学术投稿

真核细胞基因组DNA的制备

汪渊;胡若磊;朱光能;张素梅;左莉;卜丽佳;朱华庆;周青;桂淑玉

关键词:真核细胞, DNA/分离和提纯
摘要:介绍本实验室常用基因组DNA的提取方法:对来源于培养的细胞或血细胞,一般采用蛋白酶K和去垢剂温和破碎的方法,而对于组织来源的细胞,还要先采用物理方法如匀浆法、超声波法、液氮破碎法等破碎细胞,再行分离.
安徽医科大学学报杂志相关文献
  • CPB心脏手术对围手术期成人和小儿血浆炎性反应介质水平影响

    目的比较心肺转流心脏手术对成人和小儿围术期患者血浆C-反应蛋白(CRP)及细胞因子TNF-α、IL-8、 IL-10水平的影响.方法将择期心脏手术患者16例分为两组,成人组(A组),小儿组(B组),每组8例.分别于全麻诱导前(基础,T0)、主动脉开放后(T1)、心肺转流停机后(T2)、术毕(T3)、术后24 h(T4)、术后48 h(T5)抽取患者中心静脉血,采用双抗体放免法定量测定TNF-α、IL-8、 IL-10的血浆水平;采用放射免疫分析法定量测定CRP血浆水平.结果组间比较A组和B组TNF-α在T0、T1、T2、T4、T5血浆浓度相比差异无显著性(P>0.05),而在T3,A组显著高于B组.CRP在T0、T1、T2、T3、T4时,A组与B组比较差异没有显著性(P>0.05);而在T5 A组血浆浓度高于B组,差异具有显著性(P<0.05).IL-8血浆浓度在T2、T3时,A组低于B组差异具有显著性(P<0.05);IL-10血浆浓度A组和B组比较,差异无显著性(P>0.05).组内比较A、B两组内TNF-α、IL-10所测血浆浓度值和T0相比差异无显著性(P>0.05).CRP在A组和B组中T4和T5均较T0升高(P<0.05);IL-8在A组和B组中T1、T2、T3、T4、T5时均较T0增高(P<0.05).结论心肺转流心脏手术所诱发的组织炎性反应小儿强于成人.

    作者:钱梅;方能新;张健;曾一平;徐志荣;夏云 刊期: 2004年第01期

  • P物质、肥大细胞与病理性瘢痕瘙痒的相关性研究

    目的探讨病理性瘢痕瘙痒与肥大细胞及P物质的相互关系.方法应用免疫组织化学方法,研究90例瘢痕组织中P物质及肥大细胞的表达,并分析其和临床瘙痒的关系.结果病理性瘢痕组织表皮层有P物质阳性染色,且P物质染色强度、肥大细胞数明显高于非增生性瘢痕及正常皮肤组织(P<0.01).以P物质染色等级分组,各组肥大细胞数差异有显著性(P<0.01).瘙痒等级计分与P物质成正相关(r=0.6018, P<0.01),以瘙痒等级计分分组,各组上网状真皮层肥大细胞数差异有显著性(P<0.01).结论病理性瘢痕瘙痒与表皮中P物质、上网状真皮层中的肥大细胞有关,其可能的机制是P物质直接刺激表皮中的初级传入游离神经末梢(nociceptor),引起上网状真皮层的肥大细胞浸润及活化.

    作者:武建潮;宁金龙;高学宏;李晓静;孟刚 刊期: 2004年第01期

  • 真核细胞基因组DNA的制备

    介绍本实验室常用基因组DNA的提取方法:对来源于培养的细胞或血细胞,一般采用蛋白酶K和去垢剂温和破碎的方法,而对于组织来源的细胞,还要先采用物理方法如匀浆法、超声波法、液氮破碎法等破碎细胞,再行分离.

    作者:汪渊;胡若磊;朱光能;张素梅;左莉;卜丽佳;朱华庆;周青;桂淑玉 刊期: 2004年第01期

  • MTRR基因多态性与2型糖尿病合并大血管病变的相关研究

    目的研究蛋氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因多态性与2型糖尿病合并大血管病变的关系.方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法对175例正常人群、240例2型糖尿病、176例2型糖尿病合并大血管病变(脑梗塞104例、合并冠心病61例、糖尿病足11例)、87例非糖尿病的大血管病变组人群MTRR的A66G进行基因分析.比较上述各组基因型和等位基因频率分布有无差异.结果 4组间等位基因频率分布差异无显著性 (P>0.05),但基因型频率分布差异有显著性 (P<0.05),其中2型糖尿病和2型糖尿病合并大血管病变组AA基因型频率低于正常人群和单纯大血管病变组(P<0.05),AG基因型频率高于正常人群和单纯大血管病变组(P<0.05).结论 MTRR A66G基因多态性可能与2型糖尿病及2型糖尿病合并大血管的发生相关,AG基因型可能是2型糖尿病、2型糖尿病合并大血管病变的危险因素,AA基因型可能是其保护因素.

    作者:邓大同;杨明功;刘树琴;王长江;左春林 刊期: 2004年第01期

  • 新生儿缺氧缺血性脑病血清酶学变化分析

    新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是新生儿窒息的常见并发症,其中中、重度HIE患儿病死率和后遗症发生率较高,在此类患儿血清中某些酶有不同程度的变化.现对HIE患儿血清酶学变化进行观察分析.

    作者:周金花;宣桂华 刊期: 2004年第01期

  • 日本血吸虫磷酸丙糖异构酶编码基因的克隆与序列测定

    目的克隆和鉴定日本血吸虫磷酸丙糖异构酶(SjTPI)编码基因,为寻找血吸虫病的候选疫苗联合应用打基础.方法设计合成引物,抽提日本血吸虫成虫总RNA,用RT-PCR法从中扩增出SjTPI基因编码序列,将其克隆入pGEM-T载体,用双酶切、以重组质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定.结果 RT-PCR法从成虫总RNA中扩增出大小为759 bp SjTPI基因编码序列,重组质粒pGEM-SjTPI经双酶切、PCR扩增,均可获得一条与RT-PCR产物一致的DNA片段,序列测定结果表明具有一个长度为759 bp的完整开放阅读框,与日本血吸虫(菲律宾株)和曼氏血吸虫磷酸丙糖异构酶核苷酸序列有高度同源性(分别为99%和88%).结论该实验成功地克隆了SjTPI编码基因,为进一步研究提供了条件.

    作者:汪学龙;沈继龙;姚涌;江宝玲;蒋作君 刊期: 2004年第01期

  • 二甲亚砜对人巨细胞病毒初次分离促进作用的实验观察

    目的观察二甲亚砜(DMSO)对人巨细胞病毒(HCMV)初次分离的影响.方法将临床收集的11例患者尿标本接种至两组人胚成纤维细胞(HF)细胞中进行HCMV分离.1组为DMSO细胞组,即在培养液中添加了终浓度为1%的DMSO;另1组为常规细胞组接种组,设为对照,不作任何处理.待细胞出现HCMV特征性细胞病变(CPE)时,通过PCR法测定HCMV DNA加以确证.结果 11例标本中,两组均有5例标本出现HCMV CPE,且标本号一致.但DMSO细胞组CPE出现时间比对照组提前约9 ~12 d.结论 DMSO对HCMV初次分离的阳性结果没影响,但可使HCMV特征性CPE的出现得以提前,加快了临床标本中HCMV的分离.

    作者:张文艳;胡勇;余莉;方草晖;类延花;金晶;吴建军;王明丽 刊期: 2004年第01期

  • 巨噬细胞金属弹力酶基因表达的研究

    巨噬细胞金属弹力酶(macrophage metalloelastase,MME)是由活化的巨噬细胞分泌的一种基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs),命名为MMP-12.它是巨噬细胞穿透基底膜和浸润组织必不可少的一种活性成分.近10年来,有关巨噬细胞金属弹力蛋白酶基因的研究在不断深入,研究领域不断扩展.现从动物实验和人类疾病二个方面综述巨噬细胞金属弹力蛋白酶基因表达的意义.

    作者:许建明;石海 刊期: 2004年第01期

  • 功能性消化不良患者血清一氧化氮水平及胃黏膜乙酰胆碱酯酶变化

    目的探讨血清一氧化氮(NO)和胃黏膜乙酰胆碱酯酶(AChE)在功能性消化不良(FD)中作用.方法对每个FD患者进行症状评分,应用免疫比色法测定60例FD患者和43例正常人血清NO水平,分析FD患者症状积分和血清NO水平相关性;根据是否感染幽门螺杆菌将60例FD患者分二组:Hp阳性FD组(FD+)和Hp阴性FD组(FD-),幽门螺杆菌感染通过14C-尿素呼气试验(14C-UBT)检测;通过组织化学法测定10例FD+患者和9例正常胃黏膜AChE分布情况.结果 FD患者NO水平较正常人显著下降(P<0.01),FD患者症状积分与血清NO水平负相关( r=-0.827,P=0.0437);FD+组与FD-组比较,血清NO水平差异无显著性(P>0.05);FD+患者胃黏膜AChE分布面积低于正常人(P<0.05).结论本研究结果提示FD发病可能与血清NO和胃黏膜AChE变化有关,Hp感染对FD患者症状影响较小.

    作者:丁西平;王志华;王巧民;殷保书;刘兰珍;卫梅枝 刊期: 2004年第01期

  • 重组人生长激素在严重烧伤治疗中的应用

    目的观察重组人生长激素对严重烧伤患者创面愈合、蛋白质代谢及预后的作用.方法严重烧伤患者36例,随机分成治疗组和对照组各18例,两组患者具有可比性.治疗组患者自术后第1天开始加用重组人生长激素(rhGH)0.2 U/(kg*d),疗程2周,对照组未用rhGH,其它治疗方法基本相同.比较两组患者一般情况、创面愈合及蛋白质代谢情况.结果与对照组相比,rhGH治疗组患者一般情况良好、体重下降减少、供皮区和植皮区创面愈合提前、伤后14 d后血浆蛋白水平明显升高(P<0.05).结论 rhGH能促进蛋白质合成、缩短创面愈合时间,从而提高大面积严重烧伤患者治愈率.

    作者:方林森;胡德林;汪昌荣;王永杰;余又新 刊期: 2004年第01期

  • 枯否细胞条件培养基及混合血清对肝星状细胞HSC-T6的刺激作用

    目的探讨枯否细胞条件培养基(KCCM)、混合的新生牛血清(NBS)和大鼠血清(RS)对肝星状细胞(HSC)增殖和胶原合成的促进作用.方法采用KCCM、单纯NBS及混合血清刺激大鼠HSC-T6细胞,用3H-TdR和3H-脯氨酸掺入法检测HSC增殖活性和胶原合成状况.结果不同刺激剂作用48 h后,HSC均体积增大,胞突增多延长,核分裂像增多.48 h的3H-TdR和96 h的3H-脯氨酸掺入明显增加.结论混合血清对HSC-T6的综合激活作用较KCCM和单纯10% NBS的作用明显,能明显促进其增殖和胶原合成,是有效的肝纤维化体外模型.

    作者:吴强;杨雁;张宵翔;薛绍礼;邹宇宏;陈敏珠 刊期: 2004年第01期

  • 自体微粒皮移植术在大面积深度烧伤MODS防治中应用

    目的探讨自体微粒皮移植术对大面积深度烧伤多器官功能障碍综合征(MODS)发生的影响.方法分析性研究收治的大面积深度烧伤患者64例,根据早期创面处理方法的不同分为切痂自体微粒皮移植术组和切痂邮票状植皮术组,两组患者的一般情况具有可比性,自体微粒皮移植术组行一次性大面积切痂自体微粒皮和大张异体皮联合移植术,切痂邮票状植皮术组分次行部分Ⅲ度创面切痂自体邮票状皮片移植术,比较两组患者脓毒症和MODS的发生率.结果自体微粒皮移植术组脓毒症和MODS的发生率分别为34.4%和18.8%,明显低于切痂邮票植皮术组的62.5%和43.8%,差异有显著性(P<0.05).结论一次性大面积切痂自体微粒皮移植术能有效降低大面积深度烧伤MODS的发生率.

    作者:胡德林;方林森;王永杰;余又新;汪昌荣 刊期: 2004年第01期

  • 山莨菪碱对血小板活化因子致肺微血管内皮细胞形态和骨架变化的影响

    目的观察血小板活化因子(PAF)对培养肺微血管内皮细胞形态、单层通透性、肌动蛋白骨架的影响及山莨菪碱的干预作用.方法 HE染色观察PAF对体外培养大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVEC)的形态影响;用针头式滤器观察PAF 对RPMVEC单层通透性的影响;用免疫细胞化学的方法观察PAF 对RPMVEC F-肌动蛋白(F-actin)分布的影响;并观察山莨菪碱干预后的变化.结果 PAF浓度大于0.1 mg/L作用48 h内观察到细胞脱落和破裂.10 mg/L PAF 120 min内可使RPMVEC单层通透性增高、F-actin解聚,山莨菪碱可抑制上述变化.结论 PAF引起RPMVEC脱落和破裂呈时间和剂量依赖性;PAF引起内皮单层通透性的增高的机制与F-actin解聚密切相关;山莨菪碱可抑制PAF引起RPMVEC细胞脱落、单层通透性增高和F-actin解聚,对PAF引起的RPMVEC损伤有一定保护作用.

    作者:王应灯;孙耕耘 刊期: 2004年第01期

  • 器官培养角膜保存法保存兔角膜的观察研究

    目的观察器官培养角膜保存法保存角膜活性的效果,探讨该方法临床应用的可行性.方法兔角膜28只,分为两组,实验组16只眼,对照组12只眼.实验组用31℃器官培养液保存,对照组用K-液4℃保存.两组中每4只角膜分别保存3、7、14 d.实验组4只角膜保存14 d后移入运输液中培养3 d.保存前测角膜厚度,做内皮细胞形态学检查和台盼蓝染色.保存后不同时间做相同检查和茜素红染色, 并用透射电镜观察角膜内皮细胞超微结构.在取出角膜前从所有保存瓶抽取保存液样本做细菌和真菌的培养. 临床应用器官培养保存1周的角膜行穿透性角膜移植术1例.结果实验组和对照组角膜内皮细胞形态、活性率1周后差异有显著性.2组角膜厚度差异有显著性.透射电镜检查, 实验组7 d和14 d角膜内皮细胞超微结构完整.对照组7 d后线粒体肿胀,14 d可见细胞结构破坏.穿透性角膜移植术临床病例随访2年,角膜移植片基本透明.结论器官培养液保存角膜的效果确切,活性保存时间明显长于K-液保存.

    作者:廖荣丰;朱美玲;刘兴华;龚健杨;陈逖 刊期: 2004年第01期

  • 幼兔灌肠与肠道细菌移位关系的实验研究

    目的了解经肛门途径清洁灌肠及经口服途径全肠道灌洗对幼龄兔肠黏膜屏障功能及细菌移位的影响,以期选择更为安全的方法;并对灌肠后细菌及内毒素移位的机制进行探讨.方法选用幼龄兔30只,随机分成3组,每组10只,分别为经肛灌肠组(A),经口全肠道灌洗组(B)及空白对照组(C).依次取肠系膜淋巴结(MLN)、肝、脾、肺匀浆,并抽取门静脉血液、胆汁,分别行细菌培养及药敏实验,并行血浆内毒素测定.结果口服清肠组及灌肠组与对照组三者之间差异均有显著性(P<0.05).结论灌肠组和口服清肠液组,都可明显地引起肠道细菌移位,而灌肠组较口服清肠液组更为明显.

    作者:王忠荣;张敬杰;徐兵;李巍松;孔祥;苏义林;吴圣军;孙华;王德生;卜跃晨;陈多炎;陈柯;胡闻 刊期: 2004年第01期

  • 氨甲喋呤单次肌注与米非司酮联合应用治疗异位妊娠

    目的探讨氨甲喋呤(MTX)单次肌肉注射与米非司酮联合应用治疗异位妊娠.方法观察组MTX 50 mg肌注1次,米非司酮75 mg Bid口服×3~4 d,对照组MTX 20 mg肌注Qd×5 d,两组均同时给予中药宫外孕一号方口服.结果 MTX单次肌肉注射与米非司酮联合治疗成功率为90.77%,明显高于对照组,β-HCG下降速度及幅度明显高于对照组且副反应明显减少.结论 MTX单次肌肉注射与米非司酮联合治疗异位妊娠安全有效、副反应少.

    作者:步仰高;朱贝利 刊期: 2004年第01期

  • 苯芴酮光度法测定聚乳酸辅料中Sn残留量

    目的建立药用聚乳酸辅料的Sn含量测定方法.方法样品经硝酸-硫酸消解处理,以分光光度法测定之.显色剂为苯芴酮,测定波长为510 nm.结果线性范围为1~10μg;r=0.9997; 检出限为1~2 μg/g;方法的平均回收率为100.8%;日内RSD为5.3%.结论该方法已符合2000年中国药典关于杂质限量检测方法的规定,是检测此类辅料中Sn残留量的可行方法.

    作者:赵国琴;高永清;储成顶;俞敏;刘飞 刊期: 2004年第01期

  • 环孢素A对心肌细胞凋亡的影响

    目的探讨环孢素A治疗急性排斥反应的作用机制.方法采用Ono方法建立SD大鼠心脏移植排斥反应动物模型,将实验分为两组:对照组n=10,未进行任何治疗;环孢霉素A(CsA)组:n=20,术后1~7 d腹腔内注射CsA 10mg/(kg*d).采用ELISA法测定术后IL-2的含量,采用Tunel法检测心肌细胞凋亡,并计算凋亡指数.结果两组移植物存活时间为7.25 d±0.71 d和19.4 d±2.07 d,实验组比对照组延长12 d(P<0.01).实验组术后IL-2含量明显减少,与对照组相比较差异有显著性(P<0.05).两组中心肌细胞凋亡指数分别为2.84±1.48和0.54±0.19(P<0.0001).结论 CsA通过抑制IL-2的分泌和心肌细胞凋亡,发挥抗排斥作用.

    作者:钱叶本;陈规划;黄洁夫 刊期: 2004年第01期

  • 小鼠MME基因真核表达载体的构建与鉴定

    目的克隆小鼠巨噬细胞金属弹力酶(MME)基因结构域Ⅰ和Ⅱ,构建真核细胞表达载体,用于动物肿瘤原位种植模型的研究.方法通过PCR选择性扩增MME基因结构域Ⅰ和Ⅱ,克隆入pGEM-T载体中,限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切及PCR鉴定.结果以MME cDNA为模板进行PCR扩增的特异性片段在750 bp和1 000 bp之间.以此构建的pGEM-T-MME克隆载体和表达载体, 经限制性内切酶酶切证实载体中带有MME目的基因片段; 与小鼠MME cDNA序列的碱基符合率为99.63%; 证明MME基因已正确克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1中.结论成功构建了pcDNA3.1-MME重组质粒,奠定了转基因研究MME表达与肿瘤生长转移关系的实验基础.

    作者:许建明;石海;梅俏;汪学龙;宋育林;鲍俊俊;董钟云 刊期: 2004年第01期

  • 半肝血流阻断在肝切除术的临床应用

    目的探讨半肝血流阻断在肝切除术中的应用和疗效.方法分析17例肝脏肿瘤的临床特点,应用半肝血流阻断技术行肝段切除、半肝和扩大半肝切除,观察术中出血量和输血量、血压和血氧饱和度、手术时间和手术到出院时间以及术后肝功能恢复时间.结果术中平均出血量506.65 ml±365.25 ml,术中血压平稳,血氧饱和度98%~100%,平均手术时间304.00 min±154.18 min,手术到出院时间13.47 d±4.56 d,术后肝功能均在2周内恢复.结论半肝血流阻断切肝能有效控制肝切除术中出血,避免健侧肝脏缺血再灌注损伤,术中血压波动小,术后肝功能恢复快.不仅可应用于规则性半肝切除,亦适用于肝段切除,扩大半肝切除和前入路肝切除术.

    作者:熊奇如;耿小平 刊期: 2004年第01期

安徽医科大学学报杂志

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主办:安徽医科大学