学术投稿

突变型HIF-1α慢病毒载体的构建及其在常氧条件下的抗降解作用

王彦梅;何家才;邹多宏;朱思姮

关键词:低氧诱导因子-1α, 基因突变, 慢病毒载体, 抗降解作用
摘要:目的 构建点突变型低氧诱导因子-1α(HIF-1α)慢病毒载体,并检测其在常氧条件下的抗降解作用.方法 根据人的HIF-1α基因(NM_001530),对其全长编码区序列进行如下定点突变:803位天冬酰胺突变成丙氨酸,564位脯氨酸突变成丙氨酸,402位脯氨酸突变成丙氨酸.设计并合成3对引物用以导入变异点.PCR扩增序列片段,然后将目的 基因PCR产物连接到载体pEGFP-N1上,构建真核表达载体pEGFP-N1-mutant/HIF-1α.PacI和AscI酶切鉴定后,用LR重组系统将目的 序列重组到慢病毒载体plenti6.3V5-DEST上,构建慢病毒载体Lenti-MT(突变型HIF-1α)及Lenti-WT(野生型HIF-1α).将Lenti-MT、Lenti-WT及Lenti-LacZ(对照组)转染293T细胞后,采用qPCR检测目的 基因的表达.转染后的细胞在低氧条件下(2% O2)培养48 h,然后常氧条件下培养48 h,采用Western blot检测HIF-1α蛋白在不同氧浓度条件下的表达情况.结果 与WT测序结果对比表明MT已被完成.酶切结果证明已成功构建pEGFP-N1-mutant/HIF-1α.qPCR结果显示Lenti-MT组目的 基因表达高于Lenti-WT组,且差异具有统计学意义.低氧条件下,HIF-1α在WT组和MT组中的蛋白表达差异无统计学意义.但常氧条件下培养48 h后,WT组目的 蛋白的表达显著下降,而MT组变化不大.上述结果表明MT具有明显的抗降解作用.结论 成功构建了突变型HIF-1α,慢病毒载体在常氧条件下,Lenti-MT具有显著的抗降解作用.
安徽医科大学学报杂志相关文献
  • 乙型肝炎肝硬化并发原发性肝癌的危险因素评估

    目的 评估以乙型肝炎肝硬化并发原发性肝癌的危险因素,为预防肝癌提供参考依据.方法 采用3:1病例对照研究,回顾性分析肝癌相关性危险因素.观察组为我科住院的乙型肝炎肝硬化并发原发性肝癌患者330例,对照组为同期住院的乙肝肝硬化病程≥10年的患者110例.结果 通过单因素、多因素非条件Logistic回归分析,终有5个因素进入多因素非条件Logistic回归模型,包括长期吸烟史,糖尿病,未抗病毒治疗,HBV DNA阳性,HBsAg、抗-HBe、抗-HBc伴HBV DNA同时阳性,OR值及95% CI分别为2.495(1.293~4.816)、18.167(2.261~145.950)、0.185(0.100~0.343)、1.184(1.072~1.308)、2.916(2.041~4.165).结论 乙肝肝硬化患者如伴随HBV DNA阳性,尤HBsAg、抗-HBe、抗-HBc伴HBV DNA同时阳性,长期吸烟史,糖尿病者是原发性肝癌高危人群,抗病毒治疗在一定程度上可减少此危险性.

    作者:陈萍;李江;苏菲;李家斌;程君 刊期: 2012年第10期

  • 人乳腺癌MCF-7细胞系中肿瘤干细胞的富集与鉴定

    采用无血清培养液(SFM)悬浮细胞聚球法体外培养人乳腺癌MCF-7细胞系,第5、10、15天拍照,观察干细胞球的生成.悬浮培养第5天可以开始观察到悬浮细胞球形成,细胞球形成效率为(0.6±0.5)%,第10天时细胞球形成效率为(2.4±1.2)%,比第5天时明显增多,培养第15天时细胞球形成效率达到(3.8±1.8)%,MCF-7悬浮成球细胞中侧群细胞(SP) 细胞含量为(3.9±1.4)%,高于常规培养的MCF-7贴壁细胞(1.1±0.5)%(P<0.05),采用无血清悬浮细胞聚球培养法可以从MCF-7细胞系中简便、高效地富集乳腺癌干细胞.

    作者:孙鑫;李平;张梅;张锋利;单建国 刊期: 2012年第10期

  • 异基因造血干细胞移植治疗骨髓增生异常综合征临床疗效分析

    回顾性分析异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)治疗骨髓增生异常综合征(MDS)的适应证、治疗时机、移植物的选择、移植预处理方案的选择和移植疗效.22例患者中21例获得造血重建,1例非血缘脐血移植(UCBT)未获得植入的成人患者,于非血缘脐血移植(UCBT)后38 d进行母亲HLA4/6相合的外周血联合骨髓造血干细胞移植解救治疗获得植入.22例中死亡3例,无1例复发.MDS患者何时进行Allo-HSCT需依据国际预后积分系统(IPSS )对患者分组,评分属于高危组的患者宜在疾病确诊后尽早进行移植,而低危组的患者可在其他药物治疗效果不佳的时候进行;不仅可选择血缘关系的骨髓移植(BMT)和外周血造血干细胞移植(PBSCT),也可进行非血缘人类白细胞共同抗原(HLA)不全相合的UCBT;移植预处理如采用减低强度的方案(RIC)并不影响移植效果.

    作者:皖湘;孙自敏;刘会兰;耿良权;王兴兵;丁凯阳;童娟;汤宝林;王祖贻 刊期: 2012年第10期

  • FGL2基因RNAi慢病毒载体的构建及外源性筛选与鉴定

    目的 拟构建人纤维蛋白原样蛋白2(FGL2)凝血酶原酶基因RNA干扰慢病毒载体,为调控人FGL2凝血酶原酶表达水平提供有利的工具.方法 根据人FGL2凝血酶原酶基因的mRNA序列选择4条靶序列,设计合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP 载体连接产生FGL2慢病毒载体,采用PCR及测序鉴定,应用Western blot 技术外源性筛选干扰效率高的有效靶序列.用慢病毒包装系统pGCSIL-GFP、pHelper1.0和pHelper2.0共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以系列稀释法测定病毒滴度.结果 PCR扩增和测序结果显示,人FGL2凝血酶原酶核苷酸链序列插入正确,外源性筛选确定一条干扰效率高的有效靶序列.利用筛选确定的有效靶序列,包装产生慢病毒,其浓缩病毒悬液的滴度为1×109 TU/ml.结论 证实实验成功构建了FGL2基因RNA干扰慢病毒载体.

    作者:王慧方;郑振中 刊期: 2012年第10期

  • 重组人血管内皮抑制素联合化疗治疗117例晚期恶性肿瘤

    目的 采用重组人血管内皮抑制素(恩度)联合经典化疗方案治疗临床分期Ⅲ期以上的恶性肿瘤,观察用药后的疗效及毒副作用.方法 经过病理组织切片检查确诊为恶性肿瘤的患者117例,采用恩度联合无交叉耐药的化疗药物方案治疗,联合用药2周期后评价疗效与不良反应,评估患者治疗开始到无疾病进展时间的生活质量.结果 117例患者在完成联合治疗后按照有关标准进行有效性与安全性评价,其中完全缓解12例,部分缓解30例,疾病稳定58例,疾病进展17例;客观有效率为35.8%,疾病控制率为85.4%.结论 晚期恶性肿瘤患者低下的生活质量得以改善和稳定,且恩度联合化疗使用的毒性低,值得临床上推广应用,但远期疗效仍需进一步观察.

    作者:刘梁;戈伟;唐甜;丁万军;石薇;郑永法 刊期: 2012年第10期

  • 孤立性肺结节的良恶性鉴别及外科治疗

    回顾性分析106例孤立性肺结节(SPN)患者的临床资料.对SPN的各因素与其良恶性的关系进行统计学处理,结果表明患者年龄、结节大小、结节的影像学表现和术中病灶表面脏层胸膜皱缩情况与SPN的良恶性显著相关;此外,SPN中的肺癌并非都为早期肺癌.对于可疑恶性病变者,应积极采取手术治疗.

    作者:朱峰;于在诚 刊期: 2012年第10期

  • Grim-19对宫颈癌HeLa细胞端粒酶活性及衰老的影响

    目的 重组质粒转染HeLa细胞以探讨Grim-19表达水平的变化对HeLa细胞中端粒酶活性的影响.方法 将重组质粒p3×flag-myc-cmv-24-Grim-19(简写Grim-19)通过脂质体转染至HeLa细胞,48 h后通过Western blot检测Grim-19、htert、P16、P21的表达情况,同时检测HeLa细胞衰老和端粒酶活性.结果 转染后可见flag的表达及htert的表达降低及P16、P21的表达升高,细胞衰老增加,增殖减弱及端粒酶活性的降低.结论 在子宫颈癌细胞株HeLa中Grim-19具有调控端粒酶活性和细胞衰老的作用.

    作者:杨霞;王青元;朱靖;冯定庆;朱园园;周颖;凌斌 刊期: 2012年第10期

  • 拉米夫定治疗慢性乙型肝炎发生病毒学反弹患者YMDD变异分析

    选取402例服用拉米夫定后出现乙型肝炎病毒(HBV)DNA反弹的慢性乙型肝炎 (CHB) 患者血清样品,应用荧光PCR法定性检测YMDD变异情况.402例中有309例(76.87%)检测出YMDD变异,其中120例为YVDD变异,74例为YIDD变异,115例为YVDD+YIDD联合变异;309例YMDD变异患者中同时检测出变异株与野生株占69.26%(214/309),仅检测出变异株占30.74% (95/309).另外,93例为YMDD野生型阳性.

    作者:方立庆;张振华;梁佳佳;杨玥;孙丙虎;张黄醒;赵小苗;张亚飞;李旭 刊期: 2012年第10期

  • 对氧磷酶1基因多态性与2型糖尿病视网膜病变的相关性研究

    目的 探讨对氧磷酶1(PON1)192和55位点的基因多态性与2型糖尿病视网膜病变(DR)关系.方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测184例不同程度视网膜病变的2型糖尿病(T2DM)患者和136例健康对照者(NGT) PON1 Q192R和L55M的多态性.结果 PON1Q192R基因在DR组QQ基因型及Q等位基因频率高于NDR组,差异有统计学意义(P<0.05).但NGT与T2DM比较以及非增殖期糖尿病视网膜病变(NPDR)与增殖期糖尿病视网膜病变(PDR)比较,差异无统计学意义.PON1L55M基因在各组间的分布差异无统计学意义.结论 PON1Q192R基因多态性可能与DR的发生有关,但与DR的严重程度无关,Q等位基因是DR的独立危险因素,PON1L55M基因多态性与DR无显著相关性.

    作者:郑雨钱;雷远;龚健杨;钟兴;潘天荣 刊期: 2012年第10期

  • 紫外线对IPS e.max全瓷贴面粘结剂颜色稳定性影响

    将30个瓷试件随机平均分为A(Superbond C&B化学固化粘结剂)、B(RelyXTMVeneer光固化粘结剂)、C(VariolinkⅡ双重固化粘结剂) 3组.3组的L、a、b值均随着照射时间的延长而发生变化:L值变小,a、b值变大,变化的大小程度随粘结剂种类的不同而不同.其中化学固化粘接树脂的颜色变化较大,超出了临床可接受的范围.光固化粘接树脂和双重固化粘接树脂在经过紫外光照射后虽然都会发生一定的变色,但是颜色变化都在临床允许范围内,而不易被肉眼所觉察.

    作者:唐媛媛;夏荣;边华琴 刊期: 2012年第10期

  • 大学生超重/肥胖的生命早期营养特征分析

    目的 通过回顾性调查研究,描述大学生超重/肥胖情况,探讨超重/肥胖的早期营养因素.方法 按照整群抽样的方法对合肥市某一高校大一新生进行问卷调查,获得研究对象的一般情况、出生资料及早期营养情况、饮食行为和家庭基本情况等.测量大学生的身高和体重,并计算体质指数(BMI)值.运用统计分析软件,对不同组间早期营养因素进行分析.结果 单因素回归结果显示大学生性别,出生体重,独生子女,居住地,5~6岁发育状况,11~12岁发育状况,父母亲体型、文化程度、职业等因素的大学生超重/肥胖检出率差异有统计学意义(P<0.05);多因素Logistic回归分析结果显示大学生11~12岁时的发育状况是超重/肥胖的主要危险因素.结论 11~12岁发育状况是导致大学生超重/肥胖的主要影响因素.

    作者:王缨;李李;赵奇红;韩艳萍;杜秋菊;李远碧;曹冶;博庆丽 刊期: 2012年第10期

  • 3.0T DCE-MRI与DWI对前列腺癌的诊断价值及与前列腺特异性抗原的相关性

    目的 探讨3.0T磁共振动态增强(DCE-MRI)及弥散加权成像(DWI)在前列腺癌(PCa)疾病诊断中的应用价值,以及各参数与前列腺特异性抗原(PSA)相关性分析.方法 回顾性分析行前列腺MRI检查的患者62例,所有病例均以病理学诊断为金标准,研究对象均行MR常规、DCE-MRI及DWI检查.分析前列腺增生(BPH)及PCa的DCE-MRI信号变化、时间-信号强度曲线(TIC)特征及各参数相对值、表观扩散系数(ADC)值的变化情况,并利用SPSS软件进行各参数与PSA相关性分析.结果 BPH及PCa的平均达峰时间(Tmax)、大增强斜率(MSI)及信号增强率(SER)分别为(82 903.45±26 594.31) ms vs (69 073.56±17 438.00) ms、(188.31±36.86)vs(215.69±59.66)、(109.14±13.78) vs (121.71±20.82),两者间比较差异有统计学意义(P<0.05);BPH的TIC多表现为Ⅰ型或Ⅱ型,PCa的TIC多表现Ⅲ型,两者间比较差异有统计学意义(P<0.05).BPH与PCa平均ADC值及指数化表观扩散系数(EADC)值分别为(1.0±0.24)×10-3 mm2/s vs (0.7±0.22)×10-3 mm2/s、(0.36±0.09)×10-3 mm2/s vs(0.49±0.09)×10-3 mm2/s,两者间比较差异有统计学意义(P<0.05).DCE-MRI对PCa诊断的敏感性、特异性、准确性分别为63%、89%、74%,DWI对PCa诊断的敏感性、特异性、准确性分别为77.8%、82.9%、80.7%,两种检查方法相结合诊断PCa的敏感性、特异性、准确性分别为94%、85%、94%.PSA与ADC呈明显负相关.结论 DCE-MRI及DWI对PCa有很好的诊断价值,联合应用可明显提高PCa的诊断及鉴别诊断率.ADC值有助于对PCa的生物学特性进行初步评估.

    作者:潘云雷;张辉;李祖银;周芳芳;孟晓梅 刊期: 2012年第10期

  • 重症急性胰腺炎大鼠结肠黏膜下神经节一氧化氮合酶阳性神经元及乙酰胆碱转移酶阳性神经元的改变

    目的 探讨伴有胃肠动力障碍的重症急性胰腺炎(SAP)大鼠结肠黏膜下神经节一氧化氮合酶(NOS )阳性神经元及乙酰胆碱转移酶(ChAT)阳性神经元的改变.方法 20只SD大鼠随机均分为假手术组与SAP组,用逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠的方法制作大鼠SAP模型.24 h后,测定假手术组与SAP组小肠推进比、结肠蠕动频率、粪便含水量、胰腺病理评分及结肠蠕动频率与NOS、ChAT表达比例相关性分析.制备结肠黏膜下神经节全层标本,运用免疫荧光技术观察两组黏膜下神经节,NOS阳性神经元及ChAT阳性神经元的改变.结果 与假手术组相比,SAP组结肠蠕动频率减慢(P<0.01)、小肠推进比减少(P<0.01)、粪便含水量降低(P<0.01),胰腺病理评分增高(P<0.01),其结肠黏膜下神经节中ChAT阳性神经元表达下调(43.85%±13.58% vs 16.27%±6.97%,P<0.05),但NOS阳性神经元无明显改变(22.49%±5.14% vs 24.36%±4.79%,P>0.05).相关性分析显示ChAT阳性神经元与结肠蠕动频率呈正相关(r=0.738,P<0.01).结论 SAP伴有胃肠动力障碍,其发病机制可能与ChAT阳性神经元或其他神经元的重塑有关.

    作者:林中;袁园;李小玲;程晓雯;张诚;郑清华 刊期: 2012年第10期

  • 切缘阳性的CINⅢ级患者后继治疗的选择

    目的 探讨切缘阳性的宫颈上皮内瘤变Ⅲ级(CINⅢ)患者后继治疗方式的选择,以及分析切缘阳性的影响因素对患者的重要作用.方法 比较78例非保守组与150例保守组宫颈内、外切缘阳性患者的组织病理学结果,同时,将保守组中切缘阳性患者的影响因素进行单因素和多因素分析.结果 ① 非保守组中,宫颈内外切缘阳性的患者发生残余病灶率比较差异有统计学意义(P=0.015).保守组中,宫颈外切缘阳性和宫颈内切缘阳性的患者复发率比较,差异有统计学意义(P=0.038).非保守组与保守组,宫颈外切缘阳性与宫颈内切缘阳性患者复发率比较差异有统计学意义(P=0.037).② 保守组中,单因素分析:是否绝经、宫颈外观、不同手术方式的切缘阳性率比较,差异均有统计学意义.结论 密切随访的宫颈外切缘阳性的CINⅢ患者可仅行宫颈锥切术;绝经后、宫颈病变严重程度、宫颈环形电切术(LEEP)是宫颈切缘阳性的高危因素.

    作者:程敏;赵卫东;李青;王晓丽;金夏;夏咏梅 刊期: 2012年第10期

  • 去甲二氢愈创木酸抑制骨肉瘤细胞黏附、迁移和侵袭

    目的 研究去甲二氢愈创木酸(NDGA)对骨肉瘤MG63细胞株黏附、迁移和侵袭特性的影响,并初步探讨其相关机制.方法 不同浓度的NDGA处理MG63 细胞,用CCK-8法、细胞划痕试验和Transwell小室模型分别测定其黏附力、迁移力和侵袭力,Western blot法检测MG63细胞基质金属酶(MMPs)表达量的变化.结果 NDGA明显抑制骨肉瘤MG63细胞株黏附、迁移和侵袭力(P<0.05);NDGA抑制MG63细胞的黏附、迁移和侵袭力呈剂量依赖性;Western blot检测表明MG63细胞MMP-2和MMP-9 的表达明显下调.结论 NDGA可抑制骨肉瘤MG63细胞的体外黏附,迁移和侵袭,这种抑制效应可能是通过减少骨肿瘤细胞MMP-2和MMP-9的表达来实现.

    作者:王京亮;王亮;王小开;金大地 刊期: 2012年第10期

  • 带绦虫虫种分子分类遗传标记的研究进展

    带绦虫虫种分子分类研究中,遗传标记的选择为重要.目前应用的遗传标记有:① 线粒体基因:包括线粒体细胞色素C氧化酶第1亚基基因(cox1)、细胞色素b基因(mtDNA-Cytb),线粒体-12S rRNA基因(mtDNA-12S rRNA).②核基因组中的核糖体基因:包括ITS1、ITS2基因序列以及核基因组中的组织蛋白L型半胱氨酸酶基因序列.现对不同的遗传标记的种间、种内差异性,以及在带绦虫虫种的分子分类中的适用范围进行阐述,提出带绦虫虫种鉴定和亚洲牛带绦虫虫种定位在遗传标记的使用上应该有所区别.

    作者:刘航 刊期: 2012年第10期

  • TRPM8在慢性非细菌性前列腺炎SD大鼠前列腺组织的表达

    将40只SD大鼠随机分成实验模型组和正常对照组,采用大鼠前列腺蛋白提取液与弗氏完全佐剂(FCA)建立慢性非细菌性前列腺炎(CNP)大鼠模型,荧光定量PCR检测瞬时受体电位通道M8(TRPM8)mRNA相对表达水平,比较两组间的差异.实验模型组与正常对照组SD大鼠前列腺组织内均见TRPM8 mRNA表达,分别为0.811±0.044、0.937±0.050,差异具有统计学意义(P<0.05).

    作者:刘祥鹏;梁朝朝;樊松;李林;古源 刊期: 2012年第10期

  • 血小板P-选择素与动脉粥样硬化研究进展

    血小板活化在动脉粥样硬化发生发展中起重要作用,血小板P-选择素作为血小板活化的直接标志,其参与了动脉粥样硬化的发生发展过程.现就血小板P-选择素在动脉粥样硬化启动及进展中的作用及将其作为动脉粥样硬化防治靶点的新研究进展作一综述.

    作者:潘莹 刊期: 2012年第10期

  • 实时三维超声心动图评价冠心病患者PCI术前后左室功能及收缩同步性的研究

    目的 应用实时三维超声心动图(RT-3DE)评价冠心病患者经皮冠状动脉介入(PCI)治疗术前后左室功能及收缩同步性的影响.方法 行PCI术患者38例(冠心病组)于术前、术后1周、术后3个月及28例健康者(对照组)分别行常规二维及RT-3DE检查,通过脱机软件分析得出左室舒张末容积(LVEDV)、左室收缩末容积(LVESV)、左室射血分数(LVEF)、峰值射血率(PER)、峰值充盈率(PFR)、左室16节段达到小收缩容积时间的标准差值和大差值被标准化为心动周期的百分比(Tmsvl6-SD%、Tmsvl6-Dif%).结果 与对照组相比,冠心病组术前LVEDV、LVESV、Tmsvl6-SD%、Tmsvl6-Dif%显著增加(P<0.01),LVEF、PER/EDV、PFR/EDV显著减小(P<0.01);与术前比较,患者术后LVEDV、LVESV、Tmsvl6-SD%、Tmsvl6-Dif%显著减小(P<0.05,P<0.01),LVEF、PER/EDV、PFR/EDV显著增加(P<0.05,P<0.01).牛眼图可直观的显示冠心病组术后收缩延迟和活动减弱节段明显减少.结论 冠心病患者可发生左心室重构,PCI治疗能够逆转其重构.RT-3DE能够准确评价冠心病患者PCI术前后左室功能及收缩同步性.

    作者:陈宏博;刘和俊;汪太平;史学功;金朝龙 刊期: 2012年第10期

  • 疣状胃炎胃黏膜T淋巴细胞亚群变化及其临床意义

    目的 初步检测疣状胃炎胃黏膜CD3 +、CD4 +、CD8 +T细胞的变化,并观察疣状胃炎胃黏膜超微结构改变.方法 采用免疫组化法检测疣状胃炎和慢性浅表性胃炎胃黏膜CD3 +、CD4 +、CD8 +T细胞变化,透射电子显微镜观察疣状胃炎胃黏膜超微结构;14C-呼气试验确定是否有幽门螺杆菌(HP)感染.结果 疣状胃炎较慢性浅表性胃炎CD8 +T细胞明显降低,CD4 +/CD8 +比值明显升高(P<0.05);疣状胃炎HP阳性组较HP阴性组CD3 +、CD4 +、CD8 +T细胞明显升高(P<0.01,P<0.05);疣状胃炎胃黏膜腺上皮细胞结构不同程度破坏,线粒体出现病毒颗粒.结论 疣状胃炎的发生可能与免疫功能紊乱有关,HP、病毒感染可能是导致免疫紊乱的病因.

    作者:郭春丽;丁西平;胡闻;虞文永;王巧民 刊期: 2012年第10期

安徽医科大学学报杂志

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