学术投稿

利用双萤光素酶报告基因系统筛选有效的siRNA

单志新;林秋雄;谭虹虹;邓春玉;刘晓颖;肖定璋;余细勇

关键词:双萤光素酶报告基因系统, RNA干扰, 荧光定量PCR, 绿色荧光蛋白
摘要:目的 建立一种利用双萤光素酶报告基因系统筛选能有效抑制目的 基因表达的小干扰RNA(siRNA)的方法.方法 以绿色荧光蛋白(GFP)基因为研究对象,构建3个候选的靶向GFP的siRNA表达质粒pSi-GFPsiRNA1、pSi-GFPsiRNA2、pSi-GFPsiRNA3和阴性对照pSi-Negative.构建拥有同一Kozak共有翻译启始序列、翻译启始密码子ATG的GFP与萤光素酶基因(LUC)的融合表达载体pGL3-GFPf.将包含3个GFPsiRNA靶序列的GFP片段插入到改建过的pGL3-promoter载体上LUC的3非翻译区(UTR),构建pGL3-GFPp.将GFP siRNA表达质粒联同内参照质粒pRL-TK分别与pGL3-GFPf、pGL3-GFPp共转化HEK293细胞.利用双萤光素酶检测试剂盒测定各组细胞中萤光素酶的活力水平,用荧光定量PCR检测各组细胞中GFP mRNA的表达水平.结果 同对照组相比,与pGL3-GFPf共转化GFP siRNA 表达质粒的各组细胞中萤火虫萤光素酶/海肾萤光素酶比值明显降低,其中GFPsiRNAl表达组中降低显著(P<0.01);定量PCR检测也显示,GFPsiRNA1表达组中GFP mRNA的表达水平降低明显(19<0.01).双萤光素酶活性检测和定量PCR结果还显示,与pGL3-GFPp共转化GFP siRNA表达质粒的各组细胞中,GFPsiRNA1抑制GFP的表达显著(P<0.01).结论 本文建立了通过双萤光素酶活性检测来筛选有效的siRNA的方法,并为进行多个基因的有效siRNA的筛选提供解决方案.
南方医科大学学报杂志相关文献
  • 海军陆战队某部610例浅部真菌病临床与病原学分析

    目的 了解海军陆战部队不同季节浅部真菌病的临床与病原学流行情况.方法 对610例浅部真菌病例进行临床诊断分类,依年度与季节进行分析;采集相应标本分别进行直接镜检、真菌培养、菌种鉴定.结果 1、该部队浅部真菌病逐年减低;2、春夏季发病率较高;3、2008年部队驻地南方春夏季气候反常,浅部真菌病显著减低.镜检阳性率为44.4%,培养阳性率为52.6%,菌种分布分别是红色毛癣菌224株(47.0%)、须癣毛癣菌49株(10.2%)、紫色毛癣菌1株(0.25%)、疣状毛癣菌1株(0.25%)、石膏样小孢子菌8株(1.7%)、犬小孢子菌7株(1.5%)、铁锈色小孢子菌2株(0.5%),絮状表皮癣菌2株(0.5%)、念珠菌与酵母样菌28株(5.8%)、马拉色菌148株(31.1%)曲霉菌与青霉菌6株(1.2%).结论 海军陆战部队浅部真菌病发生率与防治水平及气候环境有关;浅部真菌感染中,红色毛癣菌占主导地位,马拉色菌及其所致浅部真菌病逐年增多.

    作者:唐新平;纪英萍;赖展欢;周剑峰;匡丽莎;邵昌发 刊期: 2009年第08期

  • 彩色多普勒超声与钼靶X线诊断乳腺错构瘤

    目的 探讨彩色多普勒超声与钼靶X线对乳腺错构瘤的诊断价值.方法 分析97例疑是乳腺错构瘤病例,所有病例均在我院行彩色多普勒超声检查和/或钼靶X线检查,并经手术切除治疗,术后经病理检查确定病理性质.结果 彩色多普勒超声在敏感性(彩超:79.6%,钼靶:62.2%)、特异性(彩超:70.3%,钼靶:55.2%)、诊断准确率(彩超:75.6%,钼靶:59.1%)、阳性预测值(彩超:78.0%,钼靶:63.9%)和阴性预测值(彩超:72.2%,钼靶:53.3%)等方面均优于钼靶X线检查.彩色多普勒超声与钼靶X线诊断性研究的Youden指数分别为:0.50和0.17:彩色多普勒超声检查和钼靶X线的并联诊断,诊断的敏感性(88.2%)、特异性(90.5%)、诊断准确率(89.1%)、阳性预测值(93.8%)和阴性预测值(82.6%)均优于单纯彩色多普勒超声检查和钼靶X线,其Youden指数0.76.结论 彩色多普勒超声在本病的诊断中优于钼靶X线,在彩色多普勒超声和钼靶X线的并联研究中,诊断的敏感性、特异性、诊断准确率、阳性预测值和阴性预测值均有明显提高.

    作者:张建兴;沈嫱;司徒红林;高蕾;陈前军;蔡丽珊 刊期: 2009年第08期

  • GPC-3 CTL表位表达载体构建

    将重组的乙肝表面抗原(pcHBsAg)中多个CTL表位,用外源性的磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(GPC3)CTL表位序列替换,构建单拷贝和多拷贝DNA疫苗,获得不同位点的单拷贝或可同时表达多个CTL表位肽的真核表达质粒.以pcHBsAg质粒为模板,应用重叠延伸PCR扩增出含三个不同位点磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(GPC3)CTL表位EYILSLEEL(EYI)的HBsAg基因片段EYI1,及替换pcHBsAg中不同CTL表位的HBsAg基因片段EYI2、EYI3;分别将EYI1、EYI2、EYI3基因片段插入pBSSK+载体中,构建出含3拷贝EYI的pBSSK/EYI1、pBSSK/EYI2、pBSSK/EYI3载体.在此基础上,利用DNA重组技术将其分别定向插入真核表达载体pcDNA3.1+,构建表达EYI表位肽的DNA疫苗.真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,结果显示:成功构建了pcDNA.EYI1/HBsAg、pcDNA-EYI2/HBsAg、pcDNA-EYI3/HBsAg真核表达质粒,为进一步测定以GPC3基因为基础的HBsAg多肽候选疫苗提供理论、实验依据.

    作者:王文敬;黎诚耀;李明松 刊期: 2009年第08期

  • 肺型肺吸虫病1例

    1 临床资料1.1 一般资料患者,男,36岁,因反复咳嗽5月余,加重1周于2009年4月入院.

    作者:马佳;邹梦晨;刘敏;蔡绍曦 刊期: 2009年第08期

  • 静脉吸毒致三尖瓣感染性心内膜炎的外科治疗

    目的 探讨静脉吸毒所导致的三尖瓣感染性心内膜炎的临床特点及外科治疗效果.方法 回顾性分析我院近6年来接诊并接受外科治疗的10例静脉吸毒所致三尖瓣感染性心内膜炎患者的临床表现、手术方法及预后,并对其临床特点、手术时机选择、人工瓣膜选择及手术技巧进行讨论.结果 所有患者均接受三尖瓣置换术,所选择均为双叶机械瓣,所有患者均痊愈出院,无手术并发症发生.结论 三尖瓣置换是治疗三尖瓣感染性心内膜炎的有效手段,选择合适的手术时机、充分的术前准备及必要的手术技巧有助于手术成功.

    作者:张振;王武军;王振康 刊期: 2009年第08期

  • 体感诱发电位潜伏期结合脑电频谱分析评定脑梗死预后

    目的 利用体感诱发电位(SEPs)潜伏期和脑电频谱分析为脑梗死预后提供客观可行的评定指标.方法 选择脑梗死致肢体运动障碍或感觉障碍的患者为研究对象,分别在发病72 h内和疗程结束(14 d)时测定脑电图、SEPs.结果 (1)脑梗死患者在发病72 h和疗程结束时SEPs潜伏期的差异具有统计学意义.(2)脑梗死患者在发病72 h和疗程结束时SEPs潜伏期的差异与神经功能缺损评分有相关性.(3)脑梗死患者在发病72 h和疗程结束时SEPs潜伏期的差异与脑电频谱分析中慢波相对功率谱比值有相关性.结论 (1)SEPs潜伏期的变化对脑梗死患者的预后可提供客观肯定的评定参数.(2)SEPs潜伏期的变化与脑电频谱分析结合有望为脑梗死预后提供定量分析的实验数据.

    作者:肖丽萍;康志新;吴宝水;孙志华;佟翠梅 刊期: 2009年第08期

  • 白藜芦醇苷在Beagle犬体内的药代动力学研究

    目的 建立测定血浆中自藜芦醇苷的方法,并对其在Beagle犬体内的药代动力学进行研究.方法 采用Hypersil-BDS C18色谱柱;流动相为甲醇-水(35:65),流速1.0 ml/min;紫外检测波长为290 nm,柱温25℃.用非室模型计算药代动力学参数.结果 白藜芦醇苷在0.21~21.0μg/ml浓度范围内,其线性良好,r=0.9995(n=5),低检测浓度约为0.1μg/ml.平均回收率达到90%以上,RSD值低于8.0%.其主要药代动力学参数在3个剂量组的T_(1/2)分别为89.95±19.96 min,152.15±55.82 min,202.36±66.75 min,AUCO-∞分别为300.14±51.33μg·min/ml,751.72±173.97μg·min/ml和1521.12±310.02μg·min/ml.结论 用本法测定血浆中自藜芦醇苷,结果满意,白藜芦醇苷在体内符合二室模型.

    作者:蔡茁;俞发;马安德;杨雪梅 刊期: 2009年第08期

  • 新类风湿因子检测阈值诊断早期类风湿关节炎及其应用价值

    目的 确定类风湿因子(RF)诊断早期类风湿性关节炎(RA)的新检测阈值,结合 anti-CCP、AKA等抗体检测提高诊断效率.方法 252例(早期RA 129例、其他自身免疫性疾病83例及正常对照40例)血清用速率散射比浊法检测RF、ELlSA方法检测CCP抗体,间接免疫荧光法检测AKA.利用受试者特征曲线(ROC)确定RF早期RA诊断阈值,并对RF、CCP及AKA抗体结果与患者的骨侵蚀程度进行相关性分析.结果 从ROC曲线中得到当RF对早期RA诊断阈值为40 U/ml,敏感性为33.3%,特异性为96.4%,当RF≥40 U/ml与骨侵蚀程度有一定的相关性(P<0.05).RF<40U/ml但CCP抗体阳性时与骨侵蚀程度有一定的相关性(P<0.05),RF<40 U/ml且CCP抗体阴性但AKA阳性时发生骨侵蚀的可能性大.结论 在RF关于早期RA的诊断阈值为40 U/ml时,顺序检测CCP、AKA抗体可以节约检测成本,提高检测效能.

    作者:申丽盈;王文红;张继岭;史连义;银广悦;张龙 刊期: 2009年第08期

  • 右旋松萝酸对小鼠口服急性毒性及细胞毒性的实验研究

    目的 观察右旋松萝酸的口服急性毒性,MTT方法测其细胞抑制活性.方法 建立小鼠经口急性中毒小鼠模型,观察不同剂量药物灌胃小鼠的中毒表现.测定小鼠的经口LD_(50),观察不同剂量右旋松萝酸对小鼠生存时间及存活率的影响.同时,用不同浓度的右旋松萝酸作用于体外培养的心肌成纤维细胞,MTT方法测定细胞的IC_(50),观察不同浓度药物对细胞的抑制率.结果 右旋松萝酸剂量越大,小鼠的中毒症状越明显,生存时间越短.小鼠经口LD-(50)为388mg/kg,中毒表现主要有精神萎靡,耸毛,畏寒,呼吸急促,行动迟缓,厌食等症状.体外细胞培养实验显示,右旋松萝酸对细胞增值的抑制呈剂量正相关,较大剂量对细胞有破坏作用,其对心肌成纤维细胞的IC_(50)为322 μg/ml.结论 右旋松萝酸为一种中低毒的天然化合物,中低剂量没有明显的细胞毒性.

    作者:程彦斌;魏琳琳;顾宁;司开卫;史霖;李小其;李琛;袁育康 刊期: 2009年第08期

  • 妊娠合并支气管哮喘急性发作25例临床分析

    目的 探讨妊娠合并支气管哮喘急性发作的发病特点、母婴结局及治疗方案.方法 对25例妊娠合并支气管哮喘急性发作患者的临床资料进行回顾性分析.结果 20例妊娠合并支气管轻、中度哮喘急性发作患者经吸氧、应用β受体激动剂和糖皮质激素、补液、纠正水电解质平衡等治疗后,母婴预后良好,无一例出现严重并发症;5例重度及危重哮喘急性发作患者,经吸氧、补液、纠正酸碱电解质平衡、应用β受体激动剂和糖皮质激素、抗生素、氨茶碱等药物综合治疗后,2例合并肺部感染,1 例发生呼吸性酸中毒,1 例发生呼吸性酸中毒并代谢性碱中毒,4例发生胎儿生长受限.哮喘组剖宫产率及产后出血、子痫前期发生率明显高于对照组(P<0.05),哮喘组新生儿室息、低体重儿、早产的发生率高于对照组(P<0.05).结论 妊娠合并哮喘增加母儿风险,治疗应个体化.

    作者:黄神姣;陈敦金;余艳红 刊期: 2009年第08期

  • 高温复合脂多糖应激大鼠肾组织TNF-α表达变化

    目的 探讨高温与脂多糖(LPS)复合应激大鼠肾组织TNF-α的表达特点.方法 雄性SPF级Wistar大鼠随机分为常温+生理盐水组(C组)、高温+生理盐水组(H组)、常温+LPS组(L组)、高温+LPS组(HL组).置动物于模拟气候舱,HL组、H组暴露环境干球温度(dry bulb temperature,Tdb)为(35.0±0.5)℃,L组和C组Tdb为(26+0.5)℃;HL组和L组动物经尾静脉iv LPS 10 mg/kg,H组和C组动物经尾静脉iv 9g/LNaCl 10 ml/kg.应激120 min时,免疫组织化学SABC染色法检测动物肾组织TNF-α的表达特点,并做常规病理学检查.结果 高温与LPS复合应激组肾组织TNF-α的表达显著增强,肾损伤程度加重.结论 高温与LPS复合应激造成的肾毒性与肾TNF-α表达密切相关.

    作者:左丹;周立宁;谢峰;何丹丹;梅桂萍 刊期: 2009年第08期

  • β_3-肾上腺素能受体对心力衰竭大鼠心室肌细胞内静息Ca~(2+)浓度的调控及其转导途径

    目的 观察β_3-肾上腺素能受体(β_3-AR)对心力衰竭大鼠心室肌细胞内静息Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]I)的调控及其转导途径.方法 通过结扎冠状动脉前降支制备大鼠实验性心力衰竭模型,经典酶分离法分离心肌细胞,Fluo-3/AM染色,激光共聚焦显微镜观察B_3-AR兴奋剂BRL-37344以及合用PTX(Gi抑制剂)、L-NAME(NOS抑制剂)、Methylene blue (NO抑制剂)时对心室肌细胞内静息Ca~(2+)浓度的影响及其转导途径.结果 在心力衰竭和正常对照大鼠,β_3-AR激动剂BRL37344(1 μmol/L)分别使心室肌细胞内[Ca~(2+)]I下调至用药前水平的59.4%、45.5%(P<0.05);在分别用L-NAME(10μmoI/L)、Methylene blue(10 μmol/L)、PTX(2μg/ml)阻断下,BRL37344(1μmol/L)使正常对照大鼠[Ca~(2+)]I分别下降10.1%、16.9%、15.4%,而在心力衰竭大鼠[Ca~(2+)]I分别下降16.9%、19.3%、11.7%.结论 β_3-AR激动剂可以使心室肌细胞内[Ca~(2+)]I下调,心力衰竭心肌下调程度较轻,其作用是通过PTX-NOS-NO转导.

    作者:邓义军;伍卫;方昶;黄至斌;王景峰 刊期: 2009年第08期

  • 结核毁损肺全肺切除术后并发症及危险因素分析

    目的 评估肺结核全肺切除术后并发症和危险因素.方法 1990~2008年间,94 例结核病患者接受了全肺切除术或胸膜全肺切除术,病理改变包括80例毁损肺、18例主支气管狭窄和4例同时合并有肺毁损及主支气管狭窄.行全肺切除术57例,胸膜全肺切除术33例和一侧余肺切除术4例.结果 和结论 2例患者手术后死亡.术后并发脓胸18例(包括8例支气管胸膜瘘),伤口感染5例和其他并发症6例.单变量分析显示术前脓胸、胸膜全肺切除术、过长的手术时间、年龄和术中胸腔污染是全肺切除术后脓胸发生的危险因素.本研究同时显示,术前肺功能低FEV1和手术后痰结核菌阳性是支气管胸膜瘘发生的危险因素.在多因素分析中,年龄和术前肺功能低FEV1是术后脓胸危险因素,而低术前FEV1、阳性痰液抗酸杆菌和曲菌球出现是支气管胸膜瘘时危险因素.

    作者:薛宗锡;刘健雄;游佩涛;邵铮 刊期: 2009年第08期

  • 电针治疗动眼神经麻痹32例

    目的 观察电针治疗动眼神经麻痹的临床疗效.方法 将64例患者随机分为治疗组及对照组各32例,治疗组在西药基础上加电针,主要用眼睛周围的穴位及项部穴位为主,对照组单纯用西药治疗.结果 治疗组痊愈18例(56.3%),有效14例(43.7%),总有效率为100%;对照组痊愈5例(15.6%),有效19例(59.4%),无效8例(25.0%),总有效率为75%:两组总有效率比较差异有显著意义(P<0.01).结论 电针治疗动眼神经麻痹的临床疗效显著,值得推广应用.

    作者:陈肖云;朱英;黄小珊 刊期: 2009年第08期

  • 腹腔镜辅助远端胃癌D2根治术对机体C反应蛋白及内脏蛋白的影响

    目的 探讨腹腔镜远端胃癌D2根治术对术后C反应蛋白(CRP)及血清内脏蛋白的影响.方法 将53例拟行远端胃癌根治术患者随机分为腹腔镜组(n=26)和开腹组(n=27),于术前1 d、术后第1、2、3、7天晨检测血CRP水平,于术前1 d、术后第3、7天晨检测血清内脏蛋白:白蛋白、前白蛋白、转铁蛋白、视黄醇结合蛋白的变化.结果 两组CRP在术后第1、2、3、7天均较术前明显升高(P<0.05),术后第2天达到峰值,腹腔镜组术后3d内CRP明显低于开腹组(P<0.01).两组术后血清内脏蛋白均较术前明显下降(P<0.01).术后两组各指标差异无显著性(P>0.05).结论 腹腔镜胃癌手术创伤小、炎症反应轻,有利于机体术后内脏蛋白的恢复.

    作者:邓海军;何威;余江;张策;王亚楠;李国新 刊期: 2009年第08期

  • 类风湿关节炎患者IgM-RF、IgA-RF、IgG-RF、IL-1RI、CDK2的检测及ROC评价

    目的 探讨检测外周血类风湿因子(IgM-RF、IgA-RF、IgG-RF)、白细胞介素-1受体Ⅰ型(IL-1RI)和周期素依赖性蛋白激酶2(CDK2)水平对类风湿关节炎(RA)的实验诊断价值.方法 对象包括RA患者94例,其中活动期和非活动期各47例;系统性红斑狼疮(SLE)患者40例,其中活动期和非活动期各20例;急性上呼吸道感染(AURTI)患者20例;健康体检者20名(对照组).检测所有对象外周血血清IgM-RF、IgA-RF、IgG-RF、IL-1RI(ELISA定量检测)、CDK2(时间分辨荧光免疫分析)水平.对结果进行统计分析,绘制ROC曲线,计算曲线下面积(AUC).结果 RA活动期患者组与缓解期患者组比较CDK2、IgA-RF有统计学意义(P<0.05).RA活动期与RA缓解期患者组比较、RA患者组与SLE患者组比较、RA患者组与AURTI患者组比较、RA患者组与对照组比较,AUC分别为:IgM-RF(0.561,0.814,0.799,0.888)、Igh-RF(0.596,0.678,0.729,0.850)、IgG-RF(0.614,0.718,0.692,0.791)、IL-1RJ(0.646,0.691,0.762,0.835)、CDK2(0.803,0.753,0.741,0.840).结论 IgM-RF可能对RA具有较高的诊断和鉴别诊断意义,而CDK2可能对RA分期的鉴别诊断有较高价值.

    作者:徐宁;黄宪章;许羚雁;庄俊华 刊期: 2009年第08期

  • 三通喉罩通气在肺灌洗术中的应用

    目的 探讨三通喉罩(thhree-way laryngeal mask airway,TLMA)通气在肺灌洗治疗的应用.方法 实施肺灌洗术的患者15例,年龄8~62岁,在快速诱导全麻下插入TLMA,TLMA的标准端口连接呼吸机(或麻醉机)进行机械或人工控制通气,从TLMA另一带有密封胶帽端口置人纤维支气管镜,经声门进入气管、支气管,实施肺灌洗术.记录患者麻醉前5 min时(T_0),插管前即刻(T_1),插管后即刻(T_2),插管后3 min(T_3),拔管时(T_4),拔管后3 min(T_5)的收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、心率(HR)和脉搏氧饱和度(SpO_2);记录患者通气5 min时(T_6)、通气10 min时(T_7)、通气30 min时(T_8)、通气50 min时(T_9)的潮气量(VT)、气道峰压(Ppeak)及呼气末二氧化碳分压(P_(ET)CO_2);测定T_0,T_6,T_7,T_8,T_9时间点的血气分析.记录麻醉、手术效果和过程.结果 全部15例手术顺利完成,TLMA通气不同时点血流动力学指标稳定,通气效果良好,无明显并发症.结论 TLMA用于肺灌洗术具有安全、可靠、效果满意、并发症少等优点,保证了良好的通气和氧供,提高了麻醉安全性.

    作者:杨天明;陆卫忠;韦海雷;吴才林;廖莎 刊期: 2009年第08期

  • 低成本智能瘢痕治疗仪的研制

    目的 介绍一集按摩、加压、冷疗等作用于一体的低成本智能瘢痕治疗仪.方法 采用负温度系数测温元件等,构成RC积分器测温电路;通过单片机进行温度测定、控制与显示;用低速直流电动机的振动对瘢痕部位施加压力及按摩;采用半导体制冷片进行制冷;并应用于10例深度烧伤患者,进行疗效观察.结果 和结论该治疗仪按摩、加压、冷疗功能稳定,使用安全和方便,低成本;可有效抑制人体瘢痕增生和减轻瘙痒等不适,适应于市场推广.

    作者:徐月华;李志清;房毅卓 刊期: 2009年第08期

  • 加味玉屏风颗粒对变应性接触性皮炎NF-κB表达的影响

    目的 探讨中药加味玉屏风颗粒对变应性接触性皮炎NF-κB表达的影响.方法 建立小鼠变应性接触性皮炎模型,分组给药,采用免疫组化技术对各组局部皮肤NF-κB的表达水平进行检测.结果 治疗组小鼠在NF-κB染色强度、染色面积及表达阳性率等方面与生理盐水组均存在显著性差异(P<0.05).结论 加味玉屏风颗粒可有效抑制NF-κB的表达相关.这可能是其抗变态反应的作用机制之一.

    作者:李莉;梁刘萍;后桂荣;罗仁 刊期: 2009年第08期

  • 一期后路半椎体切除短节段固定矫形术治疗小儿半椎体畸形

    目的 观察一期后路半椎体切除短节段固定矫形术治疗小儿单个半椎体畸形的早中期手术疗效.方法 对13例一期后路半椎体切除短节段固定矫形术治疗的小儿单个半椎体畸形患儿进行回顾性分析,通过术前、术后及随访时照脊柱正侧位片观察畸形矫正的程度.结果 13例患儿术后即时Cobb角0~10°,平均7°,矫形率80%.随访1~4年,平均1.5年.后一次随访时侧凸残留度数为0~15°.经X线片证实植骨均融合,内固定物无松动断裂.13 例均无脊髓和大血管损伤及感染等严重并发症发生.结论 小儿单个半椎体畸形通过一期后路半椎体切除短节段固定矫形术可获得满意的矫形效果.

    作者:刘宝荣 刊期: 2009年第08期

南方医科大学学报杂志

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