,术中球囊破裂2例.经改进穿刺技术、局部压迫、术中对症处理,10例患者临床症状消失,1例胸12腰1节段脊髓损伤患者给予开放性椎管减压、甲强龙治疗、营养神经、脱水等治疗,患者双下肢肌力恢复至Ⅰ-Ⅳ级.1例遗留顽固性腰背部疼痛.结论:经皮椎体后凸成形术出现的并发症应予以重视.掌握熟练的穿刺技术、正确判读术中影像资料、恰当的骨水泥推注技术,是避免、减少经皮椎体后凸成形术并发症的发生的有效方法.

    作者:王建平;蔡林 刊期: 2011年第05期

  • 短效曲普瑞林不同降调节方案在体外受精/卵胞浆内单精子注射中临床效果的分析

    目的:分析短效曲普瑞林不同降调节长方案在体外受精/卵胞浆内单精子注射(IVF/ICSI)中的临床效果.方法:回顾性分析采用长方案降调节行IVF/ICSI治疗的279个周期,根据短效曲普瑞林不同用法分为A、B两组.A组黄体中期开始隔日一次皮下注射曲普瑞林0.1 mg,至月经第3天(D3)根据达到降调标准与否分为A1组(达标组)和A2组(未达标组).A1组D3启用促性腺激素(Gn),A2组曲普瑞林改为0.1 mg/d继续皮下注射,直至达到降调标准后启用Gn.B组黄体中期开始每日1次皮下注射曲普瑞林0.1 mg,14d后启用Gn.比较3组的治疗效果.结果:3组曲普瑞林用量和天数均有显著统计学差异(P<0.01),A1组Gn天数多于A2、B两组(P<0.05),A1组获卵数多于B组(P<0.05),3组Gn总量、移植数、种植率、临床妊娠率均无统计学差异.结论:3种方案具有相同的临床结局,但隔日1次注射能减少曲普瑞林的用量,节约部分药费.

    作者:张文;李爱斌;奚文裕;李磊;黄伟 刊期: 2011年第05期

  • VEGF165和VEGF165b真核表达质粒的构建和鉴定

    目的:构建人血管内皮生长因子(VEGF)165和VEGF165b真核表达质粒,为VEGF165和VEGF165b功能研究奠定基础.方法:应用RT-PCR方法从人肺腺癌A549细胞中获得并扩增VEGF165 cDNA,双酶切后与真核表达载体pcDNA3.0连接,构建重组质粒pcDNA3.0-VEGF165,酶切、PCR及测序鉴定.以pcDNA3.0-VEGF165为模板,酶切重组的方法定点突变,获得VEGF165b cDNA全长,构建pcDNA3.0-VEGF165b,酶切、PCR和测序鉴定.将构建的VEGF165b真核表达质粒转染A549细胞,检测细胞内VEGF165b的表达变化.结果:酶切PCR和测序结果显示pcDNA3.0-VEGF165产物大小约690 bp,pcDNA3.0-VEGF165b为597 bp,两个重组质粒插入基因片段序列正确,无突变.VEGF165b转染A549细胞后,VEGF165b的表达增加.结论:成功构建了VEGF165和VEGF165b的真核表达质粒.

    作者:陈静;李振宇;朱芳;陈叶珊;罗鸣 刊期: 2011年第05期

  • 肠道病毒71型感染手足口病合并急性 弛缓性麻痹的临床和影像学特征

    目的:通过病例观察和文献复习探讨肠道病毒71型(EV71)感染合并急性弛缓性麻痹(AFP)的临床、影像学表现及特征.方法:报告2008-2010年中国海南EV71感染流行期间9例伴有AFP的EV71型感染手足口病患儿临床、MRI表现,并做文献复习,分析其可能机制.结果:9例患儿中,单侧肢体无力4例(其中单下肢3例,单上肢1例),双侧肢体无力3例(双下肢2例,双上肢l例),四肢无力2例,合并脑干脑炎3例.脊髓MRI示颈到圆锥髓内不同范围条形长T1长T2信号,病变集中于脊髓颈段及胸9-圆锥水平,横轴位显示脊髓双侧或单侧前角长T1长T2信号.3例合并脑干脑炎患者颅脑MRI示桥脑、延髓、中脑后部点状或模糊片状长T1、长T2信号,脊髓MRI增强扫描表现为受累脊髓前角轻度强化,同侧前根明显强化.结论:EV71型感染手足口病合并AFP损害部位常位于颈段及胸9-圆锥水平脊髓前角及前根.MRI是评价手足口病神经系统损害的有效方法,影像学表现具有相对特异性,对评估病情和判断预后有重要价值.

    作者:陈峰;刘涛;李建军;文国强 刊期: 2011年第05期

  • 汉防己甲素滴眼液对眼组织毒副作用的实验研究

    目的:探讨汉防己甲素(Tet)滴眼液对兔眼的毒副作用.方法:纯种新西兰白兔25只,雌雄各半,随机分为5组,每组5只.各组动物双眼结膜囊内分别滴入不同浓度(0.1%,0.5%,1%)的Tet滴眼液、赋形剂或生理盐水,每日4次,用药前及用药3月后对所有动物进行体重测、眼前节裂隙灯显微镜和直接检眼镜检查以及闪光视网膜电图(ERG)检查,并观察动物用药后的进食、精神、活动情况,后行组织学检查.结果:各组动物在用药期间进食、精神、活动未见明显改变;用药前后各组间体重差异无统计学意义(P>0.05)、直接检眼镜检查未见明显异常,闪光ERG检查中a、b波振幅及潜时的差异无统计学意义(P>0.05);组织切片检查未见异常;除1%Tet组的4只动物在用药初的3-4 d出现Ⅰ级眼睑、结膜反应,Ⅰ级角膜反应外,其余均未见明显异常.结论:0.1 %-1%Tet滴眼液对眼组织的毒副作用极小,临床应用安全.

    作者:李岱;孙明;李青春;林少春;吴开力 刊期: 2011年第05期

  • 两种糖皮质激素对上皮下角膜激光磨削术后角膜雾状混浊疗效的观察

    目的:探讨不同糖皮质激素对上皮下角膜激光磨削术后角膜雾状混浊的疗效、副作用以及合理用药.方法:19例(38眼)上皮下角膜激光磨削术后2-3°角膜雾状混浊患者,12例单独使用0.1%氟甲松龙滴眼液,7例加用0.1%地塞米松滴眼液治疗,0.1%氟甲松龙点眼4-6个月,0.1%地塞米松滴眼1个月.结果:角膜雾状混浊:16例完全消退,≤1 °者2例,接近4°者1例.视力:1.0-1.2者31眼,0.8者6眼,0.7者1眼.眼压:随访6-24个月,眼压正常者28眼,10只眼升高4.3-17.6 mmHg,其中联合用药者8只眼,单独用药者2只眼,对症治疗均恢复正常.结论:0.1%氟甲松龙滴眼液能有效治疗上皮下角膜激光磨削术后的角膜雾状混浊,常规用药副作用极少;0.1%地塞米松滴眼液对角膜雾状混浊并无独到的显著的作用力,而导致眼压升高的副作用明显,不宜作为屈光手术的常规用药.

    作者:党真 刊期: 2011年第05期

  • Bax和Survivin在白藜芦醇抑制人前列腺癌细胞体外增殖中的调节作用

    目的:观察白藜芦醇(Res)对人前列腺癌细胞体外增殖的抑制作用,探讨Survivin和Bax在白藜芦醇抑制前列腺癌细胞体外增殖中的调节作用.方法:采用MTT法、流式细胞仪、免疫组化SP法观察了白藜芦醇对前列腺癌PC-3细胞增殖、细胞周期和蛋白表达的影响.结果:白藜芦醇对前列腺癌PC-3细胞增殖的抑制作用明显,呈浓度和时间依赖性.白藜芦醇使前列腺癌PC-3细胞周期阻滞于G0/G1期,且Bax蛋白表达上调,同时,Survivin 蛋白表达下降,而Caspase-3活性升高.结论:白藜芦醇能抑制PC-3细胞的增殖,其机制可能是使前列腺癌PC-3细胞阻滞于G0/G1期,且Bax蛋白表达上升,同时Survivin蛋白表达下降,直接激活Caspase-3而抑制PC-3细胞的增殖.

    作者:彭伟;郑航;王行环;郑新民;吕源 刊期: 2011年第05期

  • 人类T淋巴细胞白血病耐药细胞系的建立及其生物学特性研究

    目的:建立人类多药耐药T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat/DOX并研究其生物学特性.方法:人类T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat,通过长期、单一、逐步提升药物浓度的方法建立多药耐药的白血病细胞系Jurkat/DOX.运用四氮甲基唑蓝(MTT)法检测该细胞的生长规律及其耐药谱;流式细胞术和激光共聚焦显微镜技术分析多柔比星( DOX)在细胞内的蓄积量;RT-PCR方法检测mdrl基因的表达;Western blot方法检测P-gp蛋白的表达水平.结果:经过6个月单一、小剂量、间歇给药的方法诱导的Jurkat/DOX细胞与其亲本细胞系Jurkat比较,Jurkat/DOX细胞生长速度明显延迟;Jurkat/DOX细胞除对原诱导药物DOX具有耐药性外,对其他多种抗肿瘤药物如环磷酰胺(CTX)、长春新碱(VCR)、柔红霉素(DNR)等也具有交叉耐药性.流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测发现Jurkat/DOX细胞内DOX的含量明显低于亲本细胞株.RT-PCR及Western blot结果显示mdrl基因及P-gp蛋白在Jurkat/DOX细胞中高表达.结论:成功诱导了Jurkat/DOX细胞,并且该细胞具有对多种抗肿瘤药物耐药的特性,其耐药性可能与P-gp的高表达有关.

    作者:陶娜;王红祥 刊期: 2011年第05期

  • 泛素-蛋白酶体抑制剂对大鼠肺成纤维细胞凋亡和增殖的影响

    目的:探讨泛素蛋白酶体抑制剂MG-132对大鼠肺成纤维细胞凋亡和增殖的影响,并初步探索其机制.方法:18只SD大鼠随机分成模型组(n=9)与对照组(n=9),模型组气管内一次性注入博莱霉素(5 mg/kg),对照组气管内注入等量无菌生理盐水,分别于7,28,45 d每组处死动物3只,提取成纤维细胞进行培养并用相同浓度的MG-132(1.0μmol/L)对成纤维细胞干预24 h,应用MTT比色法检测细胞增殖情况,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率,用免疫组化技术半定量观察成纤维细胞α-平滑肌动蛋白( α-SMA)和NF-κB的表达情况.①MG-132对模型组成纤维细胞的抑制和促凋亡的作用强于对照组成纤维细胞(P<0.05),其中,对7d模型组成纤维细胞的促凋亡作用强;②MG-132干预后,模型组成纤维细胞α-SMA和NF-κB的表达逐渐减少,但仍高于对照组成纤维细胞(P<0.05).结论:泛素蛋白酶体抑制剂MG-132对肺成纤维细胞有抑制和促凋亡作用,可能与减少肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化及抑制NF-κB的表达有关.

    作者:莫平征;叶燕青;韩晓 刊期: 2011年第05期

  • 肿瘤分子靶向治疗进展

    分子靶向治疗作为肿瘤治疗的新手段,以其低毒、高效等特性正成为肿瘤研究的热点.分子靶向药物包括表皮生长因子受体通路抑制剂、抗血管生成剂、环氧化酶-2抑制剂、抗CD20单克隆抗体等.大量临床应用结果表明,分子靶向药物在肿瘤治疗中具有显著疗效.本文综述了近年来肿瘤分子靶向治疗领域的进展.

    作者:张迪 刊期: 2011年第05期

  • 异体骨髓基质细胞促进引导性骨再生的实验研究

    目的:利用膜引导组织再生技术,将复合异体骨髓基质细胞(BMSCs)的明胶海棉移植于硅胶膜管内,旨在观察异体BMSCs促进膜引导骨组织再生的能力.方法:抽取大耳白兔胫骨结节及股骨转子处骨髓,经密度梯度离心,贴壁筛选,获取BMSCs并培养、扩增.36只成年新两兰兔随机分成3组,每组12只,造成双侧12 mm桡骨缺损,A组缺损区移植吸附异体BMSCs的明胶海绵,B组缺损区移植吸附自体BMSCs的明胶海绵.C组缺损区移植吸附生理盐水的明胶海绵.分别于术后第2,4,8,10周摄X线片,动态观察新生骨痂生长及骨组织愈合情况;于术后第2,4,8,10周取材进行组织学染色,观察骨缺损修复过程中的组织形态学变化;于术后第8,10周行抗弯曲负荷实验.结果:A组与B组移植区骨再生活跃,新骨增生明显,10周骨缺损完全修复,C组各时间点骨修复能力均较A、B组差.组织形态学显示A组与B组新骨形成方式及骨愈合时间两者无明显差异;但两者明显优于C组;术后第8,10周抗弯曲负荷实验表明A组与B组生物力学指标两者差异无显著性(P>0.05),但均高于C组(P<0.05).结论:异体BMSCs联合引导性骨再生技术可顺利完成骨缺损的修复,其可以成为生物工程种子细胞的理想选择.

    作者:谢江涛;陈廖斌 刊期: 2011年第05期

  • 花色苷对高糖高胰岛素培养下Müiller细胞的保护

    目的:观察高糖高胰岛素作用下Müller细胞的活性改变及花色苷对其的保护作用.方法:用50 mmol/L葡萄糖和不同浓度胰岛素处理大鼠视网膜Müller细胞24 h,分为高胰岛素组:3 kU/L胰岛素;低胰岛素组:3 U/L胰岛素;对照组:不含胰岛素.分别用121.1,22.8,0μmol/L花色苷对各组细胞进行保护.48 h后用MTT法测定Miller细胞的活性.结果:高胰岛素(3 kU/L)处理后Müller细胞活性降低(P<0.05),低胰岛素组(3 U/L)则与对照组无显著性差异(P>0.05).在低胰岛素和高胰岛素组中,经高浓度花色苷处理过的Müller细胞较未加入花色苷的Müller细胞活性提高(P<0.05),且与未经胰岛素处理的Müller细胞相比差异消失(P>0.05);而低浓度花色苷无此作用(P>0.05).结论:高浓度胰岛素在短期内可使Müller细胞的活性降低,一定浓度的花色苷可恢复高胰岛素对Müller细胞活性的改变.

    作者:胡昕倩;柯敏 刊期: 2011年第05期

  • 听神经瘤的手术切除及常见并发症分析

    目的:分析枕下乙状窦后入路切除听神经瘤术后常见并发症及相关因素.方法:对36例听神经瘤患者术后出现的并发症进行回顾性分析.结果:36例听神经瘤全切除28例,次全切除8例.术后出现听力丧失31例,面神经功能障碍18例,后组颅神经损伤4例,脑脊液漏3例,出现脑积水或原有脑积水加重2例,颅内感染1例,颅内出血1例,死亡l例.结论:听神经瘤术后听力丧失和面神经功能障碍发生率高,并发症的发生率与肿瘤的大小、囊性变及术者显微手术熟练程度相关.

    作者:王诚;卓治平;周焜;梁郸;乔志立 刊期: 2011年第05期

  • 颅内动脉瘤50例临床诊治体会

    目的:通过对50例颅内动脉瘤诊治的总结,提高对该病的认识,选择佳治疗方案和治疗时机.方法:对该组病例临床资料进行回顾性分折,对存活者进行随访和复诊,对两种术式进行影像学复查及临床总结.结果:50例颅内动脉瘤,开颅显微夹闭术34例,术后恢复良好17例,轻残6例,重残8例,死亡3例.血管内介入弹簧圈栓塞术12例,栓塞术后恢复良好6例,轻残2例,重残4例,死亡0例.保守治疗4例,致残1例,死亡3例.总计死亡6例(12%),致残13例(26%),另有植物生存4例.结论:显微手术和血管内介入治疗在治疗颅内动脉瘤的选择上,有各自的临床特点和适应证,通过对病人总体情况、影像学资料进行个体化分折,制定治疗预案,选择早期手术(3d内)和介入治疗,能有效降低死亡率和致残率,减少术后并发症的发生.

    作者:张章 刊期: 2011年第05期

  • 魔芋葡甘聚糖的物理化学性能及生理学应用

    魔芋葡甘聚糖(KGM)是一种从魔芋的根茎中提取的无定形多糖,由甘露糖和葡萄糖键接而成.KGM具有独特的流变性能和凝胶化特性,因而在功能性食品领域具有广泛应用.同时,KGM因其对消化道疾病和糖尿病具有辅助治疗功效而引入注目.本文对魔芋葡甘聚糖的生理特性和功能进行了分析和总结.

    作者:夏朝红;高山俊 刊期: 2011年第05期

  • N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V在CD133+人肺腺癌细胞中的表达和功能研究

    目的:观察N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(Mgat5)在CD133+人类肺腺癌细胞中的表达和功能.方法:采用磁珠分选(MACS)的方法从10位肺腺癌患者手术切除的肿瘤标本中分离出CD133+人类肺腺癌细胞.荧光实时定量PCR(FQRT-PCR)和Western blot检测CD133+细胞中Mgat5的表达.Mgat5特异性的siRNA转染CD133+细胞后,L型植物凝集素(L-PHA)结合实验检测细胞表面N-聚糖表达情况.体内荷瘤实验和MTT比色法分别检测敲减Mgat5后CD133+肺腺癌细胞体内外的生长情况.结果:CD133+细胞中Mgat5的mRNA和蛋白表达量分别是CD133-细胞中Mgat5的1.2倍和1.4倍.CD133+细胞转染Mgat5特异性siRNA后与L-PHA结合能力下降,敲减CD133+细胞中Mgat5的表达能够显著抑制肿瘤细胞体内和体外的生长.结论:Mgat5在CD133+细胞内高表达,抑制Mgat5的表达可明显抑制肿瘤细胞的生长.Mgat5可以作为一个新的肺腺癌治疗靶点.

    作者:周雪峰;王乐;张力;但攀;赵金平 刊期: 2011年第05期

  • 甘氨双唑钠和塞来昔布联合同步 放化疗对宫颈癌细胞的影响

    目的:探讨甘氨双唑钠和塞来昔布联合同步放化疗(顺铂10 mg/L+放疗2 Gy)对宫颈癌Siha细胞增殖的影响.方法:用不同浓度的甘氨双唑钠及塞来昔布分别处理Siha细胞24 h后,MTT法检测细胞的增殖活性,并求出无毒浓度;用两药的无毒浓度分别及同时联合同步放化疗处理Siha细胞24 h后,MTT法检测细胞的增殖活性,倒置显微镜及透射电镜观察细胞形态的改变.结果:联合组对细胞增殖的抑制作用比同步放化疗组更显著(P<0.01),且两药联合组的抑制作用强于单药联合组及同步放化疗组(P<0.01);倒置显微镜及透射电镜下两药联合组细胞呈现出凋亡形态.结论:甘氨双唑钠和塞来昔布对Siha细胞同步放化疗有增敏作用,且两药与同步放化疗联合应用有一定的协同效应.

    作者:邱娇娇;佐满珍 刊期: 2011年第05期

  • SELDI-TOF-MS联合蛋白质芯片技术在病理性近视早期诊断中的应用

    目的:运用蛋白质芯片联合表面增强激光解吸附离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术检测病理性近视患者血清蛋白质的差异改变,寻找病理性近视特异的生物标志,以期用于病理性近视的早期诊断.方法:使用CM10芯片联合SEIDI-TOF-MS技术检测9例病理性近视患者和9例健康对照人血清中蛋白质谱的改变.结果:病理性近视患者与健康人比较,发现有22个蛋白质峰表达有统计学差异(P<0.01),其中10个蛋白峰高表达,12个蛋白峰低表达,对22个差异蛋白峰进一步用遗传算法结合支持向量机模型(SVM)的方法筛选佳模型,其中M/Z为8 568.752 1,6 114.741 6,2 666.169 1,3 163.504 9,5 990.294 1,6 098.263 0,3 492.5 993,5 953.829 1,6 843.396 7,6 637.371 2,2 873.621 6的蛋白峰为区分两组的SVM模型的标志物.结论:病理性近视患者血清中差异表达的蛋白质较多,SELDI-TOF-MS联合蛋白质芯片技术有望成为病理性近视早期筛查和早期诊断的新的有效工具.

    作者:陈胜;胡艳红;祁明信;丁媛 刊期: 2011年第05期

  • 脱颗粒时间对体外受精的胚胎 质量和临床结局的影响

    目的:探讨不同的脱颗粒时间对体外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者的胚胎质量和临床结局的影响.方法:对2008年5-8月在本中心行常规IVF-ET的449例患者进行对照分析,其中实验组112例,于受精后2h脱颗粒;对照组337例,按常规受精后16-20 h脱颗粒.分别比较两组患者的受精率、卵裂率、优质胚胎率、胚胎着床率和临床妊娠率.结果:实验组的受精率和卵裂率明显高于对照组(P<0.01),实验组的优质胚胎率和着床率也高于对照组(P<0.05);两组的临床妊娠率之间差异无显著性(P>0.05).结论:IVF-ET过程中受精2h后脱颗粒可改善胚胎质量,提高胚胎着床率.

    作者:胡娟;刘群;任新玲;魏玉兰;陈雯;吴黎;章汉旺;李豫峰;朱桂金 刊期: 2011年第05期

武汉大学学报(医学版)杂志

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主办:武汉大学