王宁；韩金祥
目的构建含HBV C基因的重组逆转录病毒以用于慢性乙型肝炎的免疫治疗.方法用PCR法扩增HBV的C基因片段,定向插入逆转录病毒质粒载体pLXSN中,重组质粒用脂质体转染包装细胞PT67,G418筛选抗性细胞,用抗性细胞培养上清液中的重组病毒感染NIH3T3、EL4和鼠骨髓来源的树突状细胞(DC),用PCR检测目的基因的插入,用间接免疫荧光和流式细胞仪检测目的基因的表达,基因修饰的DC免疫C57BL/6鼠观察其诱导细胞免疫的能力.结果含HBV C基因重组质粒载体经PCR、酶切和序列分析鉴定为阳性,转染PT67后经G418筛选获得抗性细胞,抗性细胞培养上清液中含有重组逆转录病毒,病毒效价达3×105 CFU/ml,感染NIH3T3和EL4细胞后PCR鉴定含目的基因,间接免疫荧光、流式细胞仪鉴定有HBcAg表达,基因修饰后的DC免疫C57BL/6鼠能诱导特异性CTL应答.结论构建的HBV C基因重组逆转录病毒可将目的基因转移至真核细胞并得到有效表达.
作者：丁传林；姚堃；张天泰；徐江英；许琳；彭光勇 刊期： 2003年第01期
目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)的E6E7基因在细胞恶性转化中所起的作用.方法将人乳头瘤病毒(HPV)的E6E7基因克隆至腺病毒伴随病毒表达载体中,通过包装的重组病毒感染,将E6E7基因导入并整合到永生293细胞的基因组中.结果本研究成功地构建了HPV18 E6E7 AAV病毒并感染了永生293细胞,PCR/Southern杂交分析表明E6E7基因在转化细胞293TL中确有表达,转化细胞293TC和293TL具有明显的转化表型,和亲本293细胞相比,生长速度快,接触抑制消失,集落形成率提高20倍,且集落明显增大,形成时间短.结论成功地构建了HPV18 E6E7 AAV病毒,HPV18 E6E7基因可引起永生化人上皮细胞293的恶性转化.此病毒可用于感染正常上皮细胞,研究其致癌机制.
作者：岑山；滕智平；张月；沈忠英；许锦阶；杜宾；曾毅 刊期： 2003年第01期
目的研究乙型肝炎病毒preS/S蛋白对人增殖细胞核抗原(PCNA)基因启动子的激活作用.方法利用荧光素酶报告基因,用共转染方法研究该整合片段对人PCNA启动子的作用.用免疫组织化学法确定preS/S蛋白在细胞中的定位.结果在人肝细胞L02中,含有上述HBV整合片段的质粒pKSH7C-HpaⅠ能以剂量依赖方式激活PCNA启动子,使PCNA启动子活性提高0.5倍;免疫组化分析表明,其蛋白定位于细胞质中.结论 preS/S蛋白对PCNA启动子有激活作用,但作用并非直接,可能是通过细胞信号传导途径来影响PCNA活性
作者：严培军；王垒；查锡良；陆长德 刊期： 2003年第01期
目的探讨HCV核心蛋白与HBV X蛋白的协同反式激活作用.方法构建表达HCV核心蛋白的重组质粒pcDNA3.1(-)core和表达HBV X蛋白的重组质粒pcDNA3.1(-)X;转染HepG2细胞,从转录和翻译水平鉴定病毒基因的瞬时表达;与报告质粒pSV-lacZ共转染HepG2细胞,检测β-半乳糖苷酶表达活性,酶的活性反映了表达的肝炎病毒蛋白对SV40病毒早期启动子/增强子功能的影响.结果构建成HCV核心蛋白及HBV X蛋白的重组表达载体pcDNA3.1(-)core、pcDNA3.1(-)X;在HepG2细胞均能瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白;单独共转染试验中pcDNA3.1(-)core、pcDNA3.1(-)X组的β-半乳糖苷酶的表达分别是对照的4.9、3.5倍,两种质粒共同转染时酶的表达是对照的9倍;表达质粒对β-半乳糖苷酶表达的激活作用呈剂量依赖性.结论 HepG2细胞中表达的HCV核心蛋白和HBV X蛋白均具有反式激活SV40早期启动子/增强子的功能,并且两种蛋白的反式激活功能具有协同特性.本试验有助于解释HCV、HBV感染,尤其是共同感染的致病/癌机制.
作者：刘妍；成军；邵得志；王琳；钟彦伟；董菁；李克；李莉 刊期： 2003年第01期
目的研究在转录起始区域设计硫代反义寡核苷酸抑制鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBV DNA)复制的可行性.方法设计合成分别基于DHBV PreS1、PreS2、S抗原启动基因的硫代反义寡核苷酸,应用Southern blot实验和cpm计数测定其对原代鸭肝细胞中及雏鸭中感染DHBV的DHBV DNA的作用.结果在1.5 μmol/L浓度下,体外抑制率分别是61.5%,69.3%和62.4%.选取PreS1抗原基因起始区段的硫代反义寡核苷酸进行整体动物实验.每只动物每天按10 μg/g体重静脉注射一次,共给药6 d.对动物肝脏进行取样分析表明,在此剂量下,对DHBV DNA的抑制率可达87.9%.结论本实验所设计的针对转录起始区的硫代反义寡核苷酸在体内外对DHBV DNA复制均有明显抑制作用,说明了在这一区域设计硫代反义寡核苷酸的可行性.
作者：董飚；邵兴无；陶佩珍 刊期： 2003年第01期
目的建立一种能快速、简便定量分析乙型肝炎病毒(HBV)基因的方法.方法用标记有生物素的引物做PCR,使扩增产物被标记,再加入碱性磷酸酶标记的链亲和素.利用酶促显色反应信号显示待测核酸模板的含量.结果对125份两对半表现不同的血清标本检测结果为:大三阳(HBsAg、HBcAb、HBeAg阳性)标本中 64.9%(24/37)PCR定量阳性,小三阳(HBsAg、HBcAb、HBeAb阳性)标本中 34.2%(13/38)PCR定量阳性,HBsAg和HBcAb阳性标本中6.7%(1/15)定量阳性,单项核心抗体(HBcAb)阳性标本中5.9%(2/34)PCR定量阳性.结论所建立的固相酶联杂交定量方法具有操作简便、特异性强、灵敏度高、结果判断客观准确等优点,可广泛应用于临床.
作者：张权；丁静娟；缪晓辉 刊期： 2003年第01期
目的探讨博尔纳病病毒(BDV)感染在我国的流行情况及其与精神分裂症的相关性.方法在对优化表达的GST-BDV-p24融合蛋白进行特异性鉴定的基础上,通过确定融合蛋白与第一抗体、第二抗体间的佳反应条件,建立可行的检测BDV-p24特异抗体的蛋白印迹(Western-blot)方法,进而对黑龙江地区精神分裂症患者和正常人对照血清中BDV-p24特异性抗体进行了检测,并通过血清-GST蛋白吸收后Western-blot实验对阳性血清进行了确认.结果 116例精神分裂症患者中检出BDV-p24阳性血清10例,阳性检出率为8.6%,而正常人血清标本中未检出阳性.结论我国存在博尔纳病病毒的感染,博尔纳病病毒的感染可能与精神分裂症的发生有关.
作者：杨爱英；张凤民；李均辉；李桂梅；马培林；谷鸿喜；生田和良 刊期： 2003年第01期
目的确定我国是否存在普马拉(Puumala)病毒.方法从我国东北地区棕背肺标本中用RT-PCR扩增汉坦病毒S片段基因序列,对所扩增序列进行核苷酸序列测定和分析.结果从我国东北地区棕背肺标本中扩增出长度为926碱基对的cDNA片段,核苷酸序列测定证实为普马拉病毒S片段序列.与不同型别汉坦病毒代表株进行比较表明,此次发现为新的普马拉病毒株,系统发生分析结果表明,此次发现的病毒与普马拉病毒P360、K27、CG-820、CG-17株种系相近, 同源性达到99%以上.结论我国存在普马拉病毒,我国新发现的普马拉病毒核苷酸序列和俄罗斯远东地区普马拉病毒接近.
作者：刘刚；李川；扈光伟；李悦；姚来顺；陈玉庆；黄飚；任明；陈允志；关世新；于传友；那宝忠；钟向东；孙悦新；李文学；李德新 刊期： 2003年第01期
目的了解丙型肝炎病毒(HCV)2a型基因组E1 E2/NS1区序列,为进一步研究HCV包膜蛋白的生物学功能奠定基础.方法用逆转录套式PCR(RT-nPCR)从江苏省1例丙型肝炎患者血清中扩增出两条分别约770 bp、1 100 bp的片段,分别以限制性内切酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切后连入pUC19载体中,转化感受态细胞,经限制性酶切长度多态性分析(RFLP)和PCR法证实为阳性克隆后,用全自动序列分析仪测序.结果分别测得约770 bp、1 100 bp的核苷酸序列,拼接后得到的完整核苷酸序列及其编码的氨基酸序列分别与HCV-1、HC-C2、HCV-BK、HC-J6、HC-J8相应序列作比较,显示分离株HCV在核苷酸水平上与以上分离株的同源性分别为60.5%、60.1%、59.7%、87.8%、67.5%;在氨基酸水平上的同源性分别为67.3%、66.4%、65.0%、87.8%、79.0%.结论分离株(HCV-JS)与HC-J6同属2a型,但同源性有一定差异.
作者：封波；吴文漪；陈红松；陈勇；丛旭；魏来 刊期： 2003年第01期
作者： 刊期： 2003年第01期
目的建立一种多重PCR归化法并应用于对HBV、HCV平行检测.方法利用PCR反应5′端允许添加非互补序列的原理,运用内外两对引物,经过2轮扩增,使目的产物均带上共有序列,再以共有序列为引物进行扩增,实现多重扩增.比较和筛选四种核酸提取方法.运用正交优化法,优化并确定佳扩增条件.对28份血标本进行对比试验,并进行质量评价.结果归化多重PCR方法对于HBV、HCV病毒合并感染患者的诊断敏感性为83.3%,诊断特异性为70.0%,诊断指数为153.3%,诊断效率为72.2%;对HBsAg阳性患者的HBV DNA的诊断敏感性为78.6%,诊断特异性为80.0%,诊断指数为158.6%,诊断效率为79.2%.对抗-HCV阳性患者的HCV RNA的诊断敏感性为75.0%,诊断特异性为90.0%,诊断指数为165.0%,诊断效率为83.3%.结论多重PCR归化法在多基因扩增或多种病原体的同时平行检测领域具有较大应用潜力.该方法实用、准确、可靠,对HBV HCV的防治具有实际意义.
作者：王宁；韩金祥 刊期： 2003年第01期
目的验证树(鼠句)、熊猴感染人乙型肝炎(乙肝)病毒(HHBV)血清感染指征.方法用含HBV的人血清接种给233只树(鼠句),28只熊猴,每周定期采血,用不同公司生产的ELISA试剂检测接种后的动物血清感染指标.结果树(鼠句)感染HHBV后,90.0%呈急性感染,44.4%为可持续1年以上的慢性感染,33.3%持续2年2个月.熊猴感染HBV后,血清HBV标志物呈一过性.结论熊猴对HHBV并不敏感,而树(鼠句)对HHBV高度敏感,有望成为HHBV的动物模型.
作者：王树声；苏建家；张华远；李媛；张涛；王佑春；黄果勇；覃柳亮；葛宪民；于萍；李河民 刊期： 2003年第01期
为了探讨肝脏活检组织中端粒酶RNA基因 hTR表达与肝炎病毒表达的关系,及hTR与肝癌发生的关系,我们用原位杂交方法分析了70份石蜡包埋肝脏疾患组织中的hTR活性表达,及HBV HCV和HAV-IgmAb的检测结果,并与癌旁及正常组织进行比较,其中46份针吸活检肝组织:包括20份肝细胞癌,14份肝硬化,12份慢性肝炎;24份手术切除的肝细胞癌组织;2份尸解死婴肝脏组织做正常对照.
作者：卫建平；姚建宏；药锦娟；王晨；张小琴 刊期： 2003年第01期
目的探讨慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染与Ⅱ型糖尿病发病的关系.方法①对227例慢性乙型肝炎(乙型肝炎后肝硬化86例)与126例慢性丙型肝炎患者(丙型肝炎后肝硬化30例)进行病例分析研究,明确其是否合并糖尿病.②用ELISA方法对160例Ⅱ型糖尿病患者及223例体检人群进行抗HCV、HBsAg检测.结果①126例慢性丙型肝炎患者合并Ⅱ型糖尿病24例(19.05%),227例慢性乙型肝炎患者合并Ⅱ型糖尿病19例(8.37%),二者比较差异有显著性 (P<0.01),年龄及丙型肝炎为发生糖尿病的独立危险因素.②160例Ⅱ型糖尿病患者中抗HCV阳性5例(3.12%),HBsAg阳性7例(4.37%),223例体检人群抗HCV阳性0例,与糖尿病人群差异有显著性(P<0.05), HBsAg阳性12例(5.38%),与糖尿病人群差异无显著性(P>0.05).结论①慢性丙型肝炎病毒感染易合并Ⅱ型糖尿病.②Ⅱ型糖尿病患者中丙型肝炎感染率高于普通人群,提示HCV感染与糖尿病的发生有一定关系,HCV感染可能为Ⅱ型糖尿病发病因素之一.
作者：杨少奇；陈红松；蒋栋；魏来；纪立农；王宇 刊期： 2003年第01期
目的研究2001年中国新分离维多利亚(Victoria)系乙型流感病毒的抗原性及基因特性.方法鸡胚传代流感病毒,从尿囊液中提取流感病毒的RNA,进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用纯化试剂盒纯化后测序,然后用MegAlign软件进行基因种系发生树分析. 结果 B/Sichuan/63/2001和B/Zhejiang/2/2001毒株的抗原性与B/Shandong/7/97毒株间存在有差异,编码血凝素重链区基因已发生了突变并导致了HA1蛋白抗原性表位两个位点(197和199)氨基酸不同于B/Shandong/7/97毒株,基因种系发生树分析同样也证明了它们的HA1基因不同于B/Shandong/7/97病毒.然而B/Sichuan/63/2001与B/Zhejiang/2/2001毒株间无论抗原性还是HA1基因特性均很相似.结论 2001年我国人群中流行的乙型流感病毒维多利亚毒株系的抗原性已发生进一步的漂移.
作者：张烨；温乐英；王敏；郭俊峰；李梓；郭元吉 刊期： 2003年第01期
目的构建HPV 16 L1-E6、HPV16 L1-E7预防、治疗性DNA疫苗质粒.方法运用PCR大引物定点诱变法逐个突变E6、E7基因与转化作用有关的位点,PCR产物连接至pGEMT-Easy质粒,测序鉴定突变基因正确后,分别均与L1基因共同连接并至真核表达载体pVAX1,得到真核表达质粒1MpVAX1-L1E6,2MpVAX1-L1E6,1MpVAX1-L1E7,2MpVAX1-L1E7,3MpVAX1-L1E7.运用磷酸钙法将所获得的质粒转染CHO细胞,以HPV-16 L1特异性单克隆抗体进行转染细胞中L1蛋白表达的ELISA和免疫组化的检测.结果 ELISA检测显示转染各种L1-E6、L1-E7融合蛋白表达质粒的细胞提取物的P/N值均>2.1;免疫组化检测在胞质胞核可见棕黄色点状阳性产物沉积.结论所构建的L1-E6、L1-E7融合蛋白表达质粒可在体外表达L1蛋白,为今后进行DNA疫苗动物实验和临床试验研究做好准备.
作者：郑瑾；张福萍；司履生；董小平；王一理 刊期： 2003年第01期
星状病毒(Astrovirus)首次于1975年由Appleton和Higgins用电镜检测胃肠炎患儿粪便标本时发现,由于电镜下病毒颗粒呈星形,因此被Madeley和Cosgrove命名为星状病毒.对志愿者和自然感染者的研究均证实星状病毒与腹泻密切相关.世界各地均已有星状病毒感染的报道,既可散发也可以引起暴发流行,亦可引起医源性感染.与轮状病毒相似,星状病毒感染多发生在2岁以内尤其是1岁以内的婴幼儿.住院腹泻患儿中星状病毒检出率为2.5%～9.0%,目前认为星状病毒是婴幼儿病毒性胃肠炎的第二位病因,仅次于轮状病毒.此外,老年人和免疫缺陷患者也是星状病毒感染的高危人群,人类免疫缺陷病毒感染者、接受骨髓移植及联合免疫缺陷患者发生星状病毒感染均已有报道.星状病毒亦是健康成年人发生胃肠炎的病因之一[1].应用多克隆抗体和单克隆抗体,可将星状病毒划分为7个血清型(serotype)HastV-1～HastV-7,近数据库中又报道了血清型8(HastV-8).Noel等[2]将星状病毒分为7个基因型(genotype),并且证明这7个基因型与血清型的划分是一致的.
作者：刘春艳；申昆玲 刊期： 2003年第01期
目的研究我国轮状病毒流行株NSP4基因的变异特点.方法对近年来从我国不同地区获得的27份人轮状病毒流行株的NSP4基因用RT-PCR进行扩增,克隆后进行全长cDNA序列分析,并利用Clustal×1.8,TreeView32及DNAStar软件与参比株Wa、KUN、AU-1、EW及来自GenBank的OSU、SA11、Hochi、US244、Bristol株的NSP4序列进行分析比较.采用PCR分型方法对VP7血清型进行鉴定,确定轮状病毒G型与NSP4基因型的关系.结果氨基酸同源性比较表明,我国轮状病毒不同流行株NSP4之间同源性为81.7%～99.4%,据此可将27株RV NSP4分为2组,分别以Wa株和KUN株为代表,其中以Wa组为主.组内同源性分别为92.0%～99.4%和92.0%～98.9%,组内变异率分别为0～8.5%及1.2%～8.5%.两组间变异率达16.6%～21.0%.氨基酸进化树提示在Wa组内包括3个亚组.轮状病毒G血清型与NSP4基因型之间的联系不确定.结论我国流行株NSP4基因主要可分为Wa组和KUN组,在Wa组内可形成三个亚组,并且在高变区有特征性的氨基酸位点.NSP4的变异与年份有关而与地域关系不密切.
作者：王大燕；王健伟；徐倏燊；温乐英；毛宇荣；于修平；洪涛 刊期： 2003年第01期
目的研究LMP1基因C端区缺失突变在我国南方广东、广西鼻咽癌高发区的存在状况和探讨其在鼻咽癌中所起的作用.方法采用聚合酶链反应技术(PCR)扩增鼻咽癌患者鼻咽组织中LMP1基因的C末端,并对其进行了克隆和序列分析.结果 20份鼻咽癌组织标本中,有17份扩增出特异性条带,阳性率为85%,阳性个体中只有1份未发生缺失.我们选择其中的4份样品进行了克隆和序列分析,结果显示,4份样品均存在30个碱基的缺失和某些位点的单点突变.结论广东、广西鼻咽癌高发区鼻咽癌组织中LMP1基因C端区存在较高比例的碱基缺失和点突变.
作者：汤敏中；郑裕明；郭秀婵；张永利；曾毅 刊期： 2003年第01期
目的研究人肝癌细胞株HepG2体外对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)的易感性.方法慢性丙型肝炎患者的血清与HepG2共同孵育后,以逆转录-聚合酶链反应、免疫组化法、原位杂交法分别检测细胞和(或)培养上清中的HCV正、负链RNA、HCV抗原表达和HCV RNA在细胞内的定位.结果感染血清和细胞共同孵育后的第2～40天,从细胞内和培养上清中均可间断地检测出HCV正、负链HCV RNA,HCV NS3抗原在细胞内能稳定表达,原位杂交证实HCV RNA阳性物质多位于细胞质中.结论 HepG2细胞在体外不但对HCV易感,而且可以支持HCV的体外复制.
作者：宋志强；郝飞；马巧玉；王宇明 刊期： 2003年第01期
中华实验和临床病毒学杂志
主管:实验和临床病毒学杂志
主办：中国科学技术协会
